基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序研究健康三益菌對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝的影響

張利環(huán)，賈 浩，王燕飛，張若男，劉 璇

(山西農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太谷 030801)

雞作為一種重要的農(nóng)業(yè)養(yǎng)殖鳥(niǎo)類(lèi)，與其他畜禽相比消化道較短，腸道黏膜屏障較脆弱，更容易受到各種疾病的侵害[1]。在規(guī)?；娜怆u養(yǎng)殖中，為降低死淘率并追求更快的生長(zhǎng)速度，通常會(huì)使用飼料添加劑。但某些飼料添加劑如抗生素和激素等使用不當(dāng)會(huì)導(dǎo)致肉雞體內(nèi)藥物殘留、內(nèi)分泌紊亂和腹部脂肪沉積過(guò)多等問(wèn)題[2]。過(guò)多的腹部脂肪不僅影響肉雞的口感，還會(huì)影響飼料轉(zhuǎn)化率、胴體產(chǎn)量、生殖性能以及對(duì)疾病的免疫力，而肌內(nèi)脂肪(intramuscular fat，IMF)對(duì)肉質(zhì)嫩度、色澤和風(fēng)味等均有積極影響，消費(fèi)者通常偏愛(ài)IMF含量較高的雞，因此，促生長(zhǎng)的同時(shí)調(diào)節(jié)脂肪沉積已成為現(xiàn)在家禽養(yǎng)殖業(yè)急需解決的問(wèn)題[3-5]。

益生菌能夠通過(guò)積極調(diào)節(jié)腸道菌群來(lái)減輕腸道黏膜損傷、增強(qiáng)免疫應(yīng)答，并促進(jìn)腸道消化吸收、調(diào)節(jié)糖脂代謝，進(jìn)而改善機(jī)體的生長(zhǎng)性能和健康狀況[6-8]。飼料添加益生菌不會(huì)產(chǎn)生藥物殘留，且對(duì)肉雞的脂質(zhì)代謝有積極影響。研究表明，嗜酸乳桿菌可降低白羽肉雞血清和肝的膽固醇含量，并調(diào)控膽固醇轉(zhuǎn)化、合成以及酯化相關(guān)基因的表達(dá)[9]。Shokryazdan等[10]和Wang等[11]研究發(fā)現(xiàn)，益生菌可促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，降低血清總膽固醇、甘油三酯(triglyceride，TG)以及腹部脂肪沉積。其中，干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)、嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus)和雙歧桿菌(Bifidobacterium)共稱為“健康三益菌”，在腸道中均有定植，較其他菌種安全性能更高，被廣泛用于食品和飼料添加[12]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，健康三益菌可有效促進(jìn)肉雞生長(zhǎng)，當(dāng)干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌的比例為1∶1∶2時(shí)效果較佳。益生菌作用的最直接部位是腸道，肉雞中25%的脂肪酸也來(lái)自小腸對(duì)飲食的消化吸收，與十二指腸和空腸相比，回腸是小腸中最長(zhǎng)的部分且菌群數(shù)量更高，有更強(qiáng)的發(fā)酵能力[13-14]。

本研究通過(guò)對(duì)黃麻肉雞的肉品質(zhì)和回腸轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，探索健康三益菌復(fù)合制劑(干酪乳桿菌∶嗜酸乳桿菌∶雙歧桿菌=1∶1∶2)對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝的調(diào)控，為進(jìn)一步研究健康三益菌對(duì)肉雞腸道脂質(zhì)代謝的調(diào)節(jié)及分子機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 飼養(yǎng)管理及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)黃麻肉雞購(gòu)自山西省太谷縣田建勝養(yǎng)殖場(chǎng)，按要求接種疫苗，飼養(yǎng)于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物房，定期消毒打掃，每日08:00和20:00飼喂，肉雞自由采食飲水，動(dòng)物房?jī)?nèi)光照23 h，黑暗1 h，育雛第一周溫度為33 ℃，此后每日降低1 ℃，直至23 ℃保持恒溫。試驗(yàn)期為42 d，隨機(jī)將200只1日齡雄性黃麻肉雛雞分為2組，每組5個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)20只。對(duì)照組正常飲水，益生菌組將健康三益菌(干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌、雙歧桿菌)按1∶1∶2的比例混合，在飲水中添加1%復(fù)合制劑，均按標(biāo)準(zhǔn)飼喂基礎(chǔ)日糧(表1)。健康三益菌菌種均購(gòu)自上海丹尼斯克添加劑有限公司，有效活菌數(shù)大于3.4×109CFU·g-1。

