泌乳階段和處理溫度對(duì)驢乳中溶菌酶活性的影響

王 涵，胡玉玲，趙晨坤，楊志鵬，曾申明*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，北京 100193；2.張家口桑陽牧業(yè)有限公司，張家口 075831)

溶菌酶(lysozyme)是一種糖苷水解酶，能催化細(xì)胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之間的β-1,4糖苷鍵水解，使細(xì)胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細(xì)胞壁破裂，內(nèi)容物逸出而使細(xì)菌溶解[1]。溶菌酶作為機(jī)體天然免疫系統(tǒng)的一部分，存在于多種分泌物(眼淚、唾液、尿液、黏液和乳汁等)中，也可由巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞合成并分泌[2]。在體外試驗(yàn)中，溶菌酶顯示出抗酸性并且能夠不被人體腸道酶類降解[3]。同時(shí)，溶菌酶也具有抗炎及抗腫瘤作用[4-6]。Jiang等[7]報(bào)道了口服驢乳溶菌酶可改善結(jié)腸炎小鼠的體重減輕、結(jié)腸損傷和黏膜炎等癥狀。Ozturkoglu-Budak等[8]將驢乳中提取的溶菌酶和乳鐵蛋白作為天然的食品添加劑添加到奶酪中可以減少其中的微生物含量并提升產(chǎn)品質(zhì)量。通過蛋白質(zhì)含量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，非反芻動(dòng)物的乳汁中溶菌酶的含量顯著高于反芻動(dòng)物，牛奶、羊奶中的溶菌酶含量極低，而驢乳中富含溶菌酶且其含量高于人乳[9]。因此，富含溶菌酶的驢乳可作為一種珍貴的保健品供人們飲用。另外，研究認(rèn)為驢乳可作為人乳珍貴的替代品，而且可以代替牛奶來減少過敏情況的發(fā)生[10-12]。人們通常認(rèn)為馬屬動(dòng)物的泌乳期為6個(gè)月，而在實(shí)際生產(chǎn)中，如不采取斷奶措施，母驢分娩后第10個(gè)月仍可泌乳。Martini等[13]檢測(cè)了第3、6、9泌乳月驢乳中的溶菌酶活性，Pilla等[14]從0～8月每隔2個(gè)月檢測(cè)一次驢乳中的溶菌酶活性。但目前母驢一個(gè)泌乳周期的不同泌乳階段以及泌乳水平對(duì)乳中溶菌酶活性的影響尚不清楚。

巴氏滅菌法常用來加工生乳以延長其保質(zhì)期，它是指將乳加熱到62～65 ℃并保持30 min或者加熱到75～90 ℃并保持15～16 s[15]。而常溫保存奶通常使用超高溫瞬時(shí)滅菌技術(shù)，即將鮮奶在封閉系統(tǒng)中加熱到120 ℃以上并持續(xù)幾秒鐘后，迅速冷卻至室溫的一種殺菌方法，用此方法能使生乳保質(zhì)期延長至6個(gè)月。前人通過測(cè)定凍干[16]、新鮮、冷凍[17]、超高壓均質(zhì)和巴氏殺菌[18]驢奶中溶菌酶的酶活性，發(fā)現(xiàn)較高的加工溫度不適合維持驢乳的溶菌酶活性。然而，不同的研究得出的結(jié)論并不一致，有人發(fā)現(xiàn)驢乳分別在75 ℃和85 ℃[18]、90 ℃[19]加熱1 min對(duì)溶菌酶活性無顯著影響，而Polidori和Vincenzetti[17]指出，當(dāng)加工溫度高于70 ℃時(shí)溶菌酶開始失活。因此，何種處理溫度能最大程度保留驢乳中的溶菌酶活性是驢乳加工過程中急待解決的問題。

針對(duì)以上問題，本試驗(yàn)主要研究母驢在同一泌乳周期的不同泌乳階段、不同泌乳水平和不同加工溫度對(duì)驢乳中溶菌酶活性的影響，旨在為驢乳生產(chǎn)和加工技術(shù)研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及乳樣采集

