表面增強(qiáng)拉曼光譜法測(cè)定牛奶中青霉素G 鈉的殘留量

梁營(yíng)芳,周化嵐,張建國(guó),王 鋒,李曉迪,王樂惠

(上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院,上海 200093)

β-內(nèi)酰胺類抗生素是指分子中含有β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構(gòu)的一類抗菌藥,具有殺菌活性強(qiáng)、毒性低、適應(yīng)證廣等諸多優(yōu)點(diǎn)[1]。青霉素G 鈉(NaBP)是一種具有代表性的β-內(nèi)酰胺類化合物,在臨床醫(yī)學(xué)、獸醫(yī)學(xué)和飼料添加劑等方面得到了廣泛的應(yīng)用[2]。該抗生素被專門用于治療奶牛的乳腺炎,因此在鮮奶和乳制品中會(huì)有相應(yīng)殘留[3]。

青霉素G 鈉的非法使用或者濫用會(huì)導(dǎo)致其出現(xiàn)在食物鏈中,并最終影響消費(fèi)者健康并造成環(huán)境污染。目前,世界上許多國(guó)家正在預(yù)防和管理這一問題,許多組織規(guī)定了青霉素G 鈉的殘留限量。1999年,歐盟(EU)第508/1999號(hào)條例規(guī)定了牛奶中青霉素的殘留限量為4μg·kg－1或1.2×10－8mol·L－1[4],美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局規(guī)定牛乳中青霉素G 的殘留限量為5×10－9IU·m L－1[5],中國(guó)農(nóng)業(yè)部于2006年發(fā)布公告《牛奶中青霉素類藥物殘留量的測(cè)定 高效液相色譜法》規(guī)定牛乳中青霉素G 的殘留限量為4μg·L－1[6]。

目前,測(cè)定青霉素G 鈉的方法主要有氣相色譜法、高效液相色譜法、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、微生物法等[6-8]。但是在實(shí)際操作中,這些常用的方法存在設(shè)備昂貴、樣品制備復(fù)雜、操作耗時(shí)等局限性。因此,開發(fā)一種低成本、靈敏、簡(jiǎn)便、快速的測(cè)定方法是十分必要的。

表面增強(qiáng)拉曼光譜(SERS)是一種與納米尺度效應(yīng)相關(guān)的拉曼散射現(xiàn)象。一般情況下,樣品的拉曼信號(hào)非常微弱。但當(dāng)待測(cè)樣品吸附于具有納米量級(jí)粗糙度的金屬(常用金或銀)結(jié)構(gòu)表面時(shí),樣品的拉曼信號(hào)將得到極大的增強(qiáng)[9]。SERS因具有靈敏度高、響應(yīng)迅速、無標(biāo)記以及“指紋”識(shí)別等特點(diǎn),在快速檢測(cè)抗生素等方面具有較大的應(yīng)用前景。文獻(xiàn)[10]以銀納米粒子(Ag NPs)為基底,通過SERS檢測(cè)方法對(duì)青霉酸進(jìn)行了表征和定量分析,滿足了實(shí)際應(yīng)用中的靈敏度要求。文獻(xiàn)[11]以單分散磁性高分子微球?yàn)檩d體,合成了一種新的SERS平臺(tái)。該方法用于檢測(cè)低水平抗生素阿莫西林的殘留,檢出限為10－8mol·L－1。在上述文獻(xiàn)基礎(chǔ)上,本工作以合成的Ag NPs 為基底,硫酸鎂為凝聚劑,采用SERS測(cè)定牛奶中青霉素G 鈉的含量。

1 試驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

HORIBA Lab RAM HR Evolution型顯微共聚焦拉曼光譜儀;UV-1200型紫外-可見分光光度計(jì);Nova NanoSEM 450 型場(chǎng)發(fā)射掃描電子顯微鏡;PHS-3C型pH 計(jì);81-2型恒溫磁力攪拌器;Sigma-14 型高速離心機(jī);Spinplis-6 型低速離心機(jī);ML104/02型電子天平;TopPette型手動(dòng)單道移液槍;毛細(xì)管(100 nm,1.8～2.2 mm)。

硝酸銀的純度為99%,檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·2 H2O)的純度為99.8%,硫酸鎂的純度不小于98%,青霉素G 鈉的純度為99%,三氯乙酸的純度不小于99%;所用其他試劑均為分析純;試驗(yàn)用水為去離子水。

