食源性創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

姚文艷，姜 暉

（東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210096）

創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）是一種嗜鹽性革蘭氏陰性條件致病菌，主要存在于海水及海底沉積物中［1］。該菌的多個(gè)組成成分（如莢膜多糖、Ⅳ型菌毛、溶血素和細(xì)胞外金屬蛋白酶等）作為毒力因子起著重要的致病作用［2－4］。創(chuàng)傷弧菌通過(guò)傷口或腸道感染傳播，可導(dǎo)致多種水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物和人體患病，引發(fā)人體腸胃炎、腦膜炎、原發(fā)性敗血癥、傷口組織壞死等疾病［5－6］。在所有食源性病原體中，創(chuàng)傷弧菌的病死率最高，且發(fā)病迅速，傷口感染的平均潛伏期僅為16 h，敗血癥的平均潛伏期為26 h［7］。美國(guó)疾病控制和預(yù)防中心在1964年首次分離出創(chuàng)傷弧菌［8］。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國(guó)超過(guò)95%的海產(chǎn)品相關(guān)死亡案例由創(chuàng)傷弧菌感染引起［9］；我國(guó)臺(tái)灣也報(bào)道了多起創(chuàng)傷弧菌感染死亡病例［10］；歐盟于2003年要求從我國(guó)進(jìn)口的魚蝦等海產(chǎn)品必須進(jìn)行創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)。因此，有效的檢測(cè)技術(shù)在創(chuàng)傷弧菌感染臨床檢驗(yàn)及食品安全保障方面非常重要。本文將介紹創(chuàng)傷弧菌的傳統(tǒng)與現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)，為創(chuàng)傷弧菌的有效防控及患者的診斷治療提供科學(xué)依據(jù)。

1 傳統(tǒng)病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)

基于常規(guī)病原學(xué)診斷方法，食品和藥物管理局細(xì)菌分析手冊(cè)（FDA－BAM）標(biāo)準(zhǔn)法中詳細(xì)規(guī)定了食品中創(chuàng)傷弧菌的檢驗(yàn)程序?；静襟E包括樣本的制備、選擇性富集培養(yǎng)、選擇性分離培養(yǎng)、純培養(yǎng)、細(xì)菌形態(tài)觀察、生化檢測(cè)等，其中選擇性培養(yǎng)基的分離鑒定是關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，常用的創(chuàng)傷弧菌培養(yǎng)法主要有基于選擇性培養(yǎng)基的直接培養(yǎng)法、增菌培養(yǎng)法和顯色培養(yǎng)法，此3種培養(yǎng)方法的比較如表1所示。適用于創(chuàng)傷弧菌的選擇性培養(yǎng)基有許多種，主要包括VVMc培養(yǎng)基和mCPC瓊脂培養(yǎng)基等［11］?；谶x擇性培養(yǎng)基的直接培養(yǎng)法檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率低，對(duì)目標(biāo)菌株的最低檢出量相對(duì)較高。當(dāng)采集樣本中含有雜菌時(shí)，雜菌可進(jìn)一步抑制創(chuàng)傷弧菌的增長(zhǎng)，較難培養(yǎng)獲取純菌株，使目標(biāo)菌株的菌落數(shù)量低于最低檢出量，從而造成漏檢。增菌培養(yǎng)法可有效提高目標(biāo)菌株檢測(cè)的靈敏度。我國(guó)首個(gè)創(chuàng)傷弧菌食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)（GB 4789.44－2020）《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)創(chuàng)傷弧菌檢驗(yàn)》即是將增菌培養(yǎng)法和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）檢測(cè)相結(jié)合，用于水產(chǎn)品中的創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)，有效提高了檢測(cè)效率［12］。且加入適當(dāng)?shù)目股乜捎行б种拼蟛糠指锾m氏陽(yáng)性細(xì)菌，提高增菌效果［13］。此外，顯色培養(yǎng)法可根據(jù)菌落顏色直接鑒定菌種，避免了對(duì)菌落大小形態(tài)類似的菌株做進(jìn)一步分離培養(yǎng)鑒定的復(fù)雜操作程序，極大提升了目標(biāo)菌株的檢測(cè)效率［14］。

表1 創(chuàng)傷弧菌3種培養(yǎng)方法的比較Table 1 Comparison of three culture methods of V.vulnif icus

2 免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)

