子宮內(nèi)膜異位癥Treg細(xì)胞上調(diào)的機(jī)制研究

朱義保 吳 斐 萬 磊

子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說，其中免疫抑制因素也受到關(guān)注。近年來國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)，多數(shù)子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液和病灶均有調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)升高的現(xiàn)象[1-5]，認(rèn)為免疫抑制參與了子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展，Treg細(xì)胞升高形成免疫抑制，降低了機(jī)體清除盆腔異位細(xì)胞的能力，進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展[6]。但是我們認(rèn)為，子宮內(nèi)膜異位癥表現(xiàn)為炎癥性疾病，患者腹腔表達(dá)許多炎癥因子，Treg細(xì)胞上調(diào)可能是繼發(fā)于炎癥的免疫調(diào)節(jié)事件，與其誘導(dǎo)的炎癥因子的升高有關(guān)。因此在本研究中，我們以子宮內(nèi)膜異位癥的巧克力囊腫患者為研究對(duì)象，以Treg細(xì)胞為免疫抑制的觀察指標(biāo)，比較經(jīng)GnRH-a治療和未經(jīng)GnRH-a治療患者腹腔液Treg細(xì)胞及與Treg細(xì)胞誘導(dǎo)有關(guān)的炎癥因子水平，觀察Treg細(xì)胞與其誘導(dǎo)的炎癥因子的關(guān)系。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以2019年收治的41例子宮內(nèi)膜異位癥患者為研究對(duì)象，巧克力囊腫大小5～7 cm，其中16例術(shù)前經(jīng)GnRH-a治療、3個(gè)周期后來院手術(shù)的為治療組，另25例未經(jīng)GnRH-a治療直接手術(shù)的為未治療組，2組的囊腫大小、CA125、分期情況見表1。同時(shí)選25例子宮肌瘤患者為對(duì)照。納入對(duì)象均排除心、肝、腎、內(nèi)分泌疾病和盆腔感染疾病，近3個(gè)月未服用激素類藥物。本研究通過醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

表1 研究對(duì)象的基本情況

1.2 主要試劑及儀器

雌二醇檢測(cè)試劑盒為雅培公司產(chǎn)品，流式細(xì)胞儀為BD公司產(chǎn)品，Treg細(xì)胞檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Bio-Science 公司(內(nèi)含抗人FITC-CD4 和PE-Foxp3單抗，及配套的固定透膜和透膜緩沖試劑)，IL-10、TGF-β、PGE-2 ELISA試劑盒購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司。

1.3 治療方法

術(shù)前經(jīng)GnRH-a亮丙瑞林治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者，在月經(jīng)周期的1～5天(28天為1個(gè)周期)，第1次皮下注射亮丙瑞林3.75 mg，部位為上臂或臀部，每1周期給藥1次，劑量同第1次，連續(xù)給藥3個(gè)周期。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 腹腔液取樣 術(shù)前經(jīng)GnRH-a治療的子宮內(nèi)膜異位癥患者3個(gè)周期后入院手術(shù)，未經(jīng)GnRH-a治療的子宮內(nèi)膜異位癥和子宮肌瘤患者月經(jīng)干凈2～7天后入院手術(shù)，術(shù)中取腹腔液。

1.4.2 雌二醇和IL-10、TGF-β、PGE-2檢測(cè) 雌二醇采用電化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)，IL-10、TGF-β、PGE-2采用ELISA檢測(cè)，相關(guān)操作按說明書進(jìn)行。

1.4.3 Treg細(xì)胞檢測(cè) 腹腔液離心取沉淀細(xì)胞，用1 ml PBS懸浮，取100 μL加入測(cè)定管，加10 μL FITC-CD4抗體，再加1 ml固定透膜液，混勻，室溫避光孵育40 min，離心去上清，用透膜緩沖液100 μL重懸，加10 μL PE-Foxp3抗體，混勻，室溫避光孵育30 min，離心去上清，用200 μL PBS重懸上機(jī)檢測(cè)。

1.5 統(tǒng)計(jì)方法

用SPSS 19.0軟件中的方差分析、T檢驗(yàn)、卡方分析和Kruskal-Wallis秩和分析進(jìn)行統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 治療組治療前后、未治療組、對(duì)照組的基礎(chǔ)雌二醇水平

