豬子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白對(duì)胚胎附植的影響

匡婧靖，賀艷娟，胡 群，顧 婷，吳珍芳，蔡更元，洪林君

(華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 國(guó)家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣州 510642)

豬妊娠期胚胎死亡率高達(dá)30%～50%，其中大部分的妊娠失敗發(fā)生在胚胎附植期[1-2]，因此豬妊娠早期的胚胎附植是影響母豬產(chǎn)仔數(shù)提高的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。在胚胎附植期，當(dāng)母胎之間的信息分子交流不足時(shí)，則可能導(dǎo)致妊娠失敗[3]。豬胚胎附植期很長(zhǎng)，直到妊娠第15天胚胎才開(kāi)始與母體子宮內(nèi)膜相粘附，在此之前胚胎游離于子宮腔液中，因此，此時(shí)期胚胎與母體子宮間的物質(zhì)交流和信息傳遞主要依賴于子宮腔液中的物質(zhì)[4-5]，其中包括外泌體[6-8]。

外泌體(exosomes)是細(xì)胞向胞外釋放的一種直徑為30～150 nm，電鏡下觀察到形狀為杯口狀的微型囊泡[9]。它可以選擇性裝載蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、核酸等活性物質(zhì)，并將攜帶的物質(zhì)輸送到靶細(xì)胞內(nèi)，從而調(diào)控靶細(xì)胞的生物學(xué)功能[10-14]。研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動(dòng)物子宮腔液中富含的外泌體對(duì)胚胎附植發(fā)揮重要作用，外泌體中所含的蛋白質(zhì)等活性分子可作為母胎“對(duì)話”的信號(hào)分子調(diào)控胚胎附植[8,15-17]。Kusama等[18]發(fā)現(xiàn)，牛的子宮腔液外泌體中存在妊娠識(shí)別因子IFNT等蛋白調(diào)控子宮內(nèi)膜細(xì)胞的凋亡和黏附等過(guò)程；Greening等[14]發(fā)現(xiàn)，人子宮內(nèi)膜在妊娠期受到激素影響會(huì)釋放外泌體，外泌體會(huì)被滋養(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)化并增強(qiáng)其黏附能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物(tissue inhibitor of metalloproteinases，TIMPs)是基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)的天然抑制物，蛋白TIMP2(tissue inhibitor of metalloproteinases-2，TIMP2)屬于TIMPs中的一種，主要通過(guò)影響金屬蛋白酶MMPs的活性來(lái)調(diào)控細(xì)胞外基質(zhì)組織重構(gòu)、器官發(fā)生發(fā)育、血管形成、細(xì)胞遷移、細(xì)胞增殖以及細(xì)胞凋亡等生理過(guò)程[19-21]。豬胚胎附植過(guò)程中，胚胎形態(tài)發(fā)生劇烈變化，從妊娠第9天的球狀胚胎(直徑2～6 mm)迅速變成妊娠第12天的線狀胚胎(長(zhǎng)度大于100 mm)，這一過(guò)程的發(fā)生主要依賴胚胎細(xì)胞的增殖、遷移以及胞外基質(zhì)組織重構(gòu)[22]。最近研究發(fā)現(xiàn)，在子宮內(nèi)膜來(lái)源的外泌體中存在多種基質(zhì)金屬蛋白酶，且可能會(huì)通過(guò)外泌體轉(zhuǎn)移至胚胎細(xì)胞促進(jìn)胚胎附植[14,23]?；|(zhì)金屬蛋白酶的活性受基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物的調(diào)控，前期研究發(fā)現(xiàn)，基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制物TIMP2在豬胚胎附植期子宮腔液外泌體中表達(dá)，因此推測(cè)，子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白對(duì)豬胚胎附植發(fā)揮調(diào)控作用。