本試驗(yàn)是在張家口桑陽牧業(yè)有限公司實(shí)施，試驗(yàn)動(dòng)物為陽原驢，年齡為4～9歲。

根據(jù)母驢日平均產(chǎn)奶量水平分為低(400 g以下)、中(400～1 000 g)、高(1 000 g以上)3組，每組隨機(jī)挑選3頭作為試驗(yàn)動(dòng)物。從母驢產(chǎn)駒后第3個(gè)月的第1天開始，連續(xù)取樣7 d，到第10個(gè)泌乳月結(jié)束。擠奶前母驢與驢駒在每天固定的時(shí)間進(jìn)行隔離，第2～6個(gè)泌乳月母仔在擠奶前分離4 h，從第7～10個(gè)泌乳月開始母仔在擠奶前分離7 h，每天定時(shí)在下午3點(diǎn)擠奶取樣。試驗(yàn)中的新鮮牛、綿羊乳均取自附近的牧場(chǎng)的混合乳樣，連續(xù)取樣3 d。本試驗(yàn)使用的混合乳樣均為從牧場(chǎng)中所有泌乳母畜的混合乳中取到的乳樣。采集到的乳樣置于經(jīng)高壓蒸汽滅菌的潔凈帶蓋子的離心管中，4 ℃保存，于取樣當(dāng)天測(cè)定溶菌酶活性。

1.2 驢乳的熱處理方法

將當(dāng)天采集到的每頭母驢的乳樣混合后進(jìn)行不同溫度的巴氏滅菌處理(HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州越新儀器制造有限公司)?；旌先闃臃譃?份，其中1份為生乳，其余5份分別于62 ℃加熱30 min，72、77、82、87 ℃分別加熱15 s，加熱處理后的奶樣立刻冷卻至室溫后進(jìn)行溶菌酶活性的檢測(cè)，重復(fù)5 d。

1.3 溶菌酶活性檢測(cè)方法

溶菌酶活性檢測(cè)按照試劑盒(Sigma，LY0100)說明書進(jìn)行，本試驗(yàn)采用的檢測(cè)方法是在比濁法的基礎(chǔ)上經(jīng)改良后適用于乳中溶菌酶活性的檢測(cè)，簡要來說，將采集到的乳樣進(jìn)行2 000 r·min-1離心15 min，即脫脂處理，取適量上清液用反應(yīng)緩沖液稀釋30倍后進(jìn)行測(cè)定。將721型可見光分光光度計(jì)(721G可見光分光光度計(jì)，上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)提前打開預(yù)熱，稱取適量的溶壁微球菌凍干粉末于潔凈試管中，加入平衡至室溫的反應(yīng)緩沖液進(jìn)行稀釋，使其在450 nm處的吸光度為0.6～0.7。測(cè)定時(shí)先在比色皿中加入2 mL反應(yīng)緩沖液對(duì)分光光度計(jì)進(jìn)行調(diào)零，另取兩只比色皿分別加入2 mL菌液，讀取此時(shí)的吸光度數(shù)值為A4500 min，然后分別加入75 μL的反應(yīng)緩沖液以及乳樣稀釋液，分別作為空白對(duì)照組及試驗(yàn)組，迅速混勻，反應(yīng)2 min后再次讀取吸光度數(shù)值為A4502 min，最后根據(jù)如下公式進(jìn)行計(jì)算即可得出該乳樣中的溶菌酶活性。

酶活計(jì)算公式：

ΔA450/min Test=

試驗(yàn)組(A4500 min-A4502 min)/2；

ΔA450/min Blank=

空白對(duì)照組(A4500 min-A4502 min)/2；

奶樣稀釋倍數(shù)為30；0.001為一個(gè)溶菌酶活性單位；加入奶樣的體積為0.075 mL；2指反應(yīng)時(shí)間2 min。

活性單位定義：一個(gè)單位表示在25 ℃，pH6.24的條件下，以溶壁微球菌為底物，ΔA450每分鐘改變0.001。本試驗(yàn)中溶菌酶活性均以“U·mL-1”表示。

每個(gè)乳樣都設(shè)兩次技術(shù)重復(fù)，取兩次試驗(yàn)結(jié)果的平均值作為該乳樣的溶菌酶活性值。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)中的數(shù)據(jù)使用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，方差齊性檢驗(yàn)。采用單因素方差分析(ANOVA)進(jìn)行組間兩兩比較(LSD)，檢驗(yàn)水平以P<0.05為差異顯著。

