基于生物信息學(xué)技術(shù)分析老年自發(fā)性腦出血的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因

劉玲玲，王國佐，李子瀅，李晟，陳彥霖，林霞，黃娟，秦莉花

《美國心臟協(xié)會心臟病和卒中統(tǒng)計(jì)報(bào)告——2020年更新版》［1］顯示，腦卒中是世界人口死亡的第二大原因。研究顯示，腦卒中是我國居民死亡的第一大病因［2］。數(shù)據(jù)調(diào)查顯示，2017年全球腦卒中患者總數(shù)為1.042億例，其中自發(fā)性腦出血1 790萬例（占17.2%），占因腦卒中死亡患者總數(shù)的50%［1，3-4］。自發(fā)性腦出血好發(fā)于中老年期，且隨著我國老齡化社會進(jìn)程的加快，老年自發(fā)性腦出血的發(fā)生率呈大幅上升趨勢［5］。近年來，自發(fā)性腦出血的診斷、治療、預(yù)防等方面已取得重大進(jìn)展，常用的診斷方法有腦成像和血管成像如CT或MRI等；治療包括急性醫(yī)療管理、外科手術(shù)管理、二級預(yù)防和抗血栓藥物管理等［6］。然而，自發(fā)性腦出血患者的臨床預(yù)后仍很差，具有高死亡率和高致殘率的特點(diǎn)［7］，給患者、家庭和社會帶來巨大的負(fù)擔(dān)。因此，需要進(jìn)一步明確自發(fā)性腦出血發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制，尋找用于早期篩查的潛在分子靶標(biāo)和診斷標(biāo)志物。本研究從基因表達(dá)數(shù)據(jù)庫（gene expression omnibus，GEO）下載GSE24265數(shù)據(jù)集，利用生物信息學(xué)技術(shù)分析在老年自發(fā)性腦出血發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮重要作用的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因，從而為老年自發(fā)性腦出血的早期診斷和防治提供借鑒。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)集的獲取 2021年9—10月，從GEO下載GSE24265數(shù)據(jù)集，平臺號為GPL570［HG-U133_Plus_2］Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array。GSE24265數(shù)據(jù)集包括4例老年自發(fā)性腦出血死亡患者（中位年齡為79歲）的11個(gè)腦樣本，本研究從其中選取4個(gè)血腫周圍區(qū)域樣本（包括GSM596842、GSM596845、GSM596848、GSM596850）作為實(shí)驗(yàn)組，相應(yīng)的4個(gè)對側(cè)灰質(zhì)樣本（包括GSM596843、GSM596846、GSM596849、GSM596851）作為對照組。

1.2 數(shù)據(jù)預(yù)處理 去掉GSE24265數(shù)據(jù)集中一個(gè)探針對應(yīng)多個(gè)分子的探針，當(dāng)遇到對應(yīng)同一個(gè)分子的探針時(shí)，僅保留信號值最大的探針；采用R軟件（3.6.3版本）對過濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析與可視化，其中統(tǒng)一流形逼近與投影（uniform manifold approximation and projection，UMAP）包（0.2.7.0版本）用于UMAP分析，ggplot2包（3.3.3版本）用于繪制樣本數(shù)據(jù)歸一化的箱式圖、主成分分析（principal components analysis，PCA）散點(diǎn)圖和UMAP圖。

1.3 差異基因的篩選 差異基因的篩選參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)為logFC＞1，校正P值＜0.05。采用R軟件（3.6.3版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析與可視化：采用ggplot2包（3.3.3版本）繪制火山圖，以直觀地展示每個(gè)差異基因在每個(gè)樣本中的分布情況；采用ComplexHeatmap包（2.2.0版本）繪制熱圖，以直觀地展示每個(gè)差異基因在每個(gè)樣本中的表達(dá)情況［8］。

1.4 GO功能、KEGG通路富集分析及基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA） 利用R軟件（3.6.3版本）進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析及GSEA，其中org.Hs.eg.db包（3.10.0版本）用于ID轉(zhuǎn)換，clusterProfiler包（3.14.3版本）用于富集分析，ggplot2（3.3.3版本）包用于可視化圖的制作［9］。GSEA參考的基因集為c2.cp.v7.2.symbols.gmt［Curated］，基因集數(shù)據(jù)庫為MSigDB Collections。GO功能、KEGG通路富集分析以校正P值＜0.05為閾值來篩選差異基因的主要富集功能和通路；GSEA以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.25且校正P值＜0.05為顯著富集［10］。

