基于分子對(duì)接技術(shù)篩選抗SARS-CoV-2海洋活性肽的研究

步 營，劉瑛楠，何 瑋，朱文慧，李學(xué)鵬，儀淑敏，徐永霞，勵(lì)建榮

（渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州 121013）

0 引言

2019年12月，新型冠狀病毒肺炎席卷全球。SARS-CoV-2作為一種新型病毒，突兀地登上了國際熱點(diǎn)的舞臺(tái)，威脅人民的生命安全，影響人民的正常生活。因此現(xiàn)階段對(duì)于它的研究也在如火如荼的進(jìn)行，例如對(duì)其的治療、疫苗的研發(fā)、保健食品的生產(chǎn)等。

研究發(fā)現(xiàn)，SARS-CoV-2與SARS-CoV同屬β型冠狀病毒類，雖然現(xiàn)階段SARS-CoV-2晶體結(jié)構(gòu)不明，但其S蛋白R(shí)BD結(jié)構(gòu)域的某些基因區(qū)域與SARS-CoV具有高度的同源性，它們的功能性受體皆為血管緊張素轉(zhuǎn)化酶2（angiotensin converting enzyme 2，ACE2）［1］，致病機(jī)理相同，皆為病毒的S蛋白與宿主細(xì)胞上的ACE2受體結(jié)合，從而致使病毒入侵宿主［2］。由此，可以選擇與其同源性較高的SARS病毒的S蛋白和ACE2（即SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白）作為代替的研究對(duì)象［3-5］，進(jìn)行新冠病毒抑制機(jī)理的研究。另一方面，由于2019-nCoV Mpro水解酶關(guān)系著SARSCoV-2前體蛋白的成熟，阻斷其水解酶活性表達(dá)就可抑制病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制過程。上海科技大學(xué)饒子和/楊海濤團(tuán)隊(duì)公開了2019-nCoV Mpro水解酶的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)，可以使其作為對(duì)SARS-CoV-2有抑制作用的另一研究對(duì)象，通過篩選抑制劑，有效遏制SARS-CoV-2在宿主體內(nèi)的復(fù)制，阻斷其增殖過程。

我國海洋資源豐富，藍(lán)鰭金槍魚屬于大洋性中上層高度洄游魚類，是金槍魚類中經(jīng)濟(jì)價(jià)值最高的種類，而經(jīng)酶解處理的蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物具有多種生物活性功能［6］。經(jīng)數(shù)據(jù)庫查詢，藍(lán)鰭金槍魚的肌球蛋白序列已知。鑒于此，本文采用計(jì)算機(jī)酶解和分子對(duì)接的方法，對(duì)藍(lán)鰭金槍魚的肌球蛋白進(jìn)行模擬酶解，進(jìn)而篩選對(duì)新冠病毒有抑制作用的活性肽，為進(jìn)一步應(yīng)用于保健食品提供思路。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藍(lán)鰭金槍魚的肌球蛋白可通過蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫UniProt（https：//www.uniprot.org/）查 詢 得 到［7］，UniProtKB ID號(hào)為G9M5T1的，其序列為FAST格式。

SARS-CoV病毒晶體結(jié)構(gòu)的PDB代碼為2AJF，選擇僅保留晶體結(jié)構(gòu)中的A鏈（ACE2）和E鏈（SARA-CoV-S）作為研究對(duì)象，結(jié)構(gòu)如圖1所示。2019-nCoV Mpro水解酶晶體結(jié)構(gòu)的PDB代碼為6LU7，如圖2所示。

圖1 SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白的三維構(gòu)型Fig.1 Three-dimensional configuration of SARS-CoV-S/ACE2 compound protein

圖2 2019-nCoV Mpro水解酶的三維構(gòu)型Fig.2 Three-dimensional configuration of 2019-nCoV Mpro hydrolase

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 計(jì)算機(jī)虛擬酶解

運(yùn)用生物信息學(xué)的方法，以肌球蛋白G9M5T1序列作為原料，并通過酶切工具Peptide Cutter（https：//web.expasy.org/peptide_cutter/）選擇pepsin ph1.3，trypsin，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）3種酶對(duì)該蛋白進(jìn)行模擬酶解［8］。

1.2.2 海洋活性肽的活性預(yù)測

使用活性預(yù)測工具 Peptide Ranker（http：//distilldeep.ucd.ie/PeptideRanker/）對(duì)海洋多肽片段的活性進(jìn)行預(yù)測，從中篩選高活性（>0.5）的肽片段。

1.2.3 海洋活性肽的毒性預(yù)測

對(duì)海洋活性肽使用毒性預(yù)測工具ToxinPred（http：//crdd.osdd.net/raghava/toxinpred/）毒性預(yù)測，篩選無毒的海洋活性肽［9］。