牛奶購(gòu)自上海市某超市,使用前放置于4 ℃冰箱;試驗(yàn)所用玻璃器皿用體積比為3∶1的鹽酸-硝酸混合液浸泡,并用水沖洗。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 銀溶膠的制備

參考文獻(xiàn)[12]中方法,采用經(jīng)典的化學(xué)還原法制備銀溶膠。將0.036 g硝酸銀溶于200 mL水中,加熱至98 ℃。然后在沸騰的硝酸銀溶液中快速加入4 mL 1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))檸檬酸鈉溶液,并劇烈攪拌。持續(xù)加熱40 min后,得到灰綠色膠體溶液,粒徑約為60 nm。將其自然冷卻,保存于4 ℃冰箱中進(jìn)行下一步研究。

1.2.2 SERS樣品的制備

取上述銀溶膠30 mL,以轉(zhuǎn)速5 000 r·min－1離心10 min,去除上清液以獲得濃縮的Ag NPs(約3 mL)。將濃縮的AgNPs20μL與不同濃度(1×10－9～1×10－1mol·L－1)的青霉素G 鈉溶液(pH 6)20μL 混合10 s。將上述混合溶液與1×10－2mol·L－1硫酸鎂溶液8μL 混合10 s,膠體顏色迅速變?yōu)樯罨疑Ｗ詈?將得到的膠體注入毛細(xì)管中進(jìn)行SERS檢測(cè)。

1.2.3 牛奶中青霉素G 鈉的SERS檢測(cè)

以牛奶為檢測(cè)對(duì)象,參考文獻(xiàn)[13]中方法對(duì)樣品進(jìn)行預(yù)處理,去除牛奶中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)。在20 mL牛奶樣品中加入0.5 mL 三氯乙酸,混合超聲30 min,再以轉(zhuǎn)速5 000 r·min－1離心30 min,得到上清液即除去了牛奶中的蛋白質(zhì)。上清液經(jīng)0.22μm 的聚偏二氟乙烯(PVDF)膜過濾,除去牛奶中的脂質(zhì),所得濾液于4 ℃保存。將樣品制備成含不同濃度(1×10－6～1×10－3mol·L－1)青霉素G鈉的加標(biāo)樣品。

1.2.4 SERS光譜采集

對(duì)顯微共聚焦拉曼光譜儀參數(shù)進(jìn)行設(shè)置:激光波長(zhǎng)633 nm,掃描光譜波段500～2 000 cm－1,積分時(shí)間10 s,積分平均2次,平滑度1。為提高SERS譜圖的重復(fù)性,每個(gè)樣品測(cè)試過程中,隨機(jī)在基底上采集5個(gè)不同的點(diǎn)分別獲得譜圖,取其平均值進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 AgNPs的表征

圖1 為不同Ag NPs樣品的掃描電子顯微鏡(SEM)圖像和紫外-可見吸收光譜。在圖1(a)中,可以觀察到合成的Ag NPs大部分呈球形,粒徑為60 nm 左右。濃縮AgNPs中添加青霉素G 鈉溶液后的SEM 圖像如圖1(b)所示。隨著硫酸鎂溶液的加入,Ag NPs表現(xiàn)出明顯的聚集性,說明硫酸鎂溶液是一種有效的凝聚劑,如圖1(c)所示。圖1(d)中顯示了不同Ag NPs 樣品的紫外-可見吸收光譜。Ag NPs的最大吸收波長(zhǎng)(曲線1)位于422 nm 處,同時(shí)也表明該溶液中存在平均粒徑為60 nm 的球形納米粒子。加入青霉素G 鈉后,Ag NPs的局域表面等離子共振(LSPR)最大吸收峰略有紅移,Ag NPs的最大吸收波長(zhǎng)為424 nm(曲線2),這是由于青霉素G 鈉分子會(huì)導(dǎo)致Ag NPs發(fā)生輕微聚集。進(jìn)一步添加硫酸鎂溶液后,Ag NPs的最大吸收波長(zhǎng)從422 nm 明顯移動(dòng)到426 nm,表明硫酸鎂溶液會(huì)導(dǎo)致Ag NPs發(fā)生明顯聚集(曲線3)。該結(jié)果與SEM 測(cè)量結(jié)果一致。

圖1 不同Ag NPs樣品的SEM 圖像和紫外-可見吸收光譜Fig.1 SEM images and UV-Vis absorption spectra of different Ag NPs samples