1.5 蛋白質(zhì)互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）的制作及關(guān)鍵基因的選取 采用STRING數(shù)據(jù)庫［11］（http：//string-db.org）對差異基因制作PPI，其互作分?jǐn)?shù)閾值為0.40，再將所得結(jié)果導(dǎo)入cytoscape軟件（3.8.2版本）以分析PPI圖，采用MCOD、cytoHubba插件的MCC計(jì)算法進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選；利用韋恩圖在線工具將MCOD、cytoHubba插件篩選出來的關(guān)鍵基因進(jìn)行交叉比對，最終獲得老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因。

2 結(jié)果

2.1 數(shù)據(jù)預(yù)處理結(jié)果 箱式圖分析結(jié)果顯示，各個(gè)樣本中位數(shù)基本在一個(gè)水平線上，提示樣本間歸一化程度好，見圖1；PCA散點(diǎn)圖和UMAP圖分析結(jié)果顯示，各組的樣本基本分開，提示后續(xù)差異分析有意義的結(jié)果可能會較多，見圖2～3。

圖1 兩組樣本數(shù)據(jù)的箱式圖Figure 1 Boxplots of two sets of sample data

圖2 兩組樣本數(shù)據(jù)的PCA散點(diǎn)圖Figure 2 PCA scatter plot of two sets of sample data

圖3 兩組樣本數(shù)據(jù)的UMAP圖Figure 3 UMAP plot of two sets of sample data

2.2 差異基因篩選結(jié)果 兩組樣本數(shù)據(jù)比較共有415個(gè)差異基因，其中高表達(dá)53個(gè)、低表達(dá)362個(gè)，見圖4～5。

圖4 差異基因的火山圖Figure 4 Volcano map of differential genes

圖5 差異基因的熱圖Figure 5 Heatmap of differential genes

2.3 GO功能、KEGG通路富集分析及GSEA結(jié)果 GO功能富集分析共得到226條有明顯差異的GO條目，包括145條生物過程（biological process，BP）條目、44條細(xì)胞組成（cellular component，CC）條目、37條分子功能（molecular function，MF）條目，差異基因介導(dǎo)的BP主要富集于化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、樹突發(fā)育、軸突發(fā)生，CC主要富集于突觸膜、突觸后密度蛋白、谷氨酸能突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、非對稱性突觸，MF主要富集于陽離子通道活性調(diào)控、門控通道活性調(diào)控、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)控、離子門控通道活性調(diào)控、跨膜腎上腺素受體活性調(diào)控，見圖6A～6C。KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異基因主要富集于軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等17條通路，見圖6D。GSEA結(jié)果顯示，共有734個(gè)基因集，其中顯著富集的基因集共有364個(gè)，包括人體補(bǔ)體系統(tǒng)、無意義介導(dǎo)的衰變、流感病毒感染、含硒氨基酸的代謝、信號識別粒子（sigllal recogllition panicle，SRP）依賴性共翻譯蛋白靶向膜、真核翻譯起始、Slits和Robos的表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞核和胞質(zhì)中的rRNA修飾等，見圖7。

圖6 GO功能、KEGG通路富集分析排名前5位的差異基因的可視化圖Figure 6 Visualization of the top 5 differential genes in GO function and KEGG pathway enrichment analysis

2.4 PPI及關(guān)鍵基因選取結(jié)果 MCOD插件分析結(jié)果顯示，一共有11個(gè)聚類，選擇分?jǐn)?shù)最高的聚類1，得分為10.364分、節(jié)點(diǎn)為12個(gè)、邊數(shù)為57條，篩選出的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、KCNV1、FAU、RPL35、KCNS1、SMKR1、RPS5、DOCK4、KCNQ5、RPS19、RPLP1，見圖8；cytoHubba插件分析結(jié)果顯示，按照得分由高到低的關(guān)鍵基因依次為RPS6、RPS5、RPS19、RPL8、RPL35、RPLP1、FAU、EPHB1、EFNB3、EFNB2，見圖9。最終篩選出老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。

