草珊瑚乙醇提取物的抗氧化性及其對芒果采后主要病原菌的抑菌活性研究

童 悅，徐祥彬，史學(xué)群,*，李江闊

（1.海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，海南 ?？?570228；2.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所（國家農(nóng)產(chǎn)品保鮮工程技術(shù)研究中心（天津）），農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮重點實驗室，天津市農(nóng)產(chǎn)品采后生理與貯藏保鮮重點實驗室，天津 300384）

蒂腐病和炭疽病均為芒果果實采后常見病害，其中，炭疽病主要由芒果膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）引起，蒂腐病由芒果擬莖點霉蒂腐菌（Phomopsismangiferae）、可可球二孢蒂腐菌（Botryodiplodiatheobromae）及小穴殼蒂腐菌（Dothiorelladominicana）等病原菌引起[1]，其中又以可可球二孢蒂腐菌、擬莖點霉蒂腐菌侵染最為嚴(yán)重[2]。目前常見的防治措施為噴灑多菌靈、施保克、咪鮮胺、撲海因、施保功等化學(xué)殺菌劑[3]，但大量施用殺菌劑可能導(dǎo)致病原菌產(chǎn)生耐藥性而減弱殺菌效果，同時存在殺菌劑殘留量超標(biāo)等弊端[4]。近年來，植物提取物由于具有良好的抑菌活性及安全、無毒、高效等特點而逐漸受到國內(nèi)外研究者的關(guān)注。例如：蘇子寒等[5]報道了16種植物源活性成分對膠孢炭疽菌等芒果采后病原菌的抑菌活性及對果實病害的防治效果，發(fā)現(xiàn)蓽茇酰胺具有優(yōu)于化學(xué)殺菌劑咪鮮胺的抑菌效果，極具開發(fā)潛力；Zhang等[6]從中藥材土荊皮的乙醇提取液中分離到了8種對膠孢炭疽菌有抑菌活性的化合物，其中兩種對膠孢炭疽菌分生孢子的萌發(fā)及芽管伸長有顯著的抑制作用；Akhtar等[7]對61種藥用植物提取液的抑菌活性進(jìn)行了篩選，發(fā)現(xiàn)其中6種植物提取物具有廣譜抗菌性，兩種對曲霉屬真菌表現(xiàn)出明顯的抗菌活性；Mahlo等[8]制備了原產(chǎn)于南非的6種植物的甲醇、丙酮、二氯甲烷提取物，并測定了這些提取物對黑曲霉、尖孢鐮刀菌、擴(kuò)展青霉等7種病原真菌的抑制作用，結(jié)果表明6種植物的提取物對7種病原真菌均表現(xiàn)出一定的抑菌活性；ˇSvecová等[9]研究發(fā)現(xiàn)，濃度為0.2%的穗花牡荊提取物即可有效抑制番茄腐霉的菌絲生長；程慧麗等[10]研究了八角提取物對20種植物病原菌的室內(nèi)抑菌效果，發(fā)現(xiàn)1 mg/mL八角提取物對辣椒灰霉菌、番茄灰霉菌有較好的抑菌效果，抑制率均高于96%。

草珊瑚（Sarcandraglabra）又名腫節(jié)風(fēng)、九節(jié)茶、九節(jié)風(fēng)等，資源較豐富，主要分布于云南、貴州、福建、江西、海南等地[11]。草珊瑚在民間應(yīng)用廣泛，具有清熱

解毒、祛風(fēng)除濕、活血祛瘀、通經(jīng)接骨等功效[12]。經(jīng)現(xiàn)代化學(xué)分析技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，其提取物主要含有萜類、黃酮類、香豆素、酚酸類等類別的組分[13]。近年來，已有不同研究證實草珊瑚植株中所含的活性成分具有抗氧化[14-15]、抑制致病細(xì)菌[16]、抗真菌[17]、抗腫瘤[18-20]、抗感染[21]、抗病毒[22]等作用，但研究內(nèi)容均基于草珊瑚中草藥藥理、臨床應(yīng)用等方面，針對果蔬采后保鮮或采后果實病原微生物防治方面的報道極少。本試驗選取產(chǎn)自海南省瓊中縣的草珊瑚全草，以無水乙醇為溶劑制備提取物，并對提取物的抗氧化性進(jìn)行初步評價，研究了不同濃度草珊瑚提取物對芒果采后常見病原菌的抑菌活性、最小抑菌濃度、孢子萌發(fā)率等指標(biāo)的影響，以期為草珊瑚提取物在芒果果實采后保鮮、病害防治方面的應(yīng)用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