2.2 青霉素G 鈉的拉曼光譜及其歸屬

圖2為青霉素G 鈉的固體粉末(曲線1)和水溶液(曲線2)的常規(guī)拉曼光譜,吸附在Ag NPs上的SERS 光譜(曲線4)以及加入硫酸鎂凝聚劑的SERS光譜(曲線3)。青霉素G 鈉固體粉末的常規(guī)拉曼光譜強(qiáng)度明顯高于水溶液。在固體粉末常規(guī)拉曼光譜中,1 002 cm－1處的典型峰被確定為β-內(nèi)酰胺環(huán)和噻唑烷環(huán)的振動(dòng),包括β-內(nèi)酰胺環(huán)的拉伸振動(dòng)和兩個(gè)甲基(－CH3)的扭轉(zhuǎn)振動(dòng)[14]。583 cm－1處的另一個(gè)強(qiáng)峰被認(rèn)為是C－C(苯環(huán)和β-內(nèi)酰胺環(huán)之間的烷基鏈)的伸縮振動(dòng)和NH 的搖擺振動(dòng)[15]。1 583 cm－1和1 602 cm－1處的其他弱帶可歸因于C－C(苯基環(huán))的伸縮振動(dòng)。與青霉素G 鈉的常規(guī)拉曼光譜相比,吸附在Ag NPs上的青霉素G鈉SERS光譜在拉曼強(qiáng)度和拉曼位移上都存在顯著差異。吸附在Ag NPs上的青霉素G 鈉SERS光譜在583 cm－1的峰非常微弱,1 000 cm－1處的峰有2 cm－1的偏移。這些變化是由于Ag NPs對(duì)青霉素G 鈉分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)和噻唑烷環(huán)的電磁場(chǎng)、化學(xué)或電子增強(qiáng)效應(yīng)所致。

圖2 不同形式下的青霉素G 鈉的拉曼光譜Fig.2 Raman spectra of NaBP in different forms

2.3 硫酸鎂濃度對(duì)青霉素G 鈉溶液SERS增強(qiáng)的影響

凝聚劑硫酸鎂對(duì)青霉素G 鈉的SERS 增強(qiáng)起著至關(guān)重要的作用,硫酸鎂的濃度也對(duì)增強(qiáng)效果有很大影響。在不同濃度(1×10－3,1×10－2,1×10－1,1 mol·L－1)的硫酸鎂溶液中,1×10－2mol·L－1青霉素G 鈉溶液在Ag NPs基底上的SERS光譜如圖3所示。

由圖3 可知,當(dāng)硫酸鎂濃度為1×10－2mol·L－1時(shí),在Ag NPs基底上的青霉素G 鈉表現(xiàn)出最大增強(qiáng)效果。原因可能是其他濃度硫酸鎂的加入引起Ag NPs的聚集不足或者聚集過多,從而不利于有效“熱點(diǎn)”的形成。因此,在后續(xù)試驗(yàn)中,選擇的硫酸鎂濃度為1×10－2mol·L－1。

圖3 在不同濃度硫酸鎂溶液中青霉素G 鈉在Ag NPs基底上的SERS光譜Fig.3 SERS spectra of NaBP on Ag NPs substrate with different concentrations of MgSO4 solution

2.4 青霉素G 鈉溶液的酸度對(duì)SERS增強(qiáng)的影響

青霉素G 鈉溶液很不穩(wěn)定,在室溫下放置容易失效,其結(jié)構(gòu)中的β-內(nèi)酰胺環(huán)對(duì)酸度、溫度、β-內(nèi)酰胺酶等高度敏感[16-17]。文獻(xiàn)[18-19]研究表明,在酸性溶液中,青霉素容易通過中間體青霉酸迅速轉(zhuǎn)化為丙烯酸,這也是青霉素在堿性介質(zhì)中的降解產(chǎn)物。圖4為不同酸度(pH 分別為2,4,6,8,10)的1×10－2mol·L－1青霉素G 鈉溶液在Ag NPs基底上的SERS光譜。

圖4 不同酸度的1×10－2 mol·L－1青霉素G 鈉溶液在Ag NPs基底上的SERS光譜Fig.4 SERS spectra of 1×10－2 mol·L－1 NaBP solution at different acidities on Ag NPs substrate