本試驗(yàn)將研究TIMP2蛋白在豬胚胎附植期子宮腔液外泌體中的表達(dá)規(guī)律，并通過(guò)體外細(xì)胞試驗(yàn)研究外泌體來(lái)源TIMP2蛋白對(duì)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移能力的影響，以期闡明豬子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白對(duì)胚胎附植的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬滋養(yǎng)層細(xì)胞系(porcine trophoblast PTr2)。胎牛血清，DMEM/F12培養(yǎng)基，胰蛋白酶(美國(guó)，Gibco)；Lipofectamine 3000 Transfection Reagent，Lipofectamine RNAimax Transfection Reagent，PowerUp SYBR Green Master Mix(美國(guó)，Thermo Fisher)；TRIzol，BCA蛋白定量試劑盒(美國(guó)，Invitrogen)；重組人胰島素(Insulin human recombinant)，Cell Counting Kit(CCK-8)(中國(guó)，翊圣)；BeyoClick EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(中國(guó)，碧云天)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)(日本，TaKaRa)；PVDF膜(美國(guó)，Millipore)；β-actin抗體(英國(guó)，Abcam)，TIMP2抗體(美國(guó)，bio-techne)；TIMP2超表達(dá)重組質(zhì)粒(pcDNA-TIMP2)及對(duì)照質(zhì)粒(pcDNA3.1)，TIMP2小干擾(si-TIMP2)及干擾對(duì)照(si-NC)(中國(guó)，吉瑪)。

1.2 豬子宮腔液和子宮組織的采集

挑選年齡和遺傳背景相似的健康大白母豬。通過(guò)對(duì)母豬進(jìn)行同期發(fā)情處理，觀察到發(fā)情并在當(dāng)天進(jìn)行輸精，記為第0天，輸精后1 d記為妊娠第1天，以此類推。取妊娠第9天(n=3)和第12天(n=3)的豬子宮，用PBS沖洗子宮并收集子宮腔液。在子宮內(nèi)側(cè)縱向打開(kāi)收集對(duì)應(yīng)子宮的子宮內(nèi)膜組織。將采集到的子宮腔液和子宮內(nèi)膜組織保存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 豬子宮腔液外泌體的分離與鑒定

在4 ℃條件下，豬子宮腔液依次進(jìn)行2 000×g離心20 min，10 000×g離心30 min，然后取上清液，再用超速冷凍離心機(jī)(美國(guó) BECKMAN，Optima XPN-100)，在100 000×g條件下離心2 h后棄上清，用適量PBS重懸沉淀。采用透射電鏡(TEM)分析外泌體形態(tài)結(jié)構(gòu)，將重懸后的PBS滴加到碳膜網(wǎng)格上2 min，用濾紙從網(wǎng)格的一端吸除多余的PBS，將網(wǎng)格板烘干后鈾染2 min，用濾紙吸除多余液體，室溫靜置過(guò)夜，再用透射電子顯微鏡系統(tǒng)分析拍照。使用納米粒徑分析儀對(duì)懸浮于PBS中的囊泡進(jìn)行納米顆粒粒徑分析。使用Western blot檢測(cè)外泌體的標(biāo)志蛋白CD9和CD63，方法同“1.8”。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)

采用含10%胎牛血清，1%雙抗和0.5%胰島素的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基培養(yǎng)PTr2，細(xì)胞置于5% CO2，37 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿培養(yǎng)皿80%時(shí)，用0.25%胰蛋白酶消化并按照1∶3比例傳代。

1.5 外泌體與PTr2細(xì)胞共培養(yǎng)

采用妊娠第12天的外泌體對(duì)PTr2細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，分為對(duì)照(PTr2+PBS)組和外泌體共培養(yǎng)(PTr2+P12-exo)組。首先檢測(cè)得到外泌體樣品總蛋白濃度，再將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PTr2細(xì)胞接種于6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，將已知濃度的外泌體加入外泌體共培養(yǎng)(PTr2+P12-exo)組，達(dá)到培養(yǎng)基中外泌體濃度為50 μg·mL-1，再將等量的PBS加入對(duì)照(PTr2+PBS)組。細(xì)胞放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞并提取蛋白及RNA用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.6 PTr2細(xì)胞轉(zhuǎn)染

TIMP2蛋白對(duì)PTr2細(xì)胞增殖和遷移能力影響試驗(yàn)分為空載體對(duì)照(pcDNA)組(轉(zhuǎn)染pcDNA3.1質(zhì)粒)和TIMP2超表達(dá)(pcDNA-TIMP2)組(轉(zhuǎn)染pcDNA-TIMP2質(zhì)粒)；干擾對(duì)照(si-NC)組(轉(zhuǎn)染si-NC)和TIMP2干擾(si-TIMP2)組(轉(zhuǎn)染si-TIMP2)。將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的PTr2細(xì)胞接種于6孔板中，過(guò)夜培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)到60%～70%時(shí)，用Lipofectamine 3000 Transfection Reagent根據(jù)試驗(yàn)分組將pcDNA 3.1空載體質(zhì)粒和pcDNA-TIMP2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中；再用Lipofectamine RNAimax Transfection Reagent根據(jù)試驗(yàn)分組將si-NC和si-TIMP2轉(zhuǎn)染進(jìn)細(xì)胞中，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.7 實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測(cè)TIMP2 mRNA的表達(dá)