2 結(jié) 果

2.1 驢乳、牛乳、綿羊乳中溶菌酶活性的比較

驢、牛、綿羊鮮乳中溶菌酶活性值見表1，結(jié)果顯示驢乳中溶菌酶活性顯著高于牛、羊乳(P<0.05)，而后兩者間無顯著差異(P>0.05)。該部分試驗(yàn)中所用的乳樣均為連續(xù)3 d在試驗(yàn)當(dāng)天從各個(gè)牧場(chǎng)(母驢35頭、奶牛20頭、綿羊32只)取得的混合新鮮乳樣。

表1 奶牛、綿羊和驢乳中的溶菌酶活性比較

2.2 母驢不同泌乳月對(duì)驢乳中溶菌酶活性的影響

不同泌乳月驢乳中的溶菌酶活性見表2，結(jié)果顯示以泌乳月劃分，3、5、8、9、10月間溶菌酶活性無顯著差異(P>0.05)，但皆顯著高于4、6、7月(P<0.05)，其中第7個(gè)泌乳月驢乳中溶菌酶活性最低，第8個(gè)泌乳月最高。

表2 母驢不同泌乳月對(duì)乳中溶菌酶活性的影響

2.3 日均泌乳水平對(duì)溶菌酶活性的影響

表3結(jié)果顯示，日均泌乳水平對(duì)溶菌酶活性無顯著影響(P>0.05)，且高產(chǎn)母驢同時(shí)具有較高溶菌酶活性的趨勢(shì)。

表3 不同泌乳水平的母驢乳中溶菌酶活性的比較

2.4 不同處理溫度對(duì)驢乳中溶菌酶活性的影響

生驢乳經(jīng)過不同溫度的熱處理后，溶菌酶活性的變化如圖1所示，其中，62 ℃加熱30 min后，溶菌酶活性與生乳無顯著差異(P>0.05)，而且有升高的趨勢(shì)。但當(dāng)溫度升高至72 ℃時(shí)，溶菌酶活性開始顯著下降(P<0.05)，在77～87 ℃范圍內(nèi)，溶菌酶活性無顯著差異(P>0.05)，酶活下降到生乳的35%～45%。

將5份不同天取到的乳樣分為6個(gè)處理組進(jìn)行處理

3 討 論

根據(jù)蛋白含量的測(cè)定，牛乳(1.02×10-5g·L-1)[20]、羊乳(7.66×10-6g·L-1)[21]中含有極少量的溶菌酶，而馬乳(1.03 g·L-1)[22]、驢乳(0.94 g·L-1)[23]和人乳(0.1～0.89 g·L-1)[24]中均含有較多的溶菌酶。本研究通過溶菌酶活性的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，驢乳中的溶菌酶活性顯著高于奶牛和綿羊乳，與上述結(jié)果基本一致。

前人的研究發(fā)現(xiàn)，驢乳中的溶菌酶活性值變化較大。例如，Conte等[25]報(bào)道的溶菌酶活性值從5 800 U·mL-1到2 740 U·mL-1，而Pilla等[14]報(bào)道的溶菌酶活性水平約為4 000～5 000 U·mL-1，有時(shí)高達(dá)7 000 U·mL-1。Yvon等[26]報(bào)道的溶菌酶活性值水平較高約為17 900 U·mL-1。Addo和Ferragut[18]報(bào)道的溶菌酶活性值從11 000 U·mL-1到15 000 U·mL-1，本研究的結(jié)果與此報(bào)道最為接近。而Martini等[13]檢測(cè)到的溶菌酶活性較低為1 433～1 842 U·mL-1。出現(xiàn)這種差異可能是由于驢品種、地理位置的不同或者驢乳樣品保存方式的不同。盡管有關(guān)泌乳階段對(duì)驢乳中溶菌酶活性的影響的研究較少，而且溶菌酶活性數(shù)值相差較大，但都發(fā)現(xiàn)溶菌酶活性在不同的泌乳月份表現(xiàn)出差異。Martini等[13]的研究結(jié)果顯示，第3個(gè)泌乳月驢乳中溶菌酶活性最高，而第6月最低；Pilla等[14]檢測(cè)出第6～8月最低，0～6以及8月以上無明顯差異。本研究的結(jié)果是第6、7月最低，其他月份無顯著差異。這3項(xiàng)研究結(jié)果基本一致，即在泌乳過程中驢乳中溶菌酶活性存在波動(dòng)，因此需要進(jìn)一步的研究確定引起驢乳中溶菌酶活性變化的原因。L?nnerdal等[27]的研究發(fā)現(xiàn)，人乳中溶菌酶濃度與泌乳階段有關(guān)，初乳中溶菌酶的濃度最低，以后逐漸增加，在31～60天達(dá)到峰值，隨后下降。而在另外的一項(xiàng)研究中，初乳中溶菌酶濃度較高，在分娩后的第1個(gè)月逐漸下降，隨后開始上升并在第57～84天達(dá)到峰值[28]。Koenig等[29]報(bào)道，人初乳中的溶菌酶濃度較低，并在泌乳過程中逐漸增加，母乳中溶菌酶的濃度在哺乳第2個(gè)月后顯著增加，提示這種酶在哺乳后期抵抗感染中起著重要作用。本研究結(jié)果顯示，母驢在整個(gè)泌乳期間驢乳中的溶菌酶活性一直維持在較高水平，受泌乳階段的影響較小。