表1 基礎(chǔ)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)成分

1.2 樣品采集及處理

42 d時(shí)禁食12 h、自由飲水，每組抽取接近平均體重肉雞20只進(jìn)行屠宰試驗(yàn)，稱重測(cè)量胸肌率和腹脂率；取回腸用生理鹽水將其沖洗干凈，液氮速凍，并于-80 ℃保存，用于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序；利用索氏抽提法測(cè)胸肌IMF含量；肉品嫩度儀(MAQC-12)測(cè)定剪切力。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及分析

在對(duì)照組和益生菌組中各自隨機(jī)抽取4個(gè)回腸樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。Illumina HiSeq Xten/NovaSeq600上機(jī)測(cè)序。使用SeqPrep軟件對(duì)原始測(cè)序數(shù)據(jù)(raw reads)進(jìn)行過(guò)濾，從而得到高質(zhì)量的測(cè)序數(shù)據(jù)(clean reads)。將質(zhì)控后的clean reads利用HiSat2軟件比對(duì)到雞(Gallusgallus)的參考基因組，獲得mapped reads，同時(shí)進(jìn)行質(zhì)量評(píng)估，剔除1個(gè)離群樣本。

1.4 差異表達(dá)基因篩選

使用DESeq2進(jìn)行差異表達(dá)分析：P<0.05和|log2FC|≥1，當(dāng)一個(gè)基因同時(shí)滿足這兩個(gè)條件時(shí)，則視為顯著差異表達(dá)基因(significantly differentially expressed genes, SDEGs)。

1.5 GO富集和KEGG富集

將篩選后的SDEGs利用R腳本進(jìn)行GO富集和KEGG Pathway富集，使用Fisher精確檢驗(yàn)，利用Bonferroni多重檢驗(yàn)方法來(lái)控制計(jì)算假陽(yáng)性率，P<0.05則認(rèn)為顯著富集。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)驗(yàn)證

隨機(jī)選擇5個(gè)SDEGs進(jìn)行qRT-PCR，驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的結(jié)果。取測(cè)序相同樣品，TRIzol法提取回腸總RNA，使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa, RR036A)得到cDNA。使用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ Kit試劑盒(TaKaRa)進(jìn)行反應(yīng)。qRT-PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，72 ℃延伸20 s，循環(huán)40次；每5 s增加0.5 ℃至95 ℃，5 min制作熔解曲線。由NCBI獲得基因序列，Primer 3.0設(shè)計(jì)引物，β-actin為內(nèi)參，按照公式P=2-ΔΔCT計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 24.0進(jìn)行ANOVA分析，Duncan’s法進(jìn)行組間多重比較，GraphPad Prism 8進(jìn)行繪圖。P>0.05表示差異不顯著，P<0.05表示差異顯著。

