2017—2021年成都市貓細(xì)小病毒的檢測(cè)及其VP2基因的變異分析

周 群，楊 苑，宋 鑫，何欣怡，曹 慧，張 斌,2*

(1.西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，成都 610041；2.青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用教育部/四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都 610041)

貓細(xì)小病毒(feline parvovirus, FPV)為細(xì)小病毒科、細(xì)小病毒屬的成員，是引起貓和其他貓科動(dòng)物病毒性腹瀉的主要病原體之一[1]。臨床特征表現(xiàn)為高熱、嘔吐、腹瀉、白細(xì)胞減少及出血性急性腸炎，具有高發(fā)病率和死亡率[2]。

FPV是體型最小的DNA病毒[3-4]。其基因組包含兩種蛋白：非結(jié)構(gòu)蛋白NS1和NS2，結(jié)構(gòu)蛋白VP1和VP2[4-5]。VP2是構(gòu)成FPV衣殼蛋白的主要成分，約占病毒粒子的90%[5]，決定了FPV在宿主范圍、血凝性和抗原性方面的特點(diǎn)，在病毒感染過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，常作為疫苗研發(fā)的靶抗原[3]。VP2蛋白氨基酸關(guān)鍵位點(diǎn)的突變常導(dǎo)致細(xì)小病毒感染發(fā)病機(jī)制和細(xì)胞嗜性發(fā)生改變，產(chǎn)生新的變異毒株，同時(shí)也常作為細(xì)小病毒分型的依據(jù)[6]。1965年首次從患病貓中分離出的FPV，目前已在全球范圍內(nèi)廣泛流行[7]。犬貓細(xì)小病毒密切相關(guān)，可在各自的宿主中引起疾病[7-8]。VP2蛋白是決定犬細(xì)小病毒(canine parvovirus，CPV)和FPV抗原特性、宿主范圍和受體結(jié)合的關(guān)鍵蛋白，由于CPV VP2蛋白5～6個(gè)關(guān)鍵的氨基酸發(fā)生變化，使CPV新變體毒株(CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c)獲得了新的宿主范圍，可同時(shí)感染貓和犬[6, 9-10]。

目前，商品化的FPV疫苗已在全球各國(guó)廣泛應(yīng)用，但FPV仍然在世界各國(guó)流行，并未得到有效控制[11-14]。國(guó)內(nèi)對(duì)FPV的分子流行病學(xué)相關(guān)的調(diào)查研究較少，F(xiàn)PV在四川地區(qū)的流行情況和流行毒株的分子特征尚不明確[15-16]。本研究收集了來(lái)自成都市的168份貓腹瀉糞便樣本，用PCR方法進(jìn)行FPV檢測(cè)，旨在明確成都地區(qū)FPV的流行情況及其分子特征，豐富我國(guó)FPV的流行病學(xué)資料，為研發(fā)新型有效的FPV疫苗提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料的采集 2017-2021年從成都地區(qū)3家寵物醫(yī)院采集發(fā)病貓糞便樣本168份，病貓均表現(xiàn)為腹瀉、嘔吐、食欲廢絕和雙相熱等臨床癥狀。采樣并記錄發(fā)病貓的性別和年齡等信息(表1)，將獲得的糞便樣本加入病毒保存液中，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 樣本信息及FPV檢出情況

1.1.2 主要試劑與儀器 Quick Taq Hs DyeMix購(gòu)自東洋紡(上海)生物科技有限公司；STE緩沖液、蛋白激酶K、DL2000 DNA Marker購(gòu)自TaKaRa生物技術(shù)有限公司；E.coliDH5α購(gòu)自北京天根生化科技有限公司；PCR核酸擴(kuò)增儀購(gòu)自Bio-Red有限公司。