1.2.4 篩選未知活性肽

使用生物活性肽數(shù)據(jù)庫Peptides HGATSearch（http：//www.peptides.be/?p=search）篩 選未知作用的海洋活性肽進(jìn)行下一步的研究。

1.2.5 海洋活性肽三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建

使用 Discovery Studio 2017（DS，v17.2.016349）軟件對(duì)酶解得到的高活性且無毒的海洋活性肽序列的三維結(jié)構(gòu)進(jìn)行構(gòu)建。在DS軟件中畫出多肽結(jié)構(gòu)，對(duì)其進(jìn)行“Clean Geometry”處理，得到其三維結(jié)構(gòu)。

1.2.6 分子對(duì)接

分子對(duì)接是一種用來研究分子間相互作用的一種方法［10］。去除SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白和2019-nCoV Mpro水解酶的水分子和配體，并進(jìn)行“Clean Protein”以及“Prepare Protein”的前處理操作。確定SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白的關(guān)鍵氨基酸分別為ACE2片段上ASP38，GLN42，GLN325，GLU329，以 及 S蛋 白 上 的 TYR436，TYR491。確定2019-nCoV Mpro水解酶的關(guān)鍵氨基酸為 THR24，THR25，THR26，LEU27，ASN28以及ASN119［11］。對(duì)30條海洋活性肽片段進(jìn)行“Full Minimization”和“Prepare Ligands”的前處理操作，與處理后的SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白以及2019-nCoV Mpro水解酶分別進(jìn)行Dock Ligands（LibDock）分子對(duì)接，選擇“BEST”構(gòu)象，其余參數(shù)均設(shè)置為默認(rèn)狀態(tài)［12］。與海洋活性肽配體對(duì)接結(jié)束后篩選結(jié)果中對(duì)接成功的化合物，選取分值（LibDockScore）最高的作為該化合物的對(duì)接結(jié)果。按照分值的大小將對(duì)接成功的配體排序，篩選與受體結(jié)合口袋中關(guān)鍵氨基酸結(jié)合作用力強(qiáng)的化合物，作為SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合阻斷劑以及2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑的候選海洋活性肽［13］。

2 結(jié)果與分析

2.1 計(jì)算機(jī)模擬酶解結(jié)果

G9M5T1經(jīng)trypsin模擬酶解后產(chǎn)生302條肽片段；經(jīng)pepsin ph1.3酶解后產(chǎn)生369條肽片段；經(jīng)chymotrypsin-low specificity （C-term to ［FYW］，not before P）酶解后產(chǎn)生392條肽片段。

2.2 活性預(yù)測結(jié)果

對(duì)所得到的肽片段使用Peptide Ranker工具分析，篩選活性肽，進(jìn)行進(jìn)一步的研究。篩選結(jié)果大于0.5的預(yù)測結(jié)果，經(jīng)trypsin，pepsin ph1.3，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）酶解得到的肽片段中分別篩選出22條、17條和42條活性肽。

2.3 毒性預(yù)測結(jié)果

使用ToxinPred工具對(duì)活性肽進(jìn)行毒性預(yù)測，篩選無毒活性肽，避免有毒物質(zhì)進(jìn)入人體從而對(duì)人體產(chǎn)生毒害作用。預(yù)測結(jié)果為所有活性肽均為無毒片段。

2.4 未知活性肽篩選結(jié)果

為避免與其他已知的活性肽進(jìn)行重復(fù)性研究，使用Peptides HGAT-Search數(shù)據(jù)庫對(duì)活性肽進(jìn)行篩選，篩選經(jīng) trypsin，pepsin ph1.3，chymotrypsin-low specificity（C-term to［FYW］，not before P）酶解后得到的未知無毒海洋活性肽，其結(jié)果如表1所示（分別用T*，P*，C*表示）。篩選結(jié)果即為對(duì)接過程最終所用的海洋活性肽配體序列，對(duì)其進(jìn)行三維結(jié)構(gòu)的構(gòu)建。

表1 G9M5T1酶解后得到的未知海洋無毒活性肽Tab.1 Unknown marine non-toxic active peptides obtained after G9M5T1 enzymolysis