月經(jīng)第3天的雌二醇值為基礎(chǔ)水平，血清化學(xué)發(fā)光免疫檢測(cè)顯示，治療組治療后、治療組治療前、未治療組、對(duì)照組的基礎(chǔ)雌二醇分別為(11.6±4.9)ng/L、(34.8±8.7)ng/L、(39.4±12.4)ng/L、(33.7±9.5)ng/L(圖1)。治療組治療后的基礎(chǔ)雌二醇值相比治療前明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=9.29,P=0.00)，表明子宮內(nèi)膜異位癥患者經(jīng)藥物治療后，基礎(chǔ)雌二醇的水平顯著下降，達(dá)到了藥物絕經(jīng)狀態(tài)。治療組治療前、未治療組和對(duì)照組的基礎(chǔ)雌二醇差異無顯著性(P>0.05)。

圖1 3組基礎(chǔ)雌二醇水平

2.2 治療組治療后、未治療組、對(duì)照組腹腔液Treg細(xì)胞百分比

流式細(xì)胞檢測(cè)顯示，治療組治療后、未治療組、對(duì)照組的Treg細(xì)胞百分比分別為2.94±0.83、5.32±1.16、2.05±0.59(圖2)，未治療組的Treg細(xì)胞百分比較對(duì)照組和治療組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，表明子宮內(nèi)膜異位癥上調(diào)了Treg細(xì)胞。使用GnRH-a治療后，治療組雌二醇下降，同時(shí)Treg細(xì)胞百分比下降，提示雌二醇水平與Treg細(xì)胞百分比有關(guān)。治療組治療后和對(duì)照組的Treg細(xì)胞百分比差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖2 治療組治療后、未治療組、對(duì)照組腹腔液Treg細(xì)胞百分比情況

2.3 治療組治療后、未治療組、對(duì)照組腹腔液IL-10、TGF-β、PGE-2炎癥因子水平

子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔液中存在許多炎癥因子[7-8]，經(jīng)GnRH-a治療后Treg細(xì)胞下調(diào)，我們認(rèn)為這可能和誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的IL-10、TGF-β、PGE-2的下降有關(guān)，因此離心取腹腔液的上清，進(jìn)一步實(shí)施了IL-10、TGF-β、PGE-2的檢測(cè)。ELISA顯示，IL-10在治療組治療后、未治療組、對(duì)照組中的水平分別為18.26±4.53 ng/L、19.23±5.64 ng/L、20.56±5.21 ng/L，TGF-β在治療組治療后、未治療組、對(duì)照組中的水平分別34.01±12.89 ng/L、75.14±16.86 ng/L、25.32±10.26 ng/L，PGE-2在治療組治療后、未治療組、對(duì)照組中的水平分別22.49±4.65 ng/L、50.26±6.51 ng/L、16.34±6.43 ng/L(圖3)，統(tǒng)計(jì)顯示，未治療組與治療組治療后、對(duì)照組相比，TGF-β、PGE-2明顯更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.00)，而IL-10在三者間差異不明顯，無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖3 治療組治療后、未治療組、對(duì)照組腹腔液IL-10、TGF-β、PGE-2炎癥因子水平比較

3 討論

子宮內(nèi)膜異位癥是一種婦科常見病，發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能與腹腔內(nèi)環(huán)境有關(guān)，其中免疫因素的作用受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)[1-5]，多數(shù)子宮內(nèi)膜異位癥患者的腹腔液和病灶常伴Treg細(xì)胞的升高。

Treg細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫抑制細(xì)胞，通過分泌IL-10、TGF-β等細(xì)胞因子，或和T效應(yīng)細(xì)胞直接接觸，發(fā)揮免疫抑制功能。研究認(rèn)為[6]子宮內(nèi)膜異位癥患者病灶的Treg細(xì)胞升高，會(huì)形成局部免疫抑制，降低清除盆腔異位細(xì)胞的能力，進(jìn)而導(dǎo)致子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展。

但是我們認(rèn)為，異位子宮內(nèi)膜是由在位子宮內(nèi)膜逆流而來，是機(jī)體的正常組成部分，子宮內(nèi)膜在妊娠期間得到了母體激素的有效刺激，接觸了自身免疫細(xì)胞，形成了免疫耐受，用局部的免疫抑制解釋子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生發(fā)展可能不合理。

