基于恒溫隔絕式熒光RT-PCR技術(shù)現(xiàn)場檢測牛紐布病毒方法的建立及應(yīng)用

崔雨晨，岳 華，湯 承

(西南民族大學畜牧獸醫(yī)學院，成都 610041)

紐布病毒(nebovirus, NeV)可引起小牛的腸道損傷和嚴重水樣腹瀉，是導致犢牛腹瀉的重要病原[1-2]。迄今為止，已有13個國家報道了NeV的存在和流行，地域上涵蓋美洲、亞洲、歐洲和非洲[3-10]。作者實驗室于前期已在四川、新疆、遼寧和陜西等多地檢出NeV，檢出率為12%～55%，證實NeV在國內(nèi)奶牛和牦牛廣泛存在，屬于國內(nèi)新發(fā)致牛腹瀉病毒，且具備遺傳多樣性[10-12]。

NeV是嵌杯病毒科(Caliciviridaefamily)紐布病毒屬(Nebovirusgenus)的唯一成員，為無囊膜的單股正鏈RNA病毒，基因組全長7 453～7 460 bp[13]，具有兩個開放閱讀框(ORFs)：ORF1和ORF2，兩個非編碼區(qū)(5′-UTR和3′-UTR)和一個多聚腺苷酸尾(ployA)。由于RdRp基因3′端相較其他基因更不易突變，多作為檢測引物的設(shè)計靶點[14]。根據(jù)目前GenBank數(shù)據(jù)庫中僅有的8條完整的NeV RdRp核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹可分為4個基因型：NB-like基因型(4條)，NA1-like基因型(1條)，SC-yak基因型(2條)，和SC-yak-like 1基因型(1條)[13-14]，4條NB-like型間的核苷酸相似性86.2%～88.0%、2條SC-yak型間的毒株核苷酸相似性90.2%；NB-like型與NA1-like型之間的毒株核苷酸相似性78.9%～85.0%，NB-like型與SC-yak型間的核苷酸相似性68.0%～68.7%，NB-like型與SC-yak-like 1型之間的核苷酸相似性69.0%～69.6%。其中，NB-like型毒株是世界范圍內(nèi)奶牛、肉牛和牦牛中主要流行基因型；NA1-like型毒株在我國未檢出；SC-yak型和SC-yak-like 1型毒株僅在中國牦牛中檢出[13,15]。

目前，有7個檢測NeV的RT-PCR方法報道：4種常規(guī)RT-PCR、2種熒光定量RT-PCR和1種巢式RT-PCR[9-11,16-19]，迄今尚未見基于探針法檢測NeV的方法報道。由于我國NeV毒株顯示出獨特的進化趨勢，且有新型毒株的出現(xiàn)，使得國外報道的檢測方法對國內(nèi)NeV毒株的檢出效果不佳[11,19]。恒溫隔絕式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR, iiRT-PCR)是一種基于熒光探針水解的絕緣等溫RT-PCR技術(shù)，配套使用PetNAD試劑盒和POCKITTM系列手持式核酸分析儀，已廣泛用于多種動物疫病的現(xiàn)場檢測[20-26]。由于SC-yak型與其他型的核苷酸相似性只有61.8%～68.7%，因此無法和其他型毒株建立通用引物，本研究旨在建立檢測NB-like和NA1-like及SC-yak-like 1基因型NeV的iiRT-PCR方法，為國內(nèi)NeV的快速檢測提供新的工具。

1 材料與方法

1.1 病毒(菌)株與臨床樣本

NeV陽性核酸由本實驗室保存；進行特異性檢驗的陽性樣本：牛冠狀病毒(bovine coronavirus, NeV, SWUN-7907)、牛諾如病毒(norovirus, NoV)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus, BVDV, SWUN-2011)、牛A群輪狀病毒(bovine rotavirus A, BRVA, SWUN-6554)、牛凸隆病毒(bovine torovirus, BToV)；牛大腸埃希菌(SWUN-4007)、牛都柏林沙門菌(SWUN-4790)、牛產(chǎn)氣莢膜梭菌(SWUN-1103)；牛瑞氏隱孢子蟲、牛艾美爾球蟲均保存于本實驗室。

101份犢牛腹瀉糞便樣本于2020—2021年采自四川省，22份奶牛腹瀉糞便樣本采自西昌市的4個奶牛養(yǎng)殖場，35份肉牛糞便樣本采自閬中市的3個肉牛養(yǎng)殖場，44份牦牛腹瀉糞便樣本采自紅原縣和若爾蓋縣的7個牦牛養(yǎng)殖場，由本實驗室保存。

