介藜蘆堿調(diào)控miR-132-3p/FOXN3 軸抑制胃癌細胞遷移、侵襲機制研究

吳亞萍 馬君

胃癌是最常見的消化道腫瘤之一，其檢出率位居全球第五，死亡率僅次于肝癌和肺癌[1]。在中國，胃癌的發(fā)生率及死亡率均高于世界平均水平[2]。近年癌癥的治療手段不斷發(fā)展，但還是以手術(shù)治療為主。多數(shù)癌癥患者在診斷時已發(fā)生癌細胞的轉(zhuǎn)移，患者的中位生存期約為1年[1，3]。化療是中晚期癌癥患者的主要治療手段，但因化療藥物毒性及耐藥而大大限制了其臨床應(yīng)用和療效[4]。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial mesenchymal tran-sition，EMT）是上皮細胞轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞的生物過程，發(fā)生轉(zhuǎn)化的細胞具有侵襲性和遷移能力，腫瘤細胞的EMT 能力決定了多種類型的腫瘤惡性進展[5]。研究表明，EMT 是胃癌發(fā)生轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因素之一。介藜蘆堿是中藥藜蘆的重要單體成分，可以通過抑制非小細胞肺癌PI3K-AKT 信號促進細胞自噬的發(fā)生，從而抑制肺癌惡性進程[6-7]。然而其在胃癌中的作用尚未見報道，本研究將探討介藜蘆堿對胃癌的作用及相關(guān)機制。

1 實驗材料

1.1 細胞株 人胃癌細胞系NCI-N87（批號CL-0169）購于武漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 試劑 RPMI 1640 培養(yǎng)基（批號31800022）、胎牛血清（批號16000-044）購于美國Gibco 公司。Edu 細胞增殖檢測試劑盒（批號C0085S）、結(jié)晶紫（批號C0121）購于上海碧云天生物技術(shù)有限公司。Transwell 小室（批號3412）購自美國corning 公司。Trizol 試劑購于上海普飛生物科技有限公司。miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號638315）、定量PCR 試劑盒（批號RR820A）購于日本Takara 公司。一抗（E-cadherin、Vimentin、ZO-1、β-actin 批號分別為3195、5741、13663、3700）均購于美國CST 公司，細胞免疫熒光二抗（批號A-21072）購于美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 儀器 Ti-E 型熒光顯微鏡（日本尼康公司）；A1 HD25 型共聚焦顯微鏡（日本尼康公司）；BIORADXR 型成像儀（美 國 Bio -Rad 公 司）；LightCycler480Ⅱ型熒光定量PCR 儀（Roche 公司）。

2 實驗方法

2.1 細胞培養(yǎng) 將NCI-N87 細胞鋪板于96 孔板中，根據(jù)介藜蘆堿濃度不同，分為對照組（1%DMSO）、低劑量組（10μg/mL）和高劑量組（30μg/mL）。每組5 個復孔。將藥物按照上述劑量加入到對應(yīng)細胞中過夜培養(yǎng)，并按試劑盒使用說明書操作。Ti-E 型熒光顯微鏡下觀察拍照，利用image J 軟件統(tǒng)計Edu陽性率。

2.2 細胞遷移以及侵襲實驗 細胞遷移分為對照組（%DMSO）、低劑量組（10μg/mL）、高劑量組（30μg/mL），每組3 個復孔。藥物處理24h 后，消化細胞，離心，無血清培養(yǎng)基重懸細胞，將NCI-N87 細胞加入Transwell 上室。24h 后細胞取出，用棉簽將上室細胞拭去，顯微鏡下觀察結(jié)晶紫染色，拍照后利用image J 統(tǒng)計遷移細胞數(shù)。在Transwell 膜上涂抹基質(zhì)膠各組進行侵襲實驗。

2.3 細胞免疫熒光 實驗分組同上，將各組NCIN87 細胞鋪板于24 孔板細胞爬片上，藥物處理24h后，加入一抗、二抗孵育，對NCI-N87 細胞進行DAPI染色。使用共聚焦顯微鏡觀察拍照。

2.4 蛋白免疫印記 實驗分組同上，各組細胞鋪板于6 孔板中，經(jīng)過藥物處理24h 后，利用1×loading 直接裂解NCI-N87 細胞蛋白，制作電泳樣品。經(jīng)過電泳-轉(zhuǎn)膜封閉后，進行一抗、二抗孵育。加入化學反應(yīng)底物，利用成像儀進行成像分析。實驗進行3 次獨立重復。

2.5 定量PCR 實驗分組同上，各組細胞鋪板于6孔板中，藥物處理24h 后，trizol 提取NCI-N87 細胞RNA，RR036A、RR037A 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄mRNA 及miRNA。定量PCR 試劑盒檢測NCI-N87 細胞RNA表達水平。相關(guān)特異性引物序列如下：FOXN3：F-5'-ACTCTGACATGCCCTACGATG-3'，R-5'-TCTGACTCCTCTCTTTGTCCAC-3'；miR-132-3p：F-5'-CCAGCATAACAGTCTACAGCC-3'，R-5'-TATGGTTGTTCACGACTCCTTCAC-3'；U6：F-5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，R-5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。GAPDH 及U6 分別為mRNA 及miRNA 的內(nèi)參。以上引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。反應(yīng)體系置于LightCycler480Ⅱ型熒光定量PCR 儀中檢測。

2.6 統(tǒng)計學方法 應(yīng)用SPSS 22.0 對實驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差（）表示，多組均數(shù)間比較行單因素方差分析，兩組之間比較采用LSD 檢驗，P＜0.05 認為差異有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 介藜蘆堿對胃癌細胞增殖的影響 細胞增殖檢測結(jié)果顯示，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細胞Edu 陽性細胞數(shù)與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見圖1。