草珊瑚（Sarcandraglabra）全草，采集自海南省瓊中黎族苗族自治縣吊羅山鄉(xiāng)，運回實驗室，洗凈并自然晾干，放入烘箱45℃烘干6 h[23]，粉碎并過100目標(biāo)準(zhǔn)篩，備用。

膠孢炭疽菌（Colletotrichumgloeosporioides）、芒果可可球二孢蒂腐菌（Botryodiplodiatheobromae）、芒果擬莖點霉蒂腐菌（Phomopsismangiferae）均由海南大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院采后病理學(xué)實驗室提供。

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH），購于上海源葉生物科技有限公司；2,2-聯(lián)氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二銨鹽（2,2ˊ-Azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)，ABTS），購于上海生工生物工程有限公司；沒食子酸、蘆丁，購于上海麥克林生化科技有限公司；福林酚試劑，購于索萊寶科技有限公司。其余試劑均為市售分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

RV10型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國IKA公司；UVmini-1240紫外可見光分光光度計，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；THZ-82型恒溫氣控?fù)u床，常州國華電器有限公司；YXQ-LS-70A立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實業(yè)有限公司；SDPTOPE5光學(xué)顯微鏡，寧波舜宇儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 提取方法

稱取草珊瑚全草粉末以雙層濾紙包裹，按照料液比1∶16（g/mL）向圓底燒瓶中加入無水乙醇，用索氏提取裝置抽提6 h，收集提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去乙醇，獲得草珊瑚提取物濃縮浸膏。稱取35 g浸膏，溶于35 mL 50%乙醇溶液中，配制成濃度為1 g/mL的提取物母液，密封保存于4℃冰箱中備用[24]。

1.2.2 草珊瑚乙醇提取物總酚含量的測定

采用Jin等[25]的方法測定。每個濃度設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。以沒食子酸質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，擬合方程。配制1 mg/mL的草珊瑚乙醇提取物稀釋液，按相同步驟完成反應(yīng)，并測定吸光度，重復(fù)3次，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線換算提取物中總酚含量。

1.2.3 草珊瑚乙醇提取物總黃酮含量的測定

采用氯化鋁比色法[26]測定。每個濃度設(shè)3個平行，結(jié)果取平均值。配制1 mg/mL的草珊瑚乙醇提取物稀釋液，按相同步驟完成反應(yīng)并測定吸光度，重復(fù)3次，根據(jù)蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線換算提取物中的總黃酮含量。

1.2.4 草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力測定

參照Das等[27]的方法測定。以無水乙醇為空白對照，以2,6-二叔丁基對甲酚（BHT）為陽性對照，設(shè)置5個濃度（1、10、100、1 000、10 000μg/mL）梯度，每個濃度均設(shè)3個平行，反應(yīng)后于517 nm處測定吸光度。按照下式計算DPPH自由基清除率。

式中：A0為空白對照管的吸光度；As為樣品液與DPPH反應(yīng)后的吸光度；Ax為以等量無水乙醇取代DPPH測得的吸光度。

1.2.5 草珊瑚乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力測定

參照Da Silva等[28]的方法測定。以無水乙醇為空白對照，以BHT為陽性對照，設(shè)置5個濃度（0.625、1.250、2.500、5.000、10.000 mg/mL）梯度，每個濃度均設(shè)置3個平行。依照下式計算ABTS自由基清除率。

式中：A0為空白對照管的吸光度；As為樣品液與ABTS反應(yīng)后的吸光度；Ax為以等量無水乙醇取代ABTS測得的吸光值。

1.2.6 草珊瑚提取物對芒果采后主要病原菌的抑制活性測定

采用菌絲生長速率法[29]進(jìn)行測定。取滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基，熔化后待溫度降至50℃左右，加入草珊瑚提取物稀釋液并使最終濃度分別為0.625、1.25、2.50、5.00 mg/mL，混勻后制成含提取物的平板。用滅菌的5 mm打孔器在經(jīng)活化的菌株上打孔，取菌餅，菌絲向下接種于含提取物平板的中心。以無菌水配制的PDA培養(yǎng)基為空白對照，重復(fù)3次。置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7d，每24h進(jìn)行觀察拍照，采用十字交叉法測量菌落直徑（mm），依據(jù)下式計算抑制率。