1.2 主要試劑

TrizolTMReagent、Prime scriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix ExTaq(Probe qPCR)、DNA Marker等購于寶日醫(yī)生物有限公司；pClone007 載體、EHA105感受態(tài)細胞等購于擎科生物科技有限公司；DEPC試劑購于SIGEMA生物公司；PetNAD 核酸萃取試劑盒購于金瑞鴻捷(廈門)生物科技有限公司。

1.3 主要儀器

POCKITTM智能型核酸分析儀(金瑞鴻捷公司，中國廈門)；熒光定量PCR儀(博日公司，杭州)；cubeeTM小型高速離心機(金瑞鴻捷公司，廈門)；各量程移液器(Eppendorf 公司，德國)；高速冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司，湖南)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司，上海)。

1.4 引物、探針的設(shè)計與合成

下載并篩選出登錄于GenBank的長度≥550 bp的國內(nèi)外全部49條NeVRdRp基因序列，以高度保守的基因序列區(qū)域為基礎(chǔ)設(shè)計了引物和探針，擴增的目的片段位于基因組的4 761―4 850 bp處(Bo/LZB-1/17/CH株)長度為90 bp，引物序列(F：5′-CAGCCYGTCTGGGTGAAT-3′；R：5′-CTGGATRGTTCTGACTTCGG-3′)；探針序列：VIC-ACCACGAAGCCCARCCAAT-MGB，位于基因組的4 801―4 819 bp處。引物和探針均由北京擎科生物科技有限公司成都分公司合成。

1.5 核酸的提取

1.5.1 RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄 采用Trizol法提取RNA，反轉(zhuǎn)錄使用Prime scriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒(寶日醫(yī)生物有限公司)，反轉(zhuǎn)錄后-20 ℃保存?zhèn)溆谩，F(xiàn)場檢測樣本使用PetNAD核酸萃取試劑盒進行提取，反轉(zhuǎn)錄所需的Prime scriptTM反轉(zhuǎn)錄試劑盒中的2號反轉(zhuǎn)錄酶經(jīng)優(yōu)化預混后，于iiRT-PCR反應(yīng)中同步進行。

1.5.2 DNA的提取 使用酚-氯仿法提取“1.1”中的細菌和寄生蟲DNA，-20 ℃保存。

1.6 NeV陽性標準品的制備

將NeV的cDNA作為陽性模板，用“1.4”中設(shè)計的引物進行RT-PCR擴增，得到的產(chǎn)物使用電泳鑒定，送北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行經(jīng)測序?qū)Ρ葻o誤并返樣。將返樣的產(chǎn)物用pClone007載體、EHA105感受態(tài)細胞進行克隆轉(zhuǎn)化，送北京擎科生物科技有限公司成都分公司進行測序并返質(zhì)粒，將質(zhì)粒作為陽性標準品。

1.7 iiRT-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化

50 μL iiRT-PCR反應(yīng)體系中Premix ExTaq預混酶為25 μL，反應(yīng)體系主要是優(yōu)化探針濃度10 μmol·μL-1(0.05～0.35 μL)、引物濃度10 μmol·μL-1(1～4 μL)、模板量(0.5～3.5 μL)，以iiRT-PCR反應(yīng)前后熒光比值在2～3用量為最佳，以控制變量法確定各自最優(yōu)濃度及用量[25]。

1.8 現(xiàn)場檢測NeV的iiRT-PCR預混試劑的制備

為了滿足現(xiàn)場檢測，對“1.7”中描述的反應(yīng)體系進行了預混優(yōu)化。在對反應(yīng)體系進行篩選后，將檢測10份樣本需要的檢測試劑按比例分裝預混為一管，然后進行避光保存。反轉(zhuǎn)錄就在該PCR反應(yīng)管中完成，使用時只需加入模板即可開始檢測。-80 ℃避光保存?zhèn)溆?，可保?周以上；使用干冰避光保存運輸至現(xiàn)場，也可保證現(xiàn)場使用效果。