GnRH-a是治療子宮內(nèi)膜異位癥的藥物，其機(jī)制是抑制垂體促性腺激素的分泌，導(dǎo)致卵巢分泌的性激素減少，造成體內(nèi)低雌激素狀態(tài)。結(jié)果顯示，子宮內(nèi)膜異位癥患者確實(shí)上調(diào)了Treg細(xì)胞，未治療組相比于對(duì)照組，Treg細(xì)胞百分比明顯升高，但經(jīng)過GnRH-a治療后，伴隨雌二醇的下降，治療組的Treg細(xì)胞百分比也明顯降低，而且，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞的TGF-β、PGE-2的炎癥因子也出現(xiàn)下降，因此我們認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥患者腹腔存在炎癥，Treg細(xì)胞的上調(diào)可能與其誘導(dǎo)的炎癥因子的升高有關(guān)。

研究發(fā)現(xiàn)，子宮內(nèi)膜異位癥表現(xiàn)為炎癥性疾病，患者腹腔表達(dá)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、VEGF、TGF-β、PGE-2等許多炎癥因子[7-8]。對(duì)于炎癥因子出現(xiàn)的原因，我們認(rèn)為這與異位內(nèi)膜出血引起的炎癥有關(guān)，異位內(nèi)膜出血后囊壁壓力增大，反復(fù)形成破裂口，破裂后的囊內(nèi)容物刺激腹膜和卵巢，形成炎癥，周期性出血強(qiáng)化了這一作用，并一直持續(xù)，形成了永不愈合的傷口(此話原本是用來描述腫瘤的[9]，用來描述子宮內(nèi)膜異位癥可能更合適)。

然而，炎癥激活之后，機(jī)體會(huì)實(shí)施免疫調(diào)節(jié)[10]，免疫抑制相伴發(fā)生，形成抗炎反應(yīng)抑制炎癥，炎癥和抗炎相繼出現(xiàn)、相伴發(fā)生，Treg細(xì)胞作為典型的免疫抑制抗炎細(xì)胞，這可能是子宮內(nèi)膜異位癥激活炎癥后，Treg細(xì)胞隨后上調(diào)的原因。

這一現(xiàn)象也見于腫瘤，研究顯示腫瘤雖存在免疫抑制，但在使用免疫調(diào)節(jié)的CTLA-4、PD-1治療后，只有少數(shù)患者有效，多數(shù)患者療效不明顯[11-13]，這一結(jié)果提示免疫抑制和腫瘤發(fā)生有一定關(guān)系，但關(guān)系可能不充分，究其原因，我們認(rèn)為這可能也和免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，腫瘤組織因?yàn)檠苌L(zhǎng)不協(xié)調(diào)，特別是生長(zhǎng)較快的惡性腫瘤，不能及時(shí)供應(yīng)營(yíng)養(yǎng)，會(huì)出現(xiàn)缺氧或壞死，引起損傷性炎癥，如出現(xiàn)TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、VEGF、TGF-β等[14-15]，炎癥激活后實(shí)施免疫調(diào)節(jié)，免疫抑制出現(xiàn)，免疫抑制細(xì)胞繼發(fā)性聚集，但這種免疫抑制細(xì)胞的聚集在腫瘤發(fā)生之后。腫瘤發(fā)生與免疫抑制之間的因果關(guān)系不充分，這可能是腫瘤在解除免疫抑制后，因多數(shù)腫瘤來源于自身，突變負(fù)荷量不大，腫瘤抗原不強(qiáng)，免疫治療效果不明顯的原因。

使用GnRH-a治療子宮內(nèi)膜異位癥，雌激素下降，子宮內(nèi)膜萎縮或凋亡，無周期性出血，炎癥反應(yīng)減弱，同時(shí)，抗炎反應(yīng)也減弱，Treg細(xì)胞開始下降，這可能是使用GnRH-a治療后，Treg細(xì)胞下降的原因。

綜上所述，我們認(rèn)為子宮內(nèi)膜異位癥Treg細(xì)胞的上調(diào)可能是繼發(fā)于炎癥的免疫調(diào)節(jié)事件，與其誘導(dǎo)的炎癥因子有關(guān)。