1.2.7 草珊瑚提取物對芒果主要病原菌的最小抑菌濃度（MIC）測定

菌懸液的制備：在活化后的3種病原菌菌絲表面滴加少量無菌水，用無菌的涂布棒刮取菌苔，過濾后得到菌懸液，利用血球計數(shù)板將最終濃度調(diào)節(jié)至106CFU/mL。

向50、49、48、46 mL熔化的PDA培養(yǎng)基中分別加入0、1、2、4 mL的500 mg/mL草珊瑚提取物稀釋液，然后用50%乙醇定容至50 mL，使最終濃度分別為0、10、20、40 mg/mL，混勻后制成含提取物的平板。在表面滴加20μL菌懸液，快速涂布均勻，密封置于25℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3 d，以無菌落生長的最低提取物濃度為MIC[30]；持續(xù)培養(yǎng)7 d，以始終無菌落生長的最低提取物濃度為最小殺菌濃度（MBC）。

1.2.8 草珊瑚提取物對芒果采后主要病原菌的孢子萌發(fā)抑制作用測定

孢子液的制備：將活化后的C.gloeosporioides、B.theobromae分別接種至馬鈴薯葡萄糖肉湯（PDB）培養(yǎng)基中，于25℃、180 r/min空氣搖床中培養(yǎng)2～4 d，濾除菌絲，將濾液以3 000 r/min離心10 min，棄上清后加入少量無菌水，制得孢子懸浮液，在顯微鏡下觀察并調(diào)節(jié)其最終濃度至106個/mL。

將定量的孢子懸浮液、PDB培養(yǎng)基和不同濃度的草珊瑚乙醇提取物加入1.5 mL無菌離心管中，使提取物終濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。取100μL混合液均勻涂于載玻片上，置于鋪有濕潤濾紙的培養(yǎng)皿中，于（25±1）℃環(huán)境下恒溫培養(yǎng)。以孢子芽管長度超過孢子寬度時作為萌發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)，分別于4、6、8、10、12 h用顯微鏡觀察并統(tǒng)計不少于100個孢子的萌發(fā)情況[31]。每個處理均設(shè)置3個平行，試驗重復(fù)3次。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析采用Excel、SPSS 19.0等軟件，采用Duncan新復(fù)極差法比較各組間數(shù)據(jù)差異，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 草珊瑚乙醇提取物中的總酚和總黃酮含量

將提取物樣品的吸光度平均值代入回歸方程y=10.217x-0.110 7（圖1A），可得1 mg/mL草珊瑚乙醇提取物中總酚含量相當(dāng)于等體積的0.076 2 mg/mL沒食子酸，即草珊瑚乙醇提取物中總酚含量為7.62%。將對應(yīng)的樣品稀釋液吸光度平均值代入蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程y=8.935x+0.054 4（圖1B），可得1 mg/mL草珊瑚乙醇提取物中總黃酮含量相當(dāng)于等體積的0.061 3 mg/mL蘆丁，即草珊瑚乙醇提取物中總黃酮含量為6.13%。

圖1 沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線（A）和蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（B）Fig.1 Standard curveof gallic acid(A)and rutin(B)

2.2 草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力

DPPH的無水乙醇溶液呈紫色至紫黑色，向DPPH溶液中加入自由基清除劑如BHT后，DPPH自由基中的孤對電子被配對，反應(yīng)體系呈現(xiàn)的顏色變淺，在517 nm處的吸光度減小且與配對電子數(shù)呈劑量關(guān)系。因此，通過該方法可測定草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力。由圖2可見，草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基確實具有清除作用，且隨著濃度的增加清除作用增大。當(dāng)BHT濃度為1μg/mL時，其對DPPH自由基的清除率為2.87%；而相同濃度的草珊瑚提取物稀釋液對DPPH自由基的清除率為7.09%。此后隨著濃度的提高，對照BHT與樣品草珊瑚提取物對DPPH自由基的清除率均逐漸增強，但草珊瑚提取物對DPPH自由基的清除效果始終弱于等濃度的BHT溶液。

圖2 BHT及草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基的清除作用Fig.2 Thescavengingeffect of BHTand S.glabra ethanol extract on DPPH·