1.9 iiRT-PCR的評價

1.9.1 特異性評價 用建立的iiRT-PCR方法對“1.1”中的病毒、菌株和寄生蟲進行檢測，以評價本試驗建立方法的特異性。

1.9.2 靈敏性測定 將“1.6”中制備的陽性質(zhì)粒進行10倍遞增稀釋，遞增稀釋樣品后，使用建立的iiRT-PCR方法檢測，確定該方法檢測下限。

1.9.3 穩(wěn)定性評價 用本研究建立的方法對陽性標準品的3個連續(xù)稀釋度分別進行3次重復檢測，以評價該方法的穩(wěn)定性。

1.10 比較4種檢測方法對臨床樣本中NeV的檢出率

采用本試驗建立的方法和已報道的兩種熒光定量RT-PCR方法[16-17]以及目前國外使用最為廣泛的巢式RT-PCR方法[19]，分別對“1.1”中臨床樣本進行檢測并比較檢出率，4種檢測方法信息見表1。如果4種方法所檢出陽性樣本編號有所不同，則對其PCR產(chǎn)物進行測序，以驗證檢測結(jié)果的準確性。

表1 4種檢測方法信息

1.11 NeV和其他病原混合感染情況

檢測“1.1”中的臨床樣本中陽性樣本與BVDV、NoV、BRVA、BCoV、BToV的混合感染情況。

2 結(jié) 果

2.1 引物的特異性

使用本試驗所建立的引物對2個陽性樣本及1個陰性樣本進行RT-PCR檢測(圖1)，結(jié)果顯示，3個陽性樣本均檢出，陰性不檢出，將檢出的樣本進行測序證明檢測無誤，說明本試驗的引物特異性好。

M.DNA相對分子質(zhì)量標準(50～500 bp)；+.陽性樣品；-.陰性對照

2.2 優(yōu)化的反應(yīng)體系

經(jīng)過篩選優(yōu)化的iiRT-PCR反應(yīng)體系：5 U·μL-1的Taq酶(預混酶)25 μL，10 μmol·μL-1上下游引物各3 μL，10 μmol·μL-1探針0.3 μL，20 U·μL-1反轉(zhuǎn)錄酶0.5 μL，模板1 μL，使用DEPC H2O補足50 μL。

2.3 iiRT-PCR的特異性評價

本研究建立的NeV iiRT-PCR方法僅對NeV的陽性核酸樣本結(jié)果為陽性，對“1.1”中的無關(guān)病原不檢出，表明NeV iiRT-PCR方法的特異性良好。

2.4 iiRT-PCR穩(wěn)定性評價

用本研究建立的方法對陽性標準品的3個連續(xù)稀釋度分別進行3次重復檢測，批間變異系數(shù)(CV)為3.07%～3.12%，批內(nèi)變異系數(shù)(CV)為2.45%～3.01%，表明本研究建立的NeV iiRT-PCR方法穩(wěn)定良好。

2.5 iiRT-PCR靈敏性檢測

本研究制備的陽性質(zhì)?？截悢?shù)為5.38×1010copies·μL-1，10倍遞增稀釋樣品后檢測用于靈敏性檢測，結(jié)果顯示，本研究建立的iiRT-PCR方法對NeV的檢測范圍是5.38×1010～5.38 copies·μL-1，核酸最低檢限測為5.38 copies·μL-1。

2.6 iiRT-PCR對臨床樣本中 NeV 的檢測

本試驗所建iiRT-PCR檢測方法對“1.1”的糞便樣本中NeV的平均檢出率為64.36%，其中奶牛腹瀉糞便樣本中NeV的檢出率為81.8%、肉牛腹瀉糞便樣本中NeV的檢出率為68.6%、牦牛腹瀉糞便樣本中NeV的檢出率為52.2%，優(yōu)于兩種熒光定量RT-PCR[16-17]和巢式RT-PCR方法[19]檢測結(jié)果，見表2。并且，本試驗所建檢測方法檢出的陽性樣品包含了其他3種方法所檢出的所有陽性樣本。

表2 4種檢測方法對臨床樣本的檢測結(jié)果

2.7 NeV和其他病原的混合感染情況

65個檢出NeV陽性的臨床樣本中有22個僅感染NeV，剩下43個NeV陽性樣本存在與其他4種腸道病原的混合感染，詳細情況見表3。

表3 NeV與其他腹瀉病毒的混合感染

2.8 現(xiàn)場檢測結(jié)果

按照“1.8”中的方法將檢測試劑預混之后，對18份犢牛(≤3月齡)腹瀉糞便樣本進行了現(xiàn)場檢測，結(jié)果顯示，18份檢測樣本中，11份為NeV陽性，7份為NeV陰性，檢出率為61.1%。將這18份臨床樣本帶回實驗室后，使用本試驗建立的iiRT-PCR方法進行檢測，檢測結(jié)果與現(xiàn)場檢測結(jié)果一致，表明本試驗建立的iiRT-PCR方法的檢測試劑預混后可滿足現(xiàn)場檢測的使用。