利用 TRIzol提取轉(zhuǎn)染24 h后PTr2細(xì)胞中的RNA，紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度后用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再配制成qPCR反應(yīng)體系：上、下游引物(10 μmol·L-1)各0.2 μL，cDNA 300 ng，PowerUp SYBR Green Master Mix 5 μL，RNAase free ddH2O補(bǔ)至10 μL。所用引物序列見(jiàn)表1。在熒光定量PCR儀(美國(guó)，Life)上測(cè)定TIMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin作為內(nèi)參，按照2-ΔΔCt公式計(jì)算結(jié)果。

表1 各基因qPCR引物序列

1.8 Western blot(WB)檢測(cè)TIMP2蛋白水平

將轉(zhuǎn)染48 h的PTr2細(xì)胞和與外泌體共培養(yǎng)的PTr2細(xì)胞加入RIPA裂解液裂解細(xì)胞，外泌體則用超聲波裂解。將裂解液離心取上清液，采用BCA法測(cè)定蛋白濃度。之后用SDS-PAGE電泳儀(美國(guó)，Biorad)電泳分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，加入5%脫脂牛奶，常溫下?lián)u床封閉2.5 h，TBST洗滌后加入TIMP2抗體(CCL2119021 1∶1 000)和β-actin抗體(ab8226 1∶1 000)4 ℃孵育過(guò)夜，再用TBST洗滌，之后用相應(yīng)的二抗孵育2 h。利用化學(xué)發(fā)光液對(duì)目的蛋白條帶進(jìn)行顯色并采用Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.9 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活性

將PTr2細(xì)胞接種于96孔板中，參照“1.6”P(pán)Tr2細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行空載體對(duì)照(pcDNA)組、TIMP2超表達(dá)(pcDNA-TIMP2)組、干擾對(duì)照(si-NC)組和TIMP2干擾(si-TIMP2)組轉(zhuǎn)染，分別在轉(zhuǎn)染后24、48 h加入CCK-8試劑，37 ℃ 5% CO2條件下孵育2 h后在酶標(biāo)儀上測(cè)定450 nm處的吸光值。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.10 EdU試驗(yàn)檢測(cè)PTr2細(xì)胞的增殖

根據(jù)制造商說(shuō)明書(shū)，使用BeyoClick EdU-555細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒(中國(guó)，碧云天)分析細(xì)胞增殖情況。將細(xì)胞懸液接種于24孔板，參照“1.6”P(pán)Tr2細(xì)胞轉(zhuǎn)染方法進(jìn)行空載體對(duì)照(pcDNA)組、TIMP2超表達(dá)(pcDNA-TIMP2)組、干擾對(duì)照(si-NC)組和TIMP2干擾(si-TIMP2)組轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后，保留原有的500 μL培養(yǎng)基，再加入EdU試劑進(jìn)行孵育(具體步驟參考制造商說(shuō)明書(shū))，最后進(jìn)行熒光拍照，參考對(duì)照組比較EdU陽(yáng)性細(xì)胞比例。

1.11 劃痕試驗(yàn)檢測(cè)PTr2細(xì)胞的遷移能力

參照“1.6”P(pán)Tr2細(xì)胞轉(zhuǎn)染，進(jìn)行空載體對(duì)照組(pcDNA)、TIMP2超表達(dá)組(pcDNA-TIMP2)、干擾對(duì)照組(si-NC)和TIMP2干擾組(si-TIMP2)轉(zhuǎn)染。在細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后，用牙簽在細(xì)胞板上垂直劃出線狀劃痕，并將細(xì)胞培養(yǎng)基換為無(wú)血清的DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在0、12 和24 h觀察細(xì)胞遷移和劃痕愈合情況并拍攝照片。選取3個(gè)隨機(jī)視野利用Image J軟件計(jì)算愈合面積獲得細(xì)胞遷移率。