表2 熒光定量PCR引物

2 結(jié) 果

2.1 健康三益菌對(duì)肉雞肉品質(zhì)的影響

由表2可知，與對(duì)照組相比，益生菌組的肉雞腹脂率和剪切力降低，而胸肌率和IMF均提高(P>0.05)。

表2 健康三益菌對(duì)肉雞肉品質(zhì)的影響

2.2 RNA測(cè)序數(shù)據(jù)分析

測(cè)序結(jié)果如表3，樣本過(guò)濾后的clean reads占raw reads的98.26%～98.91%，測(cè)序堿基平均錯(cuò)誤率均在0.026%以下，GC含量所占比例為49.09%～51.12%。由圖1可知，皮爾遜相關(guān)系數(shù)(R2)均大于0.925，表明測(cè)序結(jié)果適合后續(xù)分析；Venn分析表明，對(duì)照組和益生菌組的回腸組織中分別檢測(cè)到13 317和12 971個(gè)基因，在兩組均有表達(dá)的基因有12 754個(gè)。在檢測(cè)到的全部13 534個(gè)基因中，益生菌組與對(duì)照組比較得到641個(gè)SDEGs，其中上調(diào)274個(gè)，下調(diào)367個(gè)(圖2)。圖3為SDEGs的聚類(lèi)分析結(jié)果，同一處理下的重復(fù)組基因表達(dá)模式更加接近，說(shuō)明本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)可靠，組內(nèi)一致性和組間差異較好，且健康三益菌可調(diào)控黃麻肉雞中基因的表達(dá)。

圖1 轉(zhuǎn)錄組Pearson相關(guān)系數(shù)(a)和轉(zhuǎn)錄組Venn分析(b)

圖2 差異表達(dá)基因火山圖

圖3 差異表達(dá)基因聚類(lèi)圖

表3 序列質(zhì)量和比對(duì)信息匯總統(tǒng)計(jì)

2.3 脂質(zhì)代謝差異表達(dá)基因篩選

如表4所示，基于641個(gè)SDEGs，篩選出主要在脂質(zhì)代謝中起調(diào)控作用的差異表達(dá)基因12個(gè)，與對(duì)照組相比，益生菌組中上調(diào)基因10個(gè)，下調(diào)基因2個(gè)(P<0.05)。

表4 脂質(zhì)代謝顯著差異表達(dá)基因

2.4 GO富集和KEGG通路富集

圖4為利用GO富集分析SDEGs參與的脂質(zhì)代謝相關(guān)的生物過(guò)程，包括對(duì)脂肪酸的反應(yīng)、鞘糖脂代謝過(guò)程、乳糜微粒重構(gòu)和長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合等。KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)分析發(fā)現(xiàn)，SDEGs參與的與脂質(zhì)代謝有關(guān)代謝通路包括17條，包括甾類(lèi)激素生物合成、PPAR信號(hào)通路和花生四烯酸的代謝等(圖5)。

BP、MF分別代表生物學(xué)過(guò)程和分子功能

圖5 KEGG富集脂質(zhì)代謝通路

2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR驗(yàn)證

隨機(jī)選擇5個(gè)基因LPL、FABP4、GOS2、THRSP和CYP7B1進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。如圖6所示，與對(duì)照組相比，益生菌組LPL、FABP4、GOS2和THRSP表達(dá)極顯著上調(diào)(P<0.001)，CYP7B1表達(dá)量極顯著下調(diào)(P<0.001)，這與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果的趨勢(shì)一致，說(shuō)明測(cè)序結(jié)果可靠。

***表示差異極顯著(P<0.001)

3 討 論

肉質(zhì)品質(zhì)可直觀地反映出肉雞脂質(zhì)代謝情況。研究表明，益生菌對(duì)肉雞的肉品質(zhì)有積極影響[15]，可通過(guò)提高氨基酸和蛋白質(zhì)的含量增加胸肌重量，并通過(guò)減少腹部脂肪沉積來(lái)改善家禽胴體質(zhì)量[16-17]。本研究發(fā)現(xiàn)，益生菌組肉雞的胸肌重和IMF均有所增加，腹脂減少。陳婷等[18]在烏骨雞飼料中添加復(fù)合益生菌產(chǎn)生了相似的結(jié)果。Resnyk等[19]發(fā)現(xiàn)，生長(zhǎng)性能相同的肥系肉雞會(huì)將更多的能量和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)分配到腹脂中，而瘦系肉雞會(huì)將更多的蛋白質(zhì)沉積到胸肌中。表明本試驗(yàn)中的健康三益菌可調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的分配，改善肉雞肉品質(zhì)。雞IMF含量是決定雞肉品質(zhì)和健康的最重要因素[20]，IMF的適度增加可以減少單位面積肌纖維的數(shù)量，而肌纖維和肌肉結(jié)締組織、肌漿蛋白是構(gòu)成肌肉嫩度的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，因此，肌內(nèi)脂肪的增加可使肌肉嫩度提升[21-22]。剪切力是評(píng)估肉類(lèi)嫩度的直觀指標(biāo)[23]。陳婷等[18]發(fā)現(xiàn)，復(fù)合益生菌可使雞胸肌剪切力降低，與本試驗(yàn)結(jié)果相同。表明健康三益菌可通過(guò)提高IMF沉積，增加肌肉嫩度，降低剪切力，改善雞肉脂質(zhì)代謝。