2.3 草珊瑚乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力

ABTS與過硫酸鉀混合反應(yīng)后可生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽離子自由基體系，當(dāng)加入具有抗氧化性的物質(zhì)，并調(diào)節(jié)至堿性環(huán)境，ABTS會與抗氧化物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)而使體系褪色，在734 nm處測定反應(yīng)前后吸光度的變化即可計算出樣品的對ABTS自由基的清除能力。由圖3可知，草珊瑚乙醇提取物和BHT對ABTS自由基均具有清除作用，但草珊瑚乙醇提取物的清除作用總體弱于BHT。草珊瑚乙醇提取物在濃度為0.625 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率僅為26.61%，而同濃度BHT對ABTS自由基的清除率已達(dá)到71.16%；當(dāng)濃度升至1.25 mg/mL時，草珊瑚乙醇提取物對ABTS自由基的清除率升至45.69%，此時BHT對ABTS自由基清除率為83.68%。當(dāng)濃度為10 mg/mL時，BHT與草珊瑚提取物對ABTS自由基的清除率均超過90%，逐漸接近。

圖3 BHT及草珊瑚乙醇提取物對ABTS自由基的清除作用Fig.3 The scavenging effect of BHTand S.glabra ethanol extract on ABTS+·

2.4 草珊瑚乙醇提取物對芒果采后主要病原菌的抑制活性

2.4.1 草珊瑚乙醇提取物對芒果膠孢炭疽菌的抑制作用

由圖4可知，草珊瑚乙醇提取物對芒果膠孢炭疽菌的菌絲生長有顯著的抑制作用，抑菌效果隨濃度提高而增強，低濃度處理與高濃度處理間差異顯著（P＜0.05）。培養(yǎng)至第7天，對照組菌落平均直徑達(dá)84.25 mm，0.625 mg/mL處理組、1.25 mg/mL處理組菌落平均直徑較為接近，分別為70.38、69.38 mm，抑制率分別為17.82%、18.59%；2.50 mg/mL處理組和5.00 mg/mL處理組的抑制率分別為38.97%、41.25%。

圖4 草珊瑚乙醇提取物對芒果膠孢炭疽菌的抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on C.gloeosporioides

2.4.2 草珊瑚乙醇提取物對芒果擬莖點霉蒂腐菌的抑制作用

由圖5可知，草珊瑚乙醇提取物對擬莖點霉蒂腐菌的菌絲生長有較好的抑制作用，不同濃度間差異顯著（P＜0.05）。在0.625～5.00 mg/mL的梯度范圍內(nèi)，抑菌效果最佳的處理劑量為2.50 mg/mL。培養(yǎng)1 d后，對照組菌落直徑已達(dá)20.13 mm，而1.25、2.50、5.00 mg/mL處理組菌落均未擴(kuò)展；培養(yǎng)至第7天，對照組的菌絲已經(jīng)擴(kuò)展至整個培養(yǎng)皿，2.50 mg/mL處理組菌落平均直徑僅有46.75 mm，抑制率為50.29%。

圖5 草珊瑚乙醇提取物對擬莖點霉蒂腐菌的抑制作用Fig.5 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on P.mangiferae

2.4.3 草珊瑚乙醇提取物對可可球二孢蒂腐菌的抑制作用

由圖6可知，草珊瑚乙醇提取物對可可球二孢蒂腐菌菌絲生長的抑制作用相對較弱，抑制率隨培養(yǎng)時間的延長而逐漸降低。在0.625～5.00 mg/mL的梯度范圍內(nèi)，抑菌效果最佳的處理劑量為5.00 mg/mL。培養(yǎng)至第5天，0.625 mg/mL處理組菌落直徑達(dá)90 mm，失去抑制作用；第6天，僅5.00 mg/mL處理仍能夠保持一定的抑制作用，抑制率為10.67%。

圖6 草珊瑚乙醇提取物對可可球二孢蒂腐菌的抑制作用Fig.6 Inhibitory effect of S.glabra ethanol extract on B.theobromae

2.5 草珊瑚提取物對芒果主要病原菌的最小抑菌濃度

由表1和表2可見，不同菌種對相同濃度的草珊瑚提取物的敏感程度不同。膠孢炭疽菌、擬莖點霉蒂腐菌培養(yǎng)至3 d時在10 mg/mL及以上濃度均無生長，因此膠孢炭疽菌、擬莖點霉蒂腐菌的MIC均為10 mg/mL；培養(yǎng)至10 d時，兩者僅在40 mg/mL處理組仍無菌落生長，故可認(rèn)為膠孢炭疽菌、擬莖點霉蒂腐菌MBC均為40 mg/mL。可可球二孢蒂腐菌MIC為20 mg/mL，而培養(yǎng)至10 d時，各濃度處理組均有可可球二孢蒂腐的菌落生長，故本次篩選范圍內(nèi)未獲得其MBC。