圖8 MCODE插件分析結(jié)果Figure 8 MCODE plug-in analysis results

圖9 cytoHubba插件分析結(jié)果Figure 9 cytoHubba plug-in analysis results

3 討論

自發(fā)性腦出血是一種致命的腦血管疾病，具有高死亡率和高發(fā)病率的特點(diǎn)，占所有腦卒中患者的10%～20%［12-13］，會導(dǎo)致不良預(yù)后和嚴(yán)重的精神運(yùn)動(dòng)性障礙。隨著全球人口老齡化的加劇，老年自發(fā)性腦出血患者越來越多，尤其在人口老齡化問題尤為突出的中國［13］。迄今為止，尚未發(fā)現(xiàn)有效的手術(shù)或藥物療法可以改善自發(fā)性腦出血患者的功能預(yù)后。因此，探索并尋找老年自發(fā)性腦出血新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)非常重要。本研究旨在利用生物信息學(xué)技術(shù)分析老年自發(fā)性腦出血的相關(guān)通路及關(guān)鍵基因。

本研究結(jié)果顯示，兩組樣本數(shù)據(jù)比較共有415個(gè)差異基因，其中高表達(dá)53個(gè)、低表達(dá)362個(gè)。進(jìn)一步進(jìn)行GO功能富集分析，結(jié)果顯示，差異基因介導(dǎo)的BP主要富集于化學(xué)突觸傳遞的調(diào)節(jié)、突觸信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控、神經(jīng)元投射發(fā)育的調(diào)節(jié)、樹突發(fā)育、軸突發(fā)生，CC主要富集于突觸膜、突觸后密度蛋白、谷氨酸能突觸、神經(jīng)元到神經(jīng)元突觸、非對稱性突觸，MF主要富集于陽離子通道活性調(diào)控、門控通道活性調(diào)控、鈣離子跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性調(diào)控、離子門控通道活性調(diào)控、跨膜腎上腺素受體活性調(diào)控。既往研究表明，突觸后密度蛋白有望成為改善腦出血患者預(yù)后的靶標(biāo)，并可提高腦出血大鼠的認(rèn)知功能和學(xué)習(xí)能力，減輕腦出血后繼發(fā)性腦損傷和行為認(rèn)知障礙［14-15］。谷氨酸能突觸在大鼠腦出血發(fā)病12 h和24 h后過渡到細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)［15］。本研究KEGG通路富集分析結(jié)果顯示，差異基因主要富集于軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等17條通路。既往研究表明，軸突導(dǎo)向蛋白濃度與腦出血的炎癥反應(yīng)、出血嚴(yán)重程度和臨床預(yù)后密切相關(guān)［16］；腦卒中后抑郁患者差異表達(dá)基因主要作用于軸突導(dǎo)向信號通路［17］。

由于傳統(tǒng)篩選差異基因的方法會掩蓋一些表達(dá)上調(diào)倍數(shù)較低但具有重要生物學(xué)意義的基因，本研究采用GSEA來篩選與老年自發(fā)性腦出血有關(guān)的基因集，結(jié)果顯示，共有734個(gè)基因集，其中顯著富集的基因集共有364個(gè)，包括人體補(bǔ)體系統(tǒng)、無意義介導(dǎo)的衰變、流感病毒感染、含硒氨基酸的代謝、SRP依賴性共翻譯蛋白靶向膜、真核翻譯起始、Slits和Robos的表達(dá)調(diào)節(jié)、細(xì)胞核和胞質(zhì)中的rRNA修飾等。既往研究表明，補(bǔ)體系統(tǒng)在腦出血發(fā)生后被激活，主要表現(xiàn)為癥狀出現(xiàn)后的最初24 h內(nèi)腦出血患者補(bǔ)體系統(tǒng)的凝集素通路介導(dǎo)的蛋白濃度與健康個(gè)體存在明顯差異［18］，激活的補(bǔ)體系統(tǒng)可對神經(jīng)元產(chǎn)生細(xì)胞毒性作用，對腦組織產(chǎn)生繼發(fā)性損傷［19］。突變體COL4A1的無意義介導(dǎo)的衰變明顯減少，使COL4A1的單倍體不足，這是腦出血的原因［20］。流感病毒感染觸發(fā)細(xì)胞因子級聯(lián)反應(yīng)，可加重缺血性腦損傷并增加組織纖溶酶原激活劑治療后腦出血的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)［21］，也可使腦卒中后溶栓患者的血漿MMP-9水平升高，而血漿MMP-9水平升高與溶栓后腦出血相關(guān)［22］。Slits是一種分泌型糖蛋白，可與跨膜受體家族成員Robos結(jié)合，在大腦海馬區(qū)中廣泛表達(dá)，具有區(qū)域偏好［23］。