圖1 Edu 檢測介藜蘆堿對胃癌細胞NCI-N87 增殖的影響（400×）

3.2 介藜蘆堿抑制胃癌細胞遷移、侵襲 介藜蘆堿處理胃癌細胞24h 后，發(fā)現(xiàn)介藜蘆堿可以明顯抑制胃癌細胞的遷移和侵襲，并呈現(xiàn)劑量依賴性，低劑量即可減少胃癌細胞侵襲和遷移的數(shù)量，而高劑量效果更加顯著（見圖2）。統(tǒng)計侵襲和遷移的細胞數(shù)并計算相對遷移率和侵襲率結(jié)果顯示，與對照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細胞NCI-N87 的遷移率和侵襲率均顯著降低（P 均＜0.05）。見表1。

圖2 介藜蘆堿對胃癌細胞遷移和侵襲的作用（結(jié)晶紫染色400×）

表1 介藜蘆堿對胃癌細胞相對遷移率和侵襲率的影響（%，）

表1 介藜蘆堿對胃癌細胞相對遷移率和侵襲率的影響（%，）

注：對照組為NCI-N87 細胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對照組比較，aP＜0.05

3.3 介藜蘆堿抑制胃癌細胞EMT 過程 細胞免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細胞NCI-N87 中E-cadherin 表達水平顯著升高（見圖3A）。蛋白免疫印跡實驗發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，低、高劑量介藜蘆堿促進胃癌細胞NCI-N87 E-cadherin 蛋白表達，降低Vimentin、ZO-1 蛋白表達水平（見圖3B），灰度統(tǒng)計結(jié)果顯示，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表2。

圖3 介藜蘆堿對E-cadherin、Vimentin、ZO-1 表達的影響

表2 介藜蘆堿對E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表達的影響（）

表2 介藜蘆堿對E-cadherin、Vimentin、ZO-1 蛋白表達的影響（）

注：對照組為NCI-N87 細胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對照組比較，aP＜0.05

3.4 介藜蘆堿調(diào)控胃癌細胞miR-132-3p/FOXN3軸 與對照組比較，介藜蘆堿低、高劑量組胃癌細胞miR-132-3p 表達明顯降低，其靶基因FOXN3 表達明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（P 均＜0.05）。見表3。

表3 介藜蘆堿對胃癌細胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相對表達量的影響（）

表3 介藜蘆堿對胃癌細胞miR-132-3p 和FOXN3 mRNA相對表達量的影響（）

注：對照組為NCI-N87 細胞未經(jīng)處理；低劑量組為10μg/mL 介藜蘆堿處理組；高劑量組為30μg/mL 介藜蘆堿處理組；與對照組比較，aP＜0.05

4 討論

介藜蘆堿是從藜蘆中分離出的天然甾體生物堿。研究表明，其可以抑制人骨髓增生異常細胞的增殖并促進其凋亡，從而減輕骨髓增生異常綜合癥[8]。同時研究發(fā)現(xiàn)，介藜蘆堿可以通過誘導自噬來抑制人肝細胞癌的進展[9]。

胃癌細胞惡性增殖以及轉(zhuǎn)移是導致胃癌惡性進展的主要原因。本研究首先檢測了介藜蘆堿對胃癌細胞的增殖影響，利用不同劑量的介藜蘆堿處理胃癌細胞，對其細胞增殖并無影響。因此，我們進一步探討了介藜蘆堿對胃癌細胞遷移及侵襲的影響，研究結(jié)果顯示，介藜蘆堿對胃癌細胞NCI-N87 的遷移和侵襲有明顯的抑制作用。

EMT 是腫瘤細胞獲得高轉(zhuǎn)移和侵襲能力的關(guān)鍵過程[10]。發(fā)生時E-cadherin 下降，而Vimentin、ZO-1表達上調(diào)[11]。檢測介藜蘆堿對E-cadherin、Vimentin及ZO-1 表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，低、高劑量的介藜蘆堿均能夠上調(diào)E-cadherin 表達、降低Vimentin 與ZO-1 的表達。提示介藜蘆堿對胃癌細胞遷移、侵襲的抑制作用可能是通過調(diào)控EMT 相關(guān)蛋白的表達發(fā)揮作用的。

胃癌是一種上皮源性腫瘤，主要的轉(zhuǎn)移機制是EMT 過程的轉(zhuǎn)變，隨著癌細胞的不斷增殖，癌灶越來越大，逐漸侵犯富含淋巴管的黏膜肌層和下層，部分胃癌細胞脫落原發(fā)灶轉(zhuǎn)移至毛細淋巴管周圍，與淋巴管內(nèi)皮細胞緊密黏附，進入淋巴管腔，達到淋巴結(jié)，形成遠端轉(zhuǎn)移[12]。本研究結(jié)果顯示，介藜蘆堿可以明顯抑制胃癌細胞的EMT 行為，這將極大限制胃癌遠端轉(zhuǎn)移的可能性。

miRNA 是由21～25 個核苷酸組成的一類非編碼RNA，參與基因調(diào)控[13]。miRNA 在胃癌的治療、診斷及預后方面具有重要意義[14-15]。已知miR-132-3p 在多種腫瘤中發(fā)揮重要作用，并有可能作為早期檢測腫瘤發(fā)展、進展和轉(zhuǎn)移的預后標志物[16]。檢測介藜蘆堿處理后miR-132-3p 的表達，結(jié)果顯示，介藜蘆堿可降低miR-132-3p 的表達而增加其靶基因FOXN3的表達。因此，介藜蘆堿可能通過影響miR-132-3p及靶基因FOXN3 的表達，抑制胃癌EMT 進程，降低胃癌的遷移、侵襲能力。