1.1.3 引物 參考相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[17]，合成用于FPV檢測(cè)的引物FPV-F：GGATGGGTGGAAATCACAGC，F(xiàn)PV-R：ATAACCAACCTCAGCTGGTC。用于FPV VP2基因全基因組擴(kuò)增的引物VP2-F：TTTGAATTCATGAGTGATGGAGCAGTT，VP2-R：GGGCTCGAGTTAATATAATTTTCTAGG。擴(kuò)增片段分別長(zhǎng)度為845和1 755 bp。以上引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 貓糞便樣本總DNA的提取 采用酚-氯仿法分別提取貓糞便樣本中的總DNA，提取完成后置于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 FPV的檢測(cè)與VP2全基因組擴(kuò)增 利用FPV檢測(cè)引物[17]對(duì)本實(shí)驗(yàn)室保存的FPV陽(yáng)性樣本DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物純化后與pMD19-T載體連接，轉(zhuǎn)化到E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選陽(yáng)性重組質(zhì)粒由上海生工生物有限公司雙向測(cè)序，將測(cè)序成功的陽(yáng)性質(zhì)粒10倍倍比稀釋至10-4后保存?zhèn)溆?。?68份樣本的DNA為模板，使用Quick Taq Hs DyeMix進(jìn)行FPV的檢測(cè)和VP2全長(zhǎng)的擴(kuò)增，具體操作步驟參照說(shuō)明書進(jìn)行，每次PCR均設(shè)立陰、陽(yáng)性對(duì)照。PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆和轉(zhuǎn)化后送生工生物有限公司雙向測(cè)序，獲得FPVVP2基因全長(zhǎng)序列。

1.2.3 細(xì)小病毒VP2基因遺傳進(jìn)化分析 將本研究獲得的細(xì)小病毒VP2基因全長(zhǎng)序列與GenBank中的38株國(guó)內(nèi)外經(jīng)典犬貓細(xì)小病毒株和5株犬貓細(xì)小病毒疫苗株的VP2基因參考序列進(jìn)行比對(duì)分析。使用DNAstar中的MegAlign進(jìn)行同源性分析，利用MEGA7.0序列分析軟件，采用鄰近法(Bootstrap自舉值選擇1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)遺傳發(fā)育樹。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過(guò)卡方分析，使用非參數(shù)方法比較FPV檢出率在品種、年齡和性別方面的差異。通過(guò)Epi InfoTM7.2軟件進(jìn)一步估計(jì)差異的比值比(odds ratio, OR)及其95%置信區(qū)間(95% confidence interval, 95% CI)。雙因素ANOVA分析通過(guò)IBM SPSS Statistics 23.0進(jìn)行分析。相關(guān)P值分別為<0.05或<0.01，則認(rèn)為數(shù)值差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性或高度顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 FPV檢測(cè)結(jié)果與分析

用PCR方法對(duì)168份貓糞便樣本進(jìn)行FPV檢測(cè)。結(jié)果顯示成都地區(qū)貓群中FPV感染率高，118份樣本檢出FPV陽(yáng)性，陽(yáng)性率為70.2%(95% CI=62.7%～77.0%)。如表2所示，F(xiàn)PV在雄性貓和雌性貓中檢出率分別為70.2%(33/47)、65.7%(23/35)。幼齡貓(≤6月齡)和成年貓(>6月齡)檢出率則分別為80.6%(29/36)和56.3%(27/48)。純種貓和混血貓的檢出率分別為68.5%(37/54)和67.7%(21/31)。結(jié)果顯示(表2)，成都地區(qū)FPV的感染率與貓的年齡(P=0.02)顯著相關(guān)，但與貓的性別(P=0.81)和品種(P=1)均不相關(guān)。