結(jié)果表明,不同酸度的青霉素G 鈉溶液的SERS增強(qiáng)效果不同。當(dāng)青霉素G 鈉溶液的pH 為6(初始酸度)時(shí),其SERS 光譜表現(xiàn)出最佳增強(qiáng)效果。隨著酸度的增加或者減小,青霉素G 鈉SERS光譜在1 002 cm－1處的強(qiáng)度逐漸降低。在強(qiáng)酸(pH 2)的600 cm－1左右處,出現(xiàn)了一些新的拉曼峰,其為COO－基團(tuán),這可能是β-內(nèi)酰胺環(huán)打開而形成了青霉酸所致。

2.5 青霉素G 鈉溶液的SERS檢測(cè)

圖5為不同濃度(1×10－9,1×10－8,1×10－7,1×10－6,1×10－5,1×10－4,1×10－3,1×10－2,1×10－1mol·L－1)的青霉素G 鈉溶液在Ag NPs基底上的SERS光譜。結(jié)果表明SERS光譜強(qiáng)度隨著青霉素G 鈉溶液濃度的增加而增強(qiáng)。在青霉素G 鈉溶液高濃度區(qū)域,隨著其濃度的減小拉曼信號(hào)降低幅度較大,而在低濃度區(qū)域,拉曼信號(hào)降低幅度相對(duì)較小。當(dāng)溶液濃度為1×10－9mol·L－1時(shí),其在1 002 cm－1處的信號(hào)幾乎檢測(cè)不出。

圖5 不同濃度青霉素G 鈉在Ag NPs基底上的SERS光譜Fig.5 SERS spectra of NaBP in different concentrations on Ag NPs substrate

圖6顯示了1 002 cm－1處青霉素G 鈉濃度與SERS信號(hào)強(qiáng)度之間的定量關(guān)系,每個(gè)點(diǎn)表示來自5個(gè)點(diǎn)的平均強(qiáng)度。結(jié)果表明,SERS信號(hào)強(qiáng)度隨著青霉素G 鈉濃度的降低而減弱。青霉素G 鈉濃度為1×10－8～1×10－3mol·L－1時(shí),其濃度的對(duì)數(shù)值與相應(yīng)的SERS峰強(qiáng)度呈線性關(guān)系,線性回歸方程為y＝1.583×102lgc＋1.360×103,相關(guān)系數(shù)為0.997 9,這說明SERS可以在適當(dāng)?shù)臐舛确秶鷥?nèi)對(duì)青霉素G 鈉進(jìn)行定量分析。

圖6 1 002 cm－1處SERS信號(hào)強(qiáng)度與青霉素G 鈉濃度對(duì)數(shù)的關(guān)系圖Fig.6 The plot of relationship between signal intensity of SERS at 1 002 cm－1 and the logarithm of NaBP concentration

按照3s/k(s為空白樣品標(biāo)準(zhǔn)偏差,k為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率)計(jì)算方法的檢出限,結(jié)果為8.2×10－9mol·L－1。

2.6 牛奶中青霉素G 鈉的SERS檢測(cè)

為了驗(yàn)證SERS測(cè)定青霉素G 鈉含量方法的可行性,選用了1.2.3 節(jié)中制備的不同濃度水平(1×10－6～1×10－3mol·L－1)的牛奶加標(biāo)樣品進(jìn)行SERS檢測(cè)(圖7),每個(gè)加標(biāo)水平平行測(cè)定5次,并計(jì)算青霉素G 鈉的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),結(jié)果見表1。

圖7 不同加標(biāo)濃度牛奶樣品的SERS光譜Fig.7 SERS spectra of milk samples with different spiked concentrations

表1 精密度和回收試驗(yàn)結(jié)果(n=5)Tab.1 Results of tests for precision and recovery(n=5)

結(jié)果表明,在1 002 cm－1處的SERS信號(hào)強(qiáng)度隨著牛奶中青霉素G 鈉濃度的降低而減弱。青霉素G 鈉的回收率為80.0%～96.0%,測(cè)定值的RSD為2.3%～6.5%。說明所提出的SERS 是一種簡(jiǎn)便、可靠的測(cè)定牛奶中青霉素G 鈉殘留的方法。

本工作以Ag NPs為活性基底,在凝聚劑硫酸鎂的協(xié)助下,對(duì)青霉素G 鈉進(jìn)行了SERS檢測(cè)。該方法檢出限可達(dá)8.2×10－9mol·L－1,低于歐盟抗生素藥物最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。此外,方法簡(jiǎn)便、快速,有望成為一種標(biāo)準(zhǔn)的檢測(cè)方法,有助于實(shí)際樣品的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。