本研究發(fā)現(xiàn)，驢乳中溶菌酶活性不受母驢產(chǎn)奶性能高低的影響，而且存在產(chǎn)奶量和溶菌酶活性都較高的母驢，這些母驢可作為優(yōu)良的遺傳資源，可對(duì)其溶菌酶合成相關(guān)基因進(jìn)行研究，篩選出相關(guān)分子標(biāo)記，以培育可穩(wěn)定遺傳該優(yōu)良性狀的母驢品系。

驢乳中的溶菌酶作為一種重要的活性物質(zhì)，在加工處理時(shí)需要被保留下來。溶菌酶通常是耐熱的，只有在高溫處理時(shí)才出現(xiàn)變性，Polidori和Vincenzetti[17]指出，溶菌酶在4～50 ℃具有很好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)溫度高于70 ℃時(shí)，溶菌酶開始變性失活。有人檢測(cè)了新鮮和處理過的驢奶以及冷凍儲(chǔ)存期間溶菌酶含量和活性的變化。Vincenzetti 等[16]提到，鮮奶中的溶菌酶含量高于相同的凍干樣品。驢乳溶菌酶的熱穩(wěn)定性也被其他研究人員不同程度地證實(shí)。巴氏殺菌(63 ℃，30 min)對(duì)溶菌酶的抗菌活性沒有顯著影響[30]。而Sousa等[31]的研究中指出，62.5 ℃加熱30 min會(huì)導(dǎo)致人乳中高達(dá)44%溶菌酶活性的大量流失。Coppola等[19]發(fā)現(xiàn)，90 ℃處理1 min對(duì)驢乳溶菌酶活性無顯著影響，而在121 ℃處理10 min后溶菌酶失活。Addo和Ferragut[18]將生驢乳分別在75、85 ℃加熱1 min，并在4 ℃保存28 d，期間每7 d檢測(cè)一次溶菌酶活性，發(fā)現(xiàn)75、85 ℃加熱1 min對(duì)溶菌酶活性無顯著影響。在本研究中，62 ℃處理30 min的驢乳可最大程度保留溶菌酶的活性，且高于生乳中的酶活性，有可能是因?yàn)楦邷靥幚砟茉谝欢ǔ潭壬霞せ钊芫?。?dāng)溫度上升至72 ℃時(shí)，溶菌酶活性開始出現(xiàn)下降，但仍然具有較高的活性，但當(dāng)溫度升高至77～87 ℃加熱15 s時(shí)，溶菌酶活性下降至生乳的35%～45%。出現(xiàn)這些差異的原因還不清楚，本試驗(yàn)不是在工業(yè)化生產(chǎn)條件下進(jìn)行，在樣品處理過程中可能會(huì)出現(xiàn)乳樣局部熱處理時(shí)間過長而影響酶活性。

從本研究的結(jié)果來看，為維持驢乳中溶菌酶活性的穩(wěn)定，最理想的熱處理?xiàng)l件是62 ℃處理30 min。然而，在生產(chǎn)實(shí)際中該加工方法成本高、保質(zhì)期短且要求4 ℃冷藏運(yùn)輸，因此驢乳產(chǎn)業(yè)急需一種或多種乳加工方式來保持溶菌酶的活性而降低有害菌的數(shù)量，如采用膜過濾和超高壓均質(zhì)技術(shù)等。

4 結(jié) 論

驢乳中溶菌酶的活性較高，且不受泌乳階段和泌乳量水平的影響；驢乳在62 ℃處理30 min對(duì)其中溶菌酶活性無影響，可為乳品加工工藝的設(shè)計(jì)提供參考。