免疫學(xué)檢測(cè)方法基于抗原抗體的特異性反應(yīng)實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)菌株的識(shí)別響應(yīng)。目前，細(xì)菌抗體的抗原靶點(diǎn)包括細(xì)菌表面的脂多糖（LPS）、莢膜多糖以及外毒素等。由于以整個(gè)目標(biāo)菌體作為檢測(cè)對(duì)象，其準(zhǔn)確性取決于抗原抗體的特異性結(jié)合能力。反應(yīng)過(guò)程中的非特異性吸附會(huì)帶來(lái)假陽(yáng)性結(jié)果。相比于病原學(xué)檢測(cè)方法，免疫學(xué)方法可將檢測(cè)時(shí)間縮短至數(shù)小時(shí)，操作更加簡(jiǎn)便，尤其是與層析技術(shù)相結(jié)合可通過(guò)肉眼直接觀察病原菌的檢測(cè)結(jié)果，無(wú)需專門的分析設(shè)備，實(shí)用性強(qiáng)而被廣泛應(yīng)用。但免疫學(xué)方法仍需在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行目標(biāo)菌株的增殖培養(yǎng)，無(wú)法實(shí)現(xiàn)食品樣本的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)；其抗體難獲取，易失活，且存在較明顯的非特異性反應(yīng)，目前該方法還在進(jìn)一步的改進(jìn)研究中。

2.1 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法

酶聯(lián)免疫吸附技術(shù)（ELISA）將酶催化下的底物顯色反應(yīng)與酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的特異性靈敏檢測(cè)，主要包括直接ELISA、間接ELISA、雙抗體夾心ELISA及競(jìng)爭(zhēng)ELISA等。ELISA技術(shù)對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)應(yīng)用由來(lái)已久，早在1997年Biosca等［15］便開發(fā)了一種基于兔體內(nèi)抗LPS的多克隆抗體的間接ELISA檢測(cè)方法，成功用于鰻鱺魚感染的創(chuàng)傷弧菌生物型2的檢測(cè)，檢出限為104個(gè)細(xì)胞/孔～105個(gè)細(xì)胞/孔，并用于檢測(cè)非可培養(yǎng)狀態(tài)的細(xì)胞。張家敏等［16］成功制備出創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素鼠源性單克隆抗體，可用于檢測(cè)自然表達(dá)的創(chuàng)傷弧菌溶細(xì)胞素。劉秀萍等［17］開發(fā)了一種雙抗體夾心ELISA法，用于食物樣品中擬態(tài)弧菌、副溶血弧菌和創(chuàng)傷弧菌毒素的快速、同時(shí)、靈敏檢測(cè)。古小莉等［18］建立了一種創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)的斑點(diǎn)ELISA技術(shù)，可直接肉眼判定檢測(cè)結(jié)果，方便經(jīng)濟(jì)，便于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。

2.2 免疫層析法

免疫層析法（IC）是在硝酸纖維素膜上固定特異性抗體，將待測(cè)樣品浸入到該膜的一端，之后樣品會(huì)在毛細(xì)管的作用下沿著硝酸纖維素膜向前移動(dòng)，當(dāng)移動(dòng)到有抗體存在的區(qū)域時(shí)，抗體會(huì)特異性結(jié)合樣品中對(duì)應(yīng)的抗原。該區(qū)域可通過(guò)膠體金或酶染色來(lái)顯色，從而實(shí)現(xiàn)待測(cè)物的特異性診斷。嚴(yán)智敏等［19］制備出一種用于創(chuàng)傷弧菌快速檢測(cè)的免疫層析試紙條，可在20～30 min內(nèi)獲得檢測(cè)結(jié)果，檢出限為2×106CFU/mL，且對(duì)奇異變形桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌等12株非目標(biāo)菌無(wú)交叉反應(yīng)。這種基于反應(yīng)信號(hào)放大的快速診斷方法具有可視化、成本低廉、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)，可滿足基層單位及現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求，無(wú)需專業(yè)人員即可定期進(jìn)行檢測(cè)，有助于對(duì)病原體感染進(jìn)行快速篩查，但該技術(shù)也存在不能精確定量、檢出限較高的問(wèn)題。

3 分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)

分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)以DNA或RNA作為靶標(biāo)序列，能夠?qū)崿F(xiàn)目標(biāo)菌株的快速自動(dòng)化檢測(cè)，具有特異性強(qiáng)、可重復(fù)性好等特點(diǎn)。目前，應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有PCR及其衍生技術(shù)、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）和重組酶聚合酶擴(kuò)增（RPA）技術(shù)（表2）。