本研究最終篩選出老年自發(fā)性腦出血的關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。其中RPS6是一種核糖體蛋白，是40S核糖體亞基的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)成分［24］，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤干細(xì)胞的發(fā)育和維持中起著至關(guān)重要的作用，且與放化療和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤復(fù)發(fā)相關(guān)［25］；限制RPS6可抑制上皮性卵巢癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，故RPS6可能成為上皮性卵巢癌的新型生物標(biāo)志物和分子靶標(biāo)［26］。RPS6是第一個(gè)顯示出磷酸化作用的核糖體蛋白［27］，RPS6磷酸化是被廣泛使用的跟蹤腦神經(jīng)元活性變化的標(biāo)志物［28］，且RPS6磷酸化對于神經(jīng)元的整個(gè)蛋白質(zhì)合成是不可或缺的，可能控制特定大腦區(qū)域［29］。RPL8是一種核糖體蛋白，研究表明，RPL8在腦出血患者腦組織中的表達(dá)水平增加［30］。FAU是一種核糖體蛋白，可能是缺血性腦卒中的新預(yù)后生物標(biāo)志物和潛在治療靶標(biāo)［31］。RPL35是一種核糖體蛋白，研究表明，人類神經(jīng)母細(xì)胞瘤組織中RPL35水平升高提示預(yù)后不良［32］。RPS5是一種核糖體蛋白，與酒精相關(guān)性肝癌的發(fā)展有關(guān)，對患者預(yù)后具有重要的預(yù)測價(jià)值［33］，且被確定為結(jié)腸癌患者復(fù)發(fā)和進(jìn)展的危險(xiǎn)因素［34］。RPS19是一種核糖體蛋白，是40S核糖體亞基的構(gòu)成成分，其精氨酸67缺失，先天性純紅細(xì)胞再生障礙性貧血患者可表現(xiàn)出顱面、骨骼和腦部異常，并伴有各種神經(jīng)行為異常［35］。RPLP1是一種關(guān)鍵的核糖體蛋白，對神經(jīng)系統(tǒng)胚胎和大腦發(fā)育至關(guān)重要［36］，其與腫瘤發(fā)生和原代細(xì)胞永生化有關(guān)，是三陰性乳腺癌患者預(yù)后不良的潛在生物標(biāo)志物和阻止癌癥轉(zhuǎn)移的治療靶標(biāo)［37］。

綜上所述，與老年自發(fā)性腦出血發(fā)病機(jī)制有關(guān)的信號通路包括軸突導(dǎo)向信號通路、催產(chǎn)素信號通路、肥厚型心肌病、擴(kuò)張型心肌病、致心律失常性右心室心肌病等；其關(guān)鍵基因?yàn)镽PS6、RPL8、FAU、RPL35、RPS5、RPS19、RPLP1。這為進(jìn)一步研究老年自發(fā)性腦出血的機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)，為腦出血的臨床診治和預(yù)防提供了理論依據(jù)。但本研究是基于生物信息學(xué)方法對GEO中的4例老年自發(fā)性腦出血死亡患者的4個(gè)血腫周圍區(qū)域樣本和相應(yīng)的4個(gè)對側(cè)灰質(zhì)樣本進(jìn)行比較分析，研究結(jié)果具有一定局限性，只能對相關(guān)信號通路和關(guān)鍵基因參與老年自發(fā)性腦出血的發(fā)生發(fā)展過程提出合理猜想，其相互作用的具體機(jī)制還需要更多的探究與實(shí)驗(yàn)證實(shí)。

作者貢獻(xiàn)：秦莉花進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；劉玲玲撰寫、修訂論文；王國佐、李子瀅、黃娟負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)收集、整理；李晟、陳彥霖、林霞負(fù)責(zé)數(shù)據(jù)分析。

本文無利益沖突。