脂質(zhì)代謝是由多個(gè)基因和調(diào)控因子通過(guò)不同的信號(hào)途徑所調(diào)節(jié)的復(fù)雜的過(guò)程，本試驗(yàn)通過(guò)肉雞回腸的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)，健康三益菌調(diào)控的主要脂質(zhì)代謝SDEGs有12個(gè)，包括LPL、SCD、FABP4、FABP3、PLIN1、GOS2、GGT5、RBP7、CYP7B1、CYP2C18、THRSP和THEM4，先前的報(bào)道顯示，這些基因參與脂肪生成、活化、轉(zhuǎn)運(yùn)、分解和沉積等過(guò)程的調(diào)控[24-25]。其中，LPL在641個(gè)SDEGs中差異最顯著，編碼稱為脂蛋白脂肪酶的糖蛋白酶。這種糖蛋白酶可水解乳糜微粒和TG，生成的游離脂肪酸、甘油單酯和乳糜微粒殘留物可供機(jī)體使用或貯存[26]。Lee等[27]研究表明，植物乳桿菌可降低小鼠血清中TG，提高肝中LPLmRNA水平。LPL的高表達(dá)被認(rèn)為與脂肪沉積有關(guān)[28]。Zhao等[29]認(rèn)為，添加丁酸梭菌的肉雞肌肉組織中LPL的高表達(dá)可能是IMF增加的原因。本試驗(yàn)益生菌組LPL的過(guò)表達(dá)可能也與IMF增加有關(guān)。SCD、FABP3、FABP4和THRSP也與IMF沉積有關(guān)。SCD能夠?qū)⒆貦八岷陀仓徂D(zhuǎn)化為棕櫚油酸和油酸，棕櫚酸和油酸是最豐富的長(zhǎng)鏈脂肪酸，主要用于合成TG[30]。Choi等[31]發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌通過(guò)下調(diào)肝中SCD的表達(dá)來(lái)減輕小鼠肥胖。本研究中，肉雞回腸的SCD在益生菌組中上調(diào)，但腹脂減少，并未導(dǎo)致肉雞的過(guò)度肥胖，產(chǎn)生這種結(jié)果的原因可能是在不同物種SCD的作用不同，肉雞腸道中高SCD表達(dá)導(dǎo)致IMF的增加而非腹部脂肪的增加。FABP3和FABP4屬于FABP家族，其編碼的蛋白質(zhì)負(fù)責(zé)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝，且在脂肪生成、分解以及穩(wěn)態(tài)維持等方面起作用[32]。FABP3可將脂肪酸從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞內(nèi)特定位點(diǎn)，F(xiàn)ABP4可調(diào)控PPARγ在脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝中起重要作用[25]。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)ABP可促進(jìn)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)[33]。本試驗(yàn)益生菌組中FABP3和FABP4的回腸表達(dá)水平增加，說(shuō)明健康三益菌可促進(jìn)肉雞腸道脂肪酸向特定位點(diǎn)的轉(zhuǎn)運(yùn)。研究表明，THRSP與牛肉中大理石花紋的含量高度相關(guān)，其在脂肪生成的調(diào)節(jié)方面起重要作用[34]。Yin等[32]表明，THRSP在遺傳性肥胖鳥(niǎo)類(lèi)中高度表達(dá)。Schering等[35]認(rèn)為，THRSP表達(dá)增加是IMF含量高的結(jié)果而非原因。這就可以解釋為什么本試驗(yàn)健康三益菌使肉雞回腸THRSP表達(dá)增加卻未導(dǎo)致肥胖。CYP7B1在大腦、肝、生殖道等多個(gè)部位表達(dá)，在不同組織中生理功能不同[36]。CYP7B1作為與脂肪分解有關(guān)的基因，在瘦系雞腹部脂肪中表達(dá)高于肥系雞[19]。本試驗(yàn)中，CYP7B1表達(dá)量在益生菌組的下調(diào)，說(shuō)明健康三益菌可能通過(guò)降低其表達(dá)來(lái)抑制肉雞脂肪分解。脂質(zhì)代謝相關(guān)SDEGs中，PLIN1和GOS2也在脂肪的分解中起調(diào)控作用。機(jī)體處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，PLIN1包被在脂滴表面；當(dāng)所需能量增加時(shí)，其表達(dá)量下降，促進(jìn)脂肪分解[37]。PLIN1的高表達(dá)被認(rèn)為促進(jìn)了雞體內(nèi)的脂肪積累[30]，PLIN1的下調(diào)導(dǎo)致鳥(niǎo)類(lèi)空腸脂質(zhì)水平降低[32]。Martinez-Botas等[38]表明PLIN1活性的喪失降低了脂肪細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)水平，導(dǎo)致小鼠消瘦。GOS2參與TG的分解代謝[39]，某些藥物可通過(guò)下調(diào)大鼠中GOS2的表達(dá)來(lái)促進(jìn)脂肪分解達(dá)到減肥的目的[40]。本試驗(yàn)PLIN1和GOS2的過(guò)表達(dá)進(jìn)一步說(shuō)明了健康三益菌抑制了肉雞的脂肪分解。RBP7、CYP2C18、THEM4和GGT5也參與脂質(zhì)代謝，但其在肉雞體內(nèi)的調(diào)控作用尚且有待研究。