表2 創(chuàng)傷弧菌的分子生物學(xué)檢測(cè)方法比較Table 2 Comparison of molecular biological detection methods of V.vulni ficus

3.1 基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的檢測(cè)技術(shù)

PCR及其衍生技術(shù)已廣泛應(yīng)用于各種細(xì)菌檢測(cè)。與其他常規(guī)方法相比，基于PCR的方法顯示出更好的特異性、更高的靈敏度、更短的分析時(shí)間和更高的準(zhǔn)確性［20－22］。應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的PCR技術(shù)主要有常規(guī)PCR、多重PCR（mPCR）、最大可能數(shù)PCR（MNP－PCR）和實(shí)時(shí)PCR（RT－PCR）等。如圖1所示，Yin等［23］基于vvh A基因、膠原酶基因和t oxR基因開發(fā)了一種多次觸點(diǎn)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（MTPCR）方法，成功用于臨床樣本及環(huán)境中創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和溶藻弧菌的同時(shí)快速檢測(cè)。該方法對(duì)創(chuàng)傷弧菌的靈敏度可達(dá)104CFU/mL，對(duì)副溶血弧菌和溶藻弧菌的靈敏度均為103CFU/mL，特異性為100%。Tsai等［24］基于r poS、toxR、mecA、gcat、dnas eB和G B6個(gè)物種特異性基因的新組合構(gòu)建mPCR法，同時(shí)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、A組鏈球菌和B組鏈球菌，結(jié)果表明該方法的準(zhǔn)確率為87.5%。Baker－Austin等［25］利用靶向致病性創(chuàng)傷弧菌的pi lF基因開發(fā)的RT－PCR檢測(cè)法可在47株創(chuàng)傷弧菌分離株中成功檢測(cè)致病菌株，準(zhǔn)確率達(dá)97.9%。Bonny等［26］將多重PCR與MNP技術(shù)相結(jié)合，建立了同時(shí)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌、霍亂弧菌和副溶血弧菌的多重MNP－PCR技術(shù)，其檢測(cè)結(jié)果與單重MNP－PCR無(wú)顯著性差異。

圖1 MT－PCR測(cè)定陽(yáng)性臨床和環(huán)境樣品的部分結(jié)果［23］Fig.1 Partial results of positive clinical and environmental samples by MT－PCR assay［23］

3.2 核酸等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)技術(shù)

核酸等溫?cái)U(kuò)增是近年發(fā)展起來(lái)的新技術(shù)。該技術(shù)無(wú)需精良的設(shè)備，酶和DNA可在恒溫下進(jìn)行反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)DNA片段的擴(kuò)增。相比于PCR技術(shù)，核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)具有反應(yīng)溫度更易控制、儀器設(shè)備簡(jiǎn)單和加熱耗能少等優(yōu)點(diǎn)，故成為替代PCR的潛在技術(shù)。核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有LAMP、鏈置換擴(kuò)增（SDA）、RPA和聚合酶螺旋反應(yīng)（PSR）等。其中，用于創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有LAMP和RPA技術(shù)。

LAMP是目前應(yīng)用最廣泛的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，可快速檢測(cè)多種微生物［27－28］。Ren等［29］建立了快速檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌的LAMP技術(shù)，靈敏度是常規(guī)PCR的10倍。研究者還將LAMP與其他檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合，極大提高了該方法的靈敏度。Han等［30］使用實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)和LAMP實(shí)時(shí)濁度法兩種方法定量檢測(cè)生蠔中的創(chuàng)傷弧菌。在對(duì)38個(gè)目標(biāo)菌株和42個(gè)非目標(biāo)菌株的檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中，兩種方法均無(wú)假陽(yáng)性或假陰性結(jié)果，在生蠔加標(biāo)樣本中的檢測(cè)靈敏度可達(dá)PCR技術(shù)的1 000倍。此外，Surasilp等［31］將橫向流動(dòng)試紙法（LFD）與LAMP技術(shù)相結(jié)合，可精準(zhǔn)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌污染的食物樣本，純培養(yǎng)物中的檢出限為每次反應(yīng)2.8 CFU。