2.5 分子對(duì)接結(jié)果

2.5.1 SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合抑制劑篩選結(jié)果

表1中的30條海洋活性肽中的19條與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接成功。氫鍵的分子作用力較大，結(jié)合作用較強(qiáng)，故篩選對(duì)接結(jié)果中與關(guān)鍵氨基酸以氫鍵作用相結(jié)合的10條海洋活性肽，作為潛在的對(duì)與ACE2的結(jié)合有阻斷作用的活性肽片段，結(jié)果如表2所示。該10條多肽皆與SARS-CoV-S/ACE2蛋白對(duì)接口袋中關(guān)鍵氨基酸形成氫鍵化合物，其中，C4與TYR491形成3個(gè)氫鍵，分值為144.909；C8與TYR491形成2個(gè)氫鍵，T13與GLN325形成1個(gè)氫鍵，P5與GLN325形成2個(gè)氫鍵，P6與GLU329形成2個(gè)氫鍵外，它們還與其他關(guān)鍵氨基酸形成范德華力等其他作用力，分值分別為164.154、149.265、133.059、119.918，如圖3所示。綜上所述，活性肽C4，C8，T13，P5，P6 經(jīng)分子對(duì)接后與對(duì)接受體結(jié)合作用較強(qiáng)，分析病毒入侵宿主的機(jī)理可知，以上活性肽對(duì)SARS-CoV與ACE2的結(jié)合有潛在的強(qiáng)阻止作用，能阻斷S蛋白與ACE2受體結(jié)合，從而阻止SARS-CoV-2入侵宿主細(xì)胞?？蛇M(jìn)一步應(yīng)用于對(duì)新型冠狀病毒肺炎的預(yù)防等過程。

表2 對(duì)SARS-CoV-2結(jié)合ACE2阻斷劑的篩選Tab.2 Screening of SARS-CoV-2 combined with ACE2 blocker

圖3 活性肽段與SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白對(duì)接平面圖Fig.3 View of active peptides docking with SARS-CoV-S/ACE2 complex protein

2.5.2 2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑篩選結(jié)果

海洋活性肽與2019-nCoV Mpro水解酶進(jìn)行分子對(duì)接后，有25條活性肽成功與Mpro水解酶受體對(duì)接成功，其中18條肽片段與關(guān)鍵氨基酸以氫鍵的形式結(jié)合，結(jié)果如表3所示。其中C7，T13與 THR24，THR26，ASN119形成氫鍵，分值分別為 199.696 和 183.583；T9，P5，C8 與 THR26，ASN119形成氫鍵，分值分別為199.490、180.616和 175.280；P7、T11 與 THR24，THR26 形成氫鍵，分值 分別為 182.785和 162.997；T8與 THR24，THR25，THR26形成氫鍵，分值為177.758；P9與THR25，THR26形成氫鍵，分值為163.683。此外，這些海洋活性肽不僅與對(duì)接受體形成了多個(gè)氫鍵，還與關(guān)鍵氨基酸間形成范德華力等作用力。T3，C6與 THR26形成 2個(gè)氫鍵，且與 THR24，THR25，LEU27間形成范德華力，分值分別為163.379、156.337；C4與 THR24形成 2個(gè)氫鍵，與THR24，THR26，LEU27間有范德華力作用，分值為 150.652；P8，P6，T5，P3，T12，T10，除與關(guān)鍵氨基酸形成的氫鍵外，還與THR24，THR25，THR26，LEU27，ASN119等關(guān)鍵氨基酸間形成其他分子間作用力，分值分別為 191.320、188.958、179.405、177.136、143.197。對(duì)接結(jié)果見圖4所示。綜上所述，海洋活性肽片段 C7，T13，T9，P5，C8，P7，T11，T8，T5，P9，T3，C6，C4，P8，P6，P3，T12，T10 與受體對(duì)接后可形成較強(qiáng)的分子間作用力，可用作篩選2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑［14］，而抑制 2019-nCoV Mpro水解酶的活性表達(dá)可以影響SARSCoV-2前體蛋白的成熟過程，進(jìn)一步影響病毒在宿主體內(nèi)的復(fù)制過程［15-16］，從而抑制SARSCoV-2的表達(dá)。

表3 對(duì)2019-nCoV Mpro水解酶阻斷劑的篩選Tab.3 Screening of 2019-nCoV Mpro hydrolase blocker

3 結(jié)論

以SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白以及2019-nCoV Mpro水解酶的晶體結(jié)構(gòu)為受體，與30條未知的無毒海洋活性肽進(jìn)行半柔性分子對(duì)接。結(jié)果可知，海洋活性肽片段 DIAGF，NIRSF，IRIHF，ASWMIYTYSG，STHPHFVR 與 SARS-CoV-S/ACE2復(fù)合蛋白受體結(jié)合緊密，是潛在的SARS-CoV-2與ACE2結(jié)合阻斷劑；海洋活性肽片段FPKASDTTF，STHPHFVR，EFLWMVIR，IRIHF，NIRSF，RSTHPHF，SFMNVK，NPPNFDK，LRMDL，GFLMR，NITGW，DIAGF，F(xiàn)DAKTAF，ASWMIYTYSG，NHHMFV，ILYGDFK，GGSFQTVSALFR 與 Mpro 水解酶結(jié)合作用較強(qiáng)，是潛在的2019-nCoV Mpro水解酶抑制劑。

綜上所述，活性肽段NIRSF，STHPHFVR，DIAGF，IRIHF和ASWMIYTYSG對(duì)兩種對(duì)接受體的表達(dá)均有良好的抑制作用，是SARS-CoV-2的潛在抑制劑，可進(jìn)一步應(yīng)用于保健食品的開發(fā)制造。