1.12 子宮內(nèi)膜免疫組織化學(xué)染色

子宮內(nèi)膜免疫組織化學(xué)染色步驟：1)石蠟切片常規(guī)脫蠟至水；2)在3%過(guò)氧化氫溶液中浸泡30 min；3)PBS中洗滌3次，每次5 min；4)在修復(fù)液中微波修復(fù)3次，室溫下自然冷卻；5)同步驟3；6)滴加5% BSA，37 ℃孵育20 min；6)滴加一抗(稀釋比例為1∶100)，濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，同時(shí)添加一組陰性對(duì)照(PBS替代一抗)；7)同步驟3；8)滴加二抗，37 ℃孵育25 min；9)同步驟3；10)滴加SABC，37 ℃孵育25 min；11)同步驟3；12)滴加DAB顯色試劑；13)蘇木素染液復(fù)染5～10 s，自來(lái)水沖洗，烘干，封片，顯微鏡拍照系統(tǒng)(日本 尼康)拍照。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

qRT-PCR、WB等結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean ± SD)”表示，用GraphPad Prism 8.0軟件分析數(shù)據(jù)并作圖，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 子宮腔液外泌體的分離與鑒定

將超速離心所得妊娠第9天(P9)和第12天(P12)的豬子宮腔液外泌體進(jìn)行透射電鏡觀察，呈典型杯狀，囊泡外周有膜性結(jié)構(gòu)(圖1A)。根據(jù)納米粒徑分析結(jié)果，提取的外泌體粒徑主要分布在30～150 nm之間(圖1B)。WB結(jié)果顯示，妊娠第9和第12天外泌體均存在特異性標(biāo)記蛋白CD9和CD63(圖1C)。

A.妊娠第9(P9)和第12天(P12)的豬子宮腔液外泌體透射電鏡圖，標(biāo)尺=100 nm；B.妊娠第9(P9)和第12天(P12)的豬子宮腔液外泌體粒徑大小分布圖；C.WB檢測(cè)妊娠第9(P9)和第12天(P12)的豬子宮腔液外泌體標(biāo)志蛋白CD9和CD63

2.2 子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白能靶向進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞

通過(guò)WB試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，妊娠第12天的豬子宮腔液外泌體中TIMP2蛋白含量顯著高于妊娠第9天(P<0.05)(圖2A，B)。為了研究子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白是否能夠進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞，用妊娠第12天子宮腔液外泌體孵育PTr2細(xì)胞，通過(guò)WB試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，外泌體孵育24 h后，PTr2細(xì)胞中TIMP2蛋白極顯著增加(P<0.01)(圖2C，D)。為了進(jìn)一步明確經(jīng)外泌體孵育后PTr2細(xì)胞中增加的TIMP2蛋白是由外泌體轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞的還是細(xì)胞自身轉(zhuǎn)錄翻譯的，通過(guò)qPCR檢測(cè)了經(jīng)外泌體孵育后PTr2細(xì)胞中的TIMP2 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TIMP2 mRNA相對(duì)表達(dá)量在外泌體孵育組(PTr2+P12-exo)和對(duì)照組(PTr2+PBS)中無(wú)顯著差異(P>0.05)(圖2E)。

A、B.WB檢測(cè)妊娠第12天(P12)的豬子宮腔液外泌體中TIMP2蛋白的表達(dá)量顯著高于妊娠第9天(P9)；C、D.WB檢測(cè)妊娠第12天外泌體孵育PTr2細(xì)胞(PTr2+P12-exo)相比對(duì)照組(PTr2+PBS)中TIMP2蛋白的相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高；E.qRT-PCR技術(shù)檢測(cè)妊娠第12天外泌體處理PTr2細(xì)胞(PTr2+P12-exo)和對(duì)照組(PTr2+PBS)中TIMP2 mRNA的相對(duì)表達(dá)量。ns.P>0.05，*.P<0.05，**.P<0.01，***.P<0.001，下同

2.3 TIMP2蛋白在妊娠早期的豬子宮內(nèi)膜中的表達(dá)定位

為了探究子宮腔液外泌體中TIMP2蛋白的來(lái)源，在大白豬妊娠第9(P9)和第12天(P12)的子宮內(nèi)膜中開(kāi)展了免疫組化試驗(yàn)，結(jié)果顯示TIMP2蛋白在大白豬妊娠第9和第12天的子宮內(nèi)膜中均存在，包括子宮內(nèi)膜上皮(endometrial luminal epithelium LE)、腺體(glandular epithelium GE)和基質(zhì)(endometrial stroma)等(圖3A)。同時(shí)該蛋白在妊娠第12天的胚胎(trophoblast Tr)中也大量存在(圖3A)。進(jìn)一步對(duì)TIMP2蛋白的表達(dá)量進(jìn)行光密度檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)相比妊娠第9天，妊娠第12天的子宮內(nèi)膜中TIMP2蛋白的含量極顯著升高(P<0.01)(圖3B)。