表2 FPV的流行率與性別、品種和年齡的相關(guān)性

2.2 FPV VP2基因同源性分析

為進(jìn)一步了解成都地區(qū)FPVVP2基因的分子特征和遺傳變異，根據(jù)不同地區(qū)、生活環(huán)境和采樣時(shí)間選取13份FPV陽(yáng)性樣本測(cè)定其VP2基因，獲得13株FPVVP2基因全長(zhǎng)序列(SMU-D3、SMU-D4、SMU-D28、SMU-D18、SMU-D14、SMU-D46、SMU-D50、SMU-D53、SMU-D74、SMU-D87、SMU-F33、SMU-SC20-6和SMU-SC20-2(GenBank No.MZ442302-MZ442314)。本研究中13株毒株之間的核苷酸序列同源性為97.2%～100%，氨基酸序列同源性為97.4%～100%；與GenBank中43株VP2基因參考序列之間的核苷酸同源性為97.1%～100%，氨基酸序列同源性為97.1%～100%。值得注意的是，本研究中SMU-D18和SMU-D14兩株毒株與2株2019年中國(guó)報(bào)道的CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)同源性為100%，而與FPV毒株同源性為97.4%。氨基酸序列分析顯示(圖1)，SMU-D18毒株和SMU-D14毒株VP2蛋白的第426位氨基酸為Asn，與new CPV-2a毒株一致；此外，本研究中SMU-D46毒株的VP2蛋白氨基酸序列存在Ser293Phe和Ser297Phe兩處獨(dú)特的突變，另外10株毒株VP2蛋白與參考毒株相比均無(wú)明顯的氨基酸突變。

圖1 13株FPV毒株部分氨基酸序列比對(duì)圖

2.3 FPV VP2基因遺傳進(jìn)化分析

利用MEGA7.0軟件對(duì)13株FPVVP2基因序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析顯示(圖2)，本研究所獲得的毒株11株為貓細(xì)小病毒(FPV)，2株為貓?jiān)慈?xì)小病毒(CPV)。SMU-D18毒株和SMU-D14毒株與CPV聚為一個(gè)大的分支，與FPV親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，與中國(guó)CPV毒株(GenBank No.MN473464.1、MN473463.1)親緣關(guān)系最近，為貓?jiān)慈?xì)小病毒。另外11株FPV與GenBank中已知的細(xì)小病毒VP2基因序列在進(jìn)化樹中聚為3個(gè)不同的分支，本研究暫命名為G1、G2和G3。4株本研究中的毒株(SMU-D3、SMU-SC20-2、SMU-SC20-6和SMU-F33)與6株分別來(lái)自亞洲和歐洲的毒株聚為G1型分支；G2型分支由來(lái)自歐洲、亞洲和美洲的9株毒株組成；7株本研究中的毒株同屬于G3型，SMU-D46毒株單獨(dú)形成一個(gè)分支，SMU-D4和SMU-D53毒株與我國(guó)2019年分離的毒株BJ006(GenBank No.MT270585.1)親緣關(guān)系最近，SMU-D28、SMU-D87、SMU-D50和SMU-D74與4株我國(guó)分離的毒株在進(jìn)化樹的底端聚為一支。值得注意的是，貓細(xì)小病毒疫苗株Cu-4在系統(tǒng)發(fā)育樹中位于G2分支中，與我國(guó)流行的FPV毒株親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

●.本研究中的毒株; ■.犬、貓細(xì)小病毒疫苗株

3 討 論

FPV具有高度傳染性，是嚴(yán)重危害貓科動(dòng)物所有成員的重大病原之一[7]。全球各國(guó)均有FPV的流行，但各國(guó)FPV的感染率差異較大，在28.4%～94.3%之間[11-14]。自首次分離以來(lái)，我國(guó)常有關(guān)于FPV的報(bào)道，但近年來(lái)FPV在我國(guó)西南地區(qū)貓群中的流行情況仍不清楚[15-16]。本研究采集了168份貓腹瀉糞便樣本進(jìn)行FPV檢測(cè)，檢出率為70.2%，遠(yuǎn)高于我國(guó)以往報(bào)道的FPV的檢出率(11.4%～38.4%)[16-17]。研究表明，F(xiàn)PV的檢出率與患病貓的臨床癥狀明顯相關(guān)，腹瀉貓糞便樣本的檢出率明顯高于臨床健康貓糞便樣本[17]，這可能是本研究FPV檢出率明顯高于其他地區(qū)的原因之一。與之前的研究一致，本研究中FPV的檢出率與患病貓的年齡顯著相關(guān)，而與患病貓的性別和品種無(wú)顯著相關(guān)性[17]。