RPA技術(shù)的整個(gè)體系主要包括重組酶T4 UvsX、單鏈結(jié)合蛋白和鏈置換DNA聚合酶等［32］。2006年P(guān)iepenburg等［33］首次使用參與細(xì)胞內(nèi)DNA合成、重組和修復(fù)的蛋白質(zhì)開發(fā)了RPA技術(shù)，目前由TwistDX公司商業(yè)化（www.twistdx.co.uk）。相比于PCR，RPA不依賴溫控設(shè)備，無(wú)需熱變性，在常溫下即可完成擴(kuò)增反應(yīng)，適用于現(xiàn)場(chǎng)便攜式快速核酸檢測(cè)?？捎糜赗PA產(chǎn)物檢測(cè)的技術(shù)主要有側(cè)向流動(dòng)試紙條法（LFS）、凝膠電泳和實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)。Yang等［34］利用實(shí)時(shí)RPA建立了一種靶向創(chuàng)傷弧菌菌體外金屬蛋白酶（EMPV）基因的快速檢測(cè)方法。該方法的特異性良好，39℃下可在2～14 min內(nèi)完成檢測(cè)，檢出限為每次反應(yīng)17個(gè)基因拷貝或1 CFU。在臨床樣本檢測(cè)中，實(shí)時(shí)RPA的結(jié)果與生物測(cè)試和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）完全一致。需要注意的是，該方法可以抵抗食物基質(zhì)的干擾，快速簡(jiǎn)單，具有廣泛應(yīng)用于食品安全控制中創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的可能性。如圖2所示，該課題組［35］進(jìn)一步將具備可視信號(hào)的側(cè)向流動(dòng)試紙條與RPA技術(shù)組合，開發(fā)了靶向創(chuàng)傷弧菌E M P V基因的RPA－LFS檢測(cè)法，其檢出限比實(shí)時(shí)RPA更低，可達(dá)到每次反應(yīng)2個(gè)拷貝或0.1 CFU，富集4 h后可達(dá)1 CFU/10 g株菌加標(biāo)食物樣品。Wang等［36］以霍亂弧菌的lolB基因和創(chuàng)傷弧菌的E M PV基因作為檢測(cè)標(biāo)志物，建立了基于RPA－LFS的生物傳感器，用于同時(shí)雙靶標(biāo)檢測(cè)霍亂弧菌和創(chuàng)傷弧菌。該方法具有較好的特異性，檢出限為每次反應(yīng)10個(gè)基因拷貝，且臨床樣品驗(yàn)證結(jié)果與RT－PCR反應(yīng)結(jié)果一致。該方法檢測(cè)過(guò)程簡(jiǎn)單快速，37℃下反應(yīng)30 min后，在5 min內(nèi)即可實(shí)現(xiàn)試紙條帶上的可視化檢測(cè)。

圖2 RPA－LFS方法對(duì)創(chuàng)傷弧菌的檢出限［35］Fig.2 Detection limit of RPA－LFS for V.vulnif ic us［35］

4 新型檢測(cè)技術(shù)

4.1 生物芯片技術(shù)

生物芯片技術(shù)利用微縮法將一組識(shí)別配體如DNA、蛋白質(zhì)、抗體等［37］固定在固體基質(zhì)的特定位置上，用于檢測(cè)核酸、蛋白質(zhì)和多糖等生物成分。該技術(shù)具有高效準(zhǔn)確、高通量等優(yōu)點(diǎn)，在生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域表現(xiàn)出巨大的商業(yè)應(yīng)用潛力。目前，應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的生物芯片技術(shù)有DNA微陣列芯片和微流控芯片。

微陣列的原型是為檢測(cè)蠟狀芽孢桿菌［38］和產(chǎn)腸毒素的大腸桿菌［39］而創(chuàng)建。研究者們也將這一技術(shù)應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的檢測(cè)中。González等［40］結(jié)合多重PCR開發(fā)了一種基因特異性DNA微陣列，可同時(shí)檢測(cè)5種海洋魚類病原菌（創(chuàng)傷弧菌、鰻利斯頓氏菌、美人魚發(fā)光桿菌殺魚亞種、殺鮭氣單胞菌和副溶血弧菌）。Panicker等［41］用DNA微陣列技術(shù)偶聯(lián)多重PCR，用于同時(shí)檢測(cè)貝類中的副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌。對(duì)于無(wú)富集的純培養(yǎng)物，該方法的檢測(cè)靈敏度為102～103CFU/mL，特異性為100%。如圖3所示，經(jīng)過(guò)5 h的樣品富集，其檢測(cè)靈敏度可達(dá)每克牡蠣組織勻漿中1 CFU，菌體的富集培養(yǎng)提高了該檢測(cè)技術(shù)的靈敏度。DNA微陣列的優(yōu)勢(shì)是能夠獲取病原體的詳細(xì)基因組信息，包括相關(guān)的種屬鑒定、分類型、毒力因子和抗生素抗性［37］，但也存在可重復(fù)性較差等缺點(diǎn)。