3 討 論

NeV可引起小牛的腸道損傷和嚴重水樣腹瀉，是導致犢牛腹瀉的重要病原[1,2,27]。本實驗室前期研究證實，NeV在我國多地區(qū)的奶牛和牦牛中廣泛流行，是引起我國牛腹瀉的新發(fā)病原[10-12]。作者分析了GenBank中全部49條NeVRdRp基因序列，以高度保守的基因序列區(qū)域為基礎(chǔ)設(shè)計引物和探針，建立了可以檢測NeV 的iiRT-PCR方法，具有良好的穩(wěn)定性和特異性，靈敏度為5.38 copies·μL-1，為NeV的NB-like基因型、NA-like基因型、SC-yak-like 1基因型檢測提供了新的方法，滿足了主要流行毒株的檢測需求。為滿足現(xiàn)場檢測的需要，作者對檢測試劑進行了預混優(yōu)化，使用時只需將預混試劑轉(zhuǎn)移至iiPCR反應(yīng)管中，再加入需檢測的RNA即可開始檢測，RNA所需要的反轉(zhuǎn)錄步驟同時進行，可減少加樣次數(shù)，避免污染；配套使用PetNAD試劑盒與POCKITTM檢測儀，從核酸提取到匯報結(jié)果只需1 h，可節(jié)省時間。

比較試驗表明，本方法對奶牛、肉牛和牦牛腹瀉糞便樣本中的NeV檢出率都優(yōu)于1.10中其余3種已報道的方法中[16-17,19]。作者選擇4種方法檢出結(jié)果均為陽性的臨床樣本，將其做10倍遞增稀釋，再用4種方法同時進行檢測，結(jié)果表明，本試驗建立的iiRT-PCR靈敏度與TB Green real-time RT-PCR方法[17]的靈敏度為同一數(shù)量級，比文獻[16]報道的熒光定量RT-PCR方法高10倍，比文獻[19]報道的巢式RT-PCR方法高100倍。此外，與GenBank中登錄的國內(nèi)NeV RdRp序列相比，文獻[19]報道的巢式RT-PCR方法和文獻[16]報道的SYBR Green real-time RT-PCR方法的上下游引物擴增位點均存在不同程度的序列不匹配現(xiàn)象，如：文獻[16]報道的熒光定量RT-PCR方法上游引物(18 nt)與國內(nèi)部分毒株的RdRp 序列相比有10個位點存在點突變(G1T、G4A、T7C、A9G、G10A、T13C、C16T、A17G、A19TC、C20T)，而其下游引物(20 nt)存在4個位點存在點突變(T1A、T5A、A6G、T18C)，這種引物與擴增序列不匹配的現(xiàn)象會影響所建方法的檢出效果。

本試驗檢測了101份采自四川省的犢牛腹瀉樣本，NeV的平均檢出率為64.36%，在奶牛、牦牛和肉牛中的檢出率分別為81.8%、52.2%及68.6%，進一步證實NeV在四川牛群中廣泛流行，并且NeV與BCoV、BNoV、BRVA和BVDV 4種病毒中的一種或多種的混合感染達到66%(表3)，這種混合感染將導致診斷更復雜，并使犢牛腹瀉的臨床治療更加困難。由于NeV是新發(fā)病原，我國在犢牛腹瀉診斷時更多考慮BCoV、BVDV和BRV等幾個常見致牛腹瀉的病毒，對NeV考慮較少。根據(jù)本試驗得到的數(shù)據(jù)，建議應(yīng)將NeV納入犢牛腹瀉病原的常規(guī)檢測。盡管已經(jīng)證實NeV是一個重要的新發(fā)犢牛腹瀉病原，但目前尚無病毒分離體系，也無特異性免疫預防和治療制劑，因此，研究基于VP1的亞單位疫苗可能是一個防控NeV的有效途徑。

4 結(jié) 論

成功建立了檢測NeV的iiRT-PCR方法，具有穩(wěn)定性好、特異性強和靈敏度高的優(yōu)點，既可用于實驗室檢測NeV，也可配合PetNAD核酸萃取試劑盒和POCKITTM系列手持式核酸檢測儀實現(xiàn)現(xiàn)場檢測，為NeV的快速檢測提供了有力的工具。