基于已鑒定的SDEGs，通過(guò)GO富集和KEGG通路富集探索健康三益菌對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。GO富集表示，LPL、SCD參與到對(duì)脂肪酸的反應(yīng)、乳糜微粒重構(gòu)以及對(duì)脂質(zhì)反應(yīng)的生物過(guò)程中；FABP3和FABP4參與白脂肪細(xì)胞分化以及長(zhǎng)鏈脂肪酸結(jié)合等過(guò)程。KEGG富集發(fā)現(xiàn)，PPAR信號(hào)通路是脂質(zhì)代謝的主要信號(hào)通路，脂肪沉積和轉(zhuǎn)運(yùn)基因(FABP3、FABP4、PLIN1、LPL、SCD)在此通路中富集，脂質(zhì)代謝相關(guān)SDEGs還富集于甾類(lèi)激素生物合成、亞油酸新陳代謝、不飽和脂肪酸的生物合成、脂肪細(xì)胞中的脂肪分解等脂肪沉積、分解相關(guān)通路。結(jié)果表明，健康三益菌通過(guò)調(diào)控以上通路促進(jìn)腸道對(duì)脂肪的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)并使肉雞脂肪生成和沉積增加。但SDEGs在以上通路中的具體作用機(jī)制尚不明確，且目前尚缺乏研究表明益生菌對(duì)肉雞脂質(zhì)代謝通路的影響，因此其具體調(diào)控機(jī)制需要進(jìn)一步的探索研究。

4 結(jié) 論

健康三益菌可通過(guò)調(diào)節(jié)LPL、PLIN1、GOS2、SCD、FABP3、FABP4、RBP7、THRSP、CYP7B1、CYP2C18、THEM4和GGT5等基因的表達(dá)以及PPAR信號(hào)通路、對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)等通路，可能促進(jìn)肉雞腸道對(duì)脂肪的吸收轉(zhuǎn)運(yùn)以及IMF沉積，抑制脂肪分解，降低腹脂含量，進(jìn)而影響肉雞脂質(zhì)代謝但不會(huì)引起過(guò)度肥胖。