A.免疫組化顯示TIMP2蛋白在妊娠第9(P9)和第12天(P12)的子宮內(nèi)膜中均存在，如子宮內(nèi)膜上皮(LE)中，腺體(GE)等，同時(shí)該蛋白在妊娠第12天(P12)的胚胎(Tr)中也大量存在；B.TIMP2蛋白在兩個(gè)時(shí)期子宮內(nèi)膜上的光密度檢測(cè)

2.4 TIMP2超表達(dá)對(duì)PTr2細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

采用qRT-PCR法對(duì)TIMP2的超表達(dá)效率進(jìn)行分析，與空載體對(duì)照(pcDNA)組相比，TIMP2超表達(dá)(pcDNA-TIMP2)組的PTr2細(xì)胞中TIMP2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著升高(P<0.001)(圖4A)。WB結(jié)果顯示，與空載體對(duì)照組相比，TIMP2超表達(dá)組的PTr2細(xì)胞中TIMP2蛋白相對(duì)表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)(圖4B，C)。CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，TIMP2超表達(dá)組細(xì)胞增殖能力極顯著降低(P<0.01，圖4D)，EdU試驗(yàn)結(jié)果也顯示，TIMP2超表達(dá)組細(xì)胞增殖能力極顯著降低(P<0.01，圖4E，F(xiàn))，與CCK-8試驗(yàn)結(jié)果相一致。通過(guò)劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與空載體對(duì)照組相比，TIMP2超表達(dá)組的PTr2細(xì)胞的遷移能力顯著降低(P<0.05，圖4G，H)。

A.超表達(dá)后TIMP2 mRNA表達(dá)水平；B、C.超表達(dá)后TIMP2蛋白表達(dá)水平；D、E、F.超表達(dá)后PTr2細(xì)胞的增殖能力極顯著下降；G、H.超表達(dá)后PTr2細(xì)胞的遷移能力顯著下降

2.5 干擾TIMP2對(duì)PTr2細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

采用qRT-PCR法對(duì)TIMP2的干擾效率進(jìn)行分析，與干擾對(duì)照(si-NC)組相比，TIMP2干擾(si-TIMP2)組的PTr2細(xì)胞中TIMP2的mRNA相對(duì)表達(dá)水平極顯著下降(P<0.001)(圖5A)。WB結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，干擾組PTr2細(xì)胞中TIMP2蛋白相對(duì)表達(dá)水平極顯著降低(P<0.001)(圖5B，C)。CCK-8細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，干擾組細(xì)胞增殖能力極顯著增強(qiáng)(P<0.01，圖5D)，EdU試驗(yàn)結(jié)果也顯示，干擾組細(xì)胞增殖能力極顯著增強(qiáng)(P<0.01，圖5E，F(xiàn))，與CCK-8試驗(yàn)結(jié)果相一致。通過(guò)劃痕試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，干擾組PTr2細(xì)胞的遷移能力顯著增強(qiáng)(P<0.05，圖5G，H)。

A.干擾后TIMP2 mRNA表達(dá)水平；B、C.干擾后TIMP2蛋白表達(dá)水平；D、E、F.干擾后PTr2細(xì)胞的增殖能力極顯著提高；G、H.干擾后PTr2細(xì)胞的遷移能力顯著提高

3 討 論

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明子宮腔液外泌體能攜帶母體子宮來(lái)源的RNA、蛋白等相關(guān)活性分子靶向運(yùn)輸?shù)脚咛ゼ?xì)胞，對(duì)胚胎發(fā)育及胚胎附植發(fā)揮重要調(diào)控作用[6,10,14,18,23-24]。但在豬中，目前還未發(fā)現(xiàn)有子宮腔液外泌體蛋白功能相關(guān)的研究。本試驗(yàn)通過(guò)分離鑒定豬胚胎附植期子宮腔液外泌體，研究了外泌體蛋白TIMP2的來(lái)源及其對(duì)胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的功能。