在20世紀(jì)70年代后期，犬細(xì)小病毒2型(canine parvovirus-2, CPV-2)成為犬中的一種新病原體，原型CPV-2最初不能與貓轉(zhuǎn)鐵蛋白受體結(jié)合，因而不能感染貓[9]。然而，隨后出現(xiàn)并取代CPV-2的遺傳變異體CPV-2a、CPV-2b和CPV-2c很快獲得了對(duì)貓的感染性，這些CPV-2新抗原變體VP2蛋白第300殘基均表現(xiàn)由Ala突變?yōu)镚ly，引起的疾病與貓泛白細(xì)胞減少癥無(wú)法區(qū)分[6,9-10]。1987年首次檢測(cè)到原型CPV-2a的一個(gè)新的遺傳變異體，在VP2氨基酸297殘基從Ser到Ala發(fā)生非同義替換，被命名為new CPV-2a型并且在全球范圍內(nèi)流行[6]。而本研究中SMU-D18和SMU-D14毒株與FPV毒株的同源性為97.4%，卻與new CPV-2a毒株同源性為100%，表明兩株毒株為new CPV-2a毒株感染貓，為貓?jiān)慈?xì)小毒株。

有趣的是，同樣位于VP2氨基酸297殘基，本研究中的SMU-D46毒株發(fā)生了與CPV不同的由Ser到Phe突變，同時(shí)在293殘基處也發(fā)生了從Ser到Phe的獨(dú)特的突變。以往的研究表明，new CPV-2a突變Ser297Ala雖然位于B抗原表位上，但其不會(huì)改變變體的抗原性質(zhì)[6, 8, 18-20]，推測(cè)其可能會(huì)影響病毒與細(xì)胞受體的結(jié)合。然而，本研究SMU-D46毒株在293和297氨基酸位點(diǎn)均發(fā)生了同樣的突變，這是否會(huì)引起FPV抗原類型的改變還有待進(jìn)一步研究。表明new CPV-2a和FPV在我國(guó)貓群中共同流行[7]，巨大的進(jìn)化壓力導(dǎo)致CPV和FPV新變體不斷出現(xiàn)，提示研究者應(yīng)加強(qiáng)對(duì)CPV和FPV的監(jiān)測(cè)和防控。

系統(tǒng)發(fā)育分析顯示，本研究11株FPV毒株均與國(guó)內(nèi)毒株親緣關(guān)系較近，與GenBank中FPV參考毒株在進(jìn)化樹中聚為3個(gè)基因群，成都地區(qū)流行的FPV毒株分別位于G1和G3群中，兩個(gè)基因群遺傳關(guān)系相距甚遠(yuǎn)，7株毒株在G3群中又分別聚為兩簇，提示成都地區(qū)FPV不僅流行率高，并且流行的毒株呈多樣性，這更加不利于FPV的防控。與同源性分析結(jié)果一致，SMU-D46毒株在G3群中單獨(dú)形成一個(gè)分支，與其他毒株表現(xiàn)出獨(dú)特的遺傳進(jìn)化關(guān)系。值得注意的是，不論是CPV還是FPV疫苗株均未與我國(guó)流行毒株聚為一支，急需重新評(píng)估市售商品化疫苗對(duì)我國(guó)流行毒株的保護(hù)率，及早研發(fā)針對(duì)我國(guó)新型流行毒株的有效疫苗。

4 結(jié) 論

本研究調(diào)查了2017-2021年FPV在四川成都地區(qū)的流行情況，豐富了四川成都地區(qū)FPV的流行病學(xué)資料。FPV在成都地區(qū)貓群中流行率遠(yuǎn)高于我國(guó)其他地區(qū)，并且在VP2蛋白關(guān)鍵位點(diǎn)存在突變，產(chǎn)生了新的變體，同時(shí)存在new CPV-2a毒株的感染。