表1 草珊瑚提取物對芒果采后病原菌的MIC測定Table 1 Determination of MICof S.glabra ethanol extract against postharvest mango pathogens

表2 草珊瑚提取物對芒果采后病原菌的MBC測定Table2 Determination of MBCof S.glabra ethanol extract against postharvest mangopathogens

2.6 草珊瑚提取物對膠孢炭疽菌和可可球二孢蒂腐菌孢子萌發(fā)的抑制作用

由圖7可見，不同濃度草珊瑚乙醇提取物對膠孢炭疽菌和可可球二孢蒂腐菌孢子的萌發(fā)均有抑制或延緩的作用。5.00 mg/mL草珊瑚提取物可在6 h內(nèi)完全抑制膠孢炭疽菌孢子的萌發(fā)；至12 h，對照組孢子完全萌發(fā)，5.00 mg/mL處理組孢子萌發(fā)率僅36.67%。草珊瑚提取物對可可球二孢蒂腐菌孢子萌發(fā)的抑制作用相對較弱，5.00 mg/mL處理組在培養(yǎng)4 h已開始萌發(fā)，至8 h萌發(fā)率已達(dá)30.33%。

圖7 草珊瑚乙醇提取物處理對膠孢炭疽菌（A）和可可球二孢蒂腐菌（B）孢子萌發(fā)的影響Fig.7 Effects of S.glabra ethanol extract on spore germination of C.gloeosporioides(A)and B.theobromae(B)

3 結(jié)論與討論

上述試驗結(jié)果表明：草珊瑚全草乙醇提取物中的總酚含量為7.62%，總黃酮含量為6.13%；在低濃度（1μg/mL）下，草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力優(yōu)于BHT，但隨著濃度的升高，BHT對DPPH自由基的清除能力逐漸優(yōu)于提取物；草珊瑚乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力弱于同濃度BHT溶液，但抗氧化性隨濃度的升高增強更為明顯；草珊瑚乙醇提取物濃度為0.625 mg/mL時，對ABTS自由基的清除率僅為26.61%；當(dāng)濃度提高至1.25mg/mL時，提取物對ABTS的清除率可提升至45.69%；當(dāng)濃度提高到10 mg/mL時，草珊瑚提取物對ABTS的清除率超過90%。說明草珊瑚乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基均具有良好的清除作用，具有潛在的抗氧化能力。

草珊瑚乙醇提取物對芒果采后常見病原菌均有一定的抑制作用，其中對擬莖點霉蒂腐菌的抑制作用最佳，在篩選范圍內(nèi)最優(yōu)濃度為2.50 mg/mL，培養(yǎng)7 d時抑制率仍保持在50.29%。草珊瑚乙醇提取物對膠孢炭疽菌菌絲生長與孢子萌發(fā)均有較好的抑制作用，5.00 mg/mL草珊瑚乙醇提取物可有效抑制其菌落擴(kuò)展，并將12 h內(nèi)孢子萌發(fā)率控制在40%以下。草珊瑚提取物對以上兩種芒果采后病原菌均具有良好的抑菌活性，后續(xù)試驗將著眼于草珊瑚提取物對采后芒果果實的病害防治效果與草珊瑚提取物的抑菌機理方面，如進(jìn)一步分離鑒定其中的單體化合物成分，有望為開發(fā)用于芒果采后保鮮的天然抗氧化劑、抗菌劑提供理論基礎(chǔ)。

草珊瑚乙醇提取物對可可球二孢蒂腐菌的抑制作用較弱，5.00 mg/mL處理組菌絲生長仍較旺盛，培養(yǎng)至第6天時抑制率僅有10.67%，至第7天菌絲完全布滿培養(yǎng)基表面，最小抑菌濃度為20 mg/mL；同時，5.00 mg/mL處理組的孢子在培養(yǎng)4 h已開始萌發(fā)，至8 h萌發(fā)率達(dá)30.33%。在MBC篩選過程中發(fā)現(xiàn)：40 mg/mL草珊瑚提取物依然無法完全抑制可可球二孢蒂腐菌的生長，需要考慮繼續(xù)擴(kuò)大篩選范圍、提高提取物濃度，因此僅依靠加大草珊瑚提取物處理的劑量可能不足以實現(xiàn)對可可球二孢蒂腐菌的有效抑制，后續(xù)仍需尋找更加高效、安全的天然抑菌活性物質(zhì)，或采用其他植物提取物與草珊瑚提取物復(fù)配以達(dá)到低劑量、高效的防治。