通過(guò)超速離心法成功從子宮腔液分離到外泌體，經(jīng)電鏡試驗(yàn)、粒徑分析以及標(biāo)志蛋白檢測(cè)鑒定了外泌體的質(zhì)量和純度都符合要求，并與前人的研究結(jié)果相吻合[25-26]。通過(guò)WB試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)妊娠第12天子宮腔液外泌體中TIMP2蛋白的含量顯著高于妊娠第9天。妊娠第12天是豬胚胎附植的“窗口期”，此時(shí)胚胎開(kāi)始分泌妊娠識(shí)別信號(hào)分子——雌激素，在雌激素作用下子宮內(nèi)膜進(jìn)入“容受態(tài)”，其血管增多，分泌能力增強(qiáng)，從而為胚胎的附植做好準(zhǔn)備[3,27]。妊娠第12天子宮腔液外泌體中TIMP2蛋白含量顯著高于妊娠第9天，可能與妊娠第12天子宮內(nèi)膜的分泌能力增強(qiáng)有關(guān)。另外，免疫組化試驗(yàn)結(jié)果顯示，TIMP2蛋白在妊娠第12天子宮內(nèi)膜中的表達(dá)量顯著高于妊娠第9天，說(shuō)明子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白可能是由子宮內(nèi)膜所分泌。近期有研究也表明，小鼠胚胎附植期子宮腔液外泌體來(lái)源于子宮內(nèi)膜，且主要由子宮內(nèi)膜腔上皮和腺上皮所分泌[28]。

為了進(jìn)一步研究子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白能夠通過(guò)外泌體靶向運(yùn)輸?shù)脚咛プ甜B(yǎng)層細(xì)胞內(nèi)發(fā)揮功能，用妊娠第12天子宮腔液外泌體孵育胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞后提取滋養(yǎng)層細(xì)胞的蛋白和RNA，分別檢測(cè)TIMP2蛋白及TIMP2 mRNA在外泌體孵育前后的表達(dá)量變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TIMP2蛋白在外泌體孵育滋養(yǎng)層細(xì)胞后顯著升高，而TIMP2 mRNA表達(dá)量卻未發(fā)生顯著變化，因此，推測(cè)滋養(yǎng)層細(xì)胞中顯著升高的TIMP2蛋白可能是由外泌體攜帶進(jìn)入細(xì)胞的，而不是由細(xì)胞本身轉(zhuǎn)錄翻譯而來(lái)。TIMP2蛋白是金屬蛋白酶抑制劑，已有研究表明，TIMP2蛋白對(duì)哺乳動(dòng)物胚胎附植及妊娠維持發(fā)揮重要調(diào)控作用，它能通過(guò)抑制基質(zhì)金屬蛋白酶MMPs的活性來(lái)阻止層聯(lián)蛋白和膠原蛋白的降解，從而改變子宮內(nèi)膜細(xì)胞以及胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲的能力[29-32]。此外，TIMP2蛋白還能調(diào)控子宮內(nèi)膜的容受性[14]，并與子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生有關(guān)[33]。為了研究外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞后所發(fā)揮的功能，通過(guò)在滋養(yǎng)層細(xì)胞中過(guò)表達(dá)和抑制表達(dá)TIMP2基因來(lái)分析其對(duì)滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移能力的影響。CCK-8檢測(cè)、EdU試驗(yàn)以及細(xì)胞劃痕試驗(yàn)均表明，TIMP2蛋白能抑制胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移。這與前人研究發(fā)現(xiàn)的TIMP2能通過(guò)抑制金屬蛋白酶MMPs的活性來(lái)抑制細(xì)胞的增殖和遷移相一致[34]，以上結(jié)果表明，在豬胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞中TIMP2蛋白可能也是通過(guò)抑制金屬蛋白酶的活性來(lái)抑制胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移的。妊娠第12天豬胚胎已從球狀變成了絲狀，胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞即將與子宮內(nèi)膜腔上皮細(xì)胞相粘附并完成胚胎附植[35]，子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白進(jìn)入胚胎細(xì)胞并抑制胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞的增殖和遷移，可能起到避免胚胎形態(tài)進(jìn)一步發(fā)生巨變的作用，使胚胎處于一種相對(duì)穩(wěn)定的狀態(tài)，為接下來(lái)與母體子宮內(nèi)膜相粘附并完成附植做好準(zhǔn)備。后續(xù)將針對(duì)TIMP2蛋白調(diào)控胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞增殖和遷移的分子機(jī)制進(jìn)行深入研究，并可以小鼠為模型，利用子宮角注射試驗(yàn)，驗(yàn)證TIMP2蛋白對(duì)小鼠胚胎附植率的影響。

4 結(jié) 論

本研究結(jié)果表明，子宮腔液外泌體來(lái)源的TIMP2蛋白可能由母體子宮所分泌，并能通過(guò)外泌體靶向進(jìn)入胚胎滋養(yǎng)層細(xì)胞調(diào)控細(xì)胞的增殖和遷移，進(jìn)而對(duì)豬胚胎附植發(fā)揮調(diào)控作用。