圖3 富集5 h后，DNA微陣列技術(shù)對(duì)牡蠣組織勻漿中副溶血弧菌、創(chuàng)傷弧菌和霍亂弧菌檢測(cè)的靈敏度［41］Fig.3 Sensitivity of detection for V.v ul nifi cus，V.parahae mol yt ic us and V.chole rae in seeded oyster tissue homogenates following 5 h of enrichment［41］

以微流控芯片技術(shù)為基礎(chǔ)的微全分析系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)了生物樣本處理和檢測(cè)的一體化，不僅能將同一實(shí)驗(yàn)的多個(gè)基本步驟集成到單個(gè)微小芯片上經(jīng)一步反應(yīng)完成，也能將多種實(shí)驗(yàn)操作集成在一個(gè)實(shí)驗(yàn)中完成［42］，在致病菌檢測(cè)應(yīng)用中具有集成化程度高、小型化、高效簡(jiǎn)便和節(jié)約試劑等特點(diǎn)。Jin等［43］報(bào)道了一種基于LAMP技術(shù)的微流控芯片，可用于檢測(cè)包括創(chuàng)傷弧菌在內(nèi)的10種水源性致病菌。該方法能夠同時(shí)完成2個(gè)標(biāo)本的22個(gè)遺傳分析，在純化細(xì)菌中的檢測(cè)范圍為每次反應(yīng)7.92×10－3～9.54×10－1pg。如圖4所示，Zhou等［44］建立了一種基于實(shí)時(shí)熒光LAMP技術(shù)的雙樣本微流控芯片，可在30 min內(nèi)同時(shí)檢測(cè)創(chuàng)傷弧菌、副溶血弧菌和腎壞死病毒等多種細(xì)菌和病毒。該方法對(duì)細(xì)菌基因組DNA的檢出限為100～10－1pg/μL；病毒重組質(zhì)粒DNA的檢出限可達(dá)10－4～10－5pg/μL。且與常規(guī)微生物檢測(cè)方法相比，其臨床指標(biāo)的敏感性和特異性分別為93.52%和85.53%，適用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中多種病原體的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)和常規(guī)監(jiān)測(cè)。

圖4 雙面樣品微流控芯片和等溫芯片檢測(cè)系統(tǒng)［44］Fig.4 Duplex sample microfluidic chip and isothermal chip detection system［44］

4.2 生物傳感技術(shù)

生物傳感器由識(shí)別元件、轉(zhuǎn)換器和信號(hào)檢測(cè)分析元件組成，通過(guò)對(duì)電化學(xué)、光學(xué)、溫度和壓電等不同類型信號(hào)的識(shí)別實(shí)現(xiàn)小型化和自動(dòng)化的傳感檢測(cè)。該方法所需靶標(biāo)的量低至nL及以下，可同步完成多種靶標(biāo)分析。此種微量檢測(cè)不僅縮短了分析時(shí)間，還降低了試劑成本。生物傳感器已成為病原體直接檢測(cè)的有用工具，而微納技術(shù)的興起也進(jìn)一步促進(jìn)了生物傳感器的應(yīng)用和發(fā)展［45］。

目前，生傳感器已成功應(yīng)用于創(chuàng)傷弧菌的快速檢測(cè)。如圖5所示，F(xiàn)an等［46］構(gòu)建了一種創(chuàng)傷弧菌體外檢測(cè)的脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器。3'末端修飾羧基熒光素（FAM）且5'末端修飾猝滅劑的DNAzyme可與創(chuàng)傷弧菌胞外粗提物（CEM）反應(yīng)從而被激活，反應(yīng)激活后的DNAzyme切割底物而產(chǎn)生熒光信號(hào)。該DNAzyme傳感體系首先將普魯蘭多糖、海藻糖及DNAzyme混合添加到每個(gè)孔板中，經(jīng)空氣干燥后將待測(cè)樣本加入到測(cè)試區(qū)使其相互反應(yīng)，DNAzyme切割熒光底物產(chǎn)生的熒光信號(hào)經(jīng)藍(lán)光凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)，檢出限為2.2×103CFU/mL，檢測(cè)時(shí)間為5～10 min。另外，創(chuàng)傷弧菌核酸適配體傳感器可以極大地提高臨床檢驗(yàn)和食品安全監(jiān)控部門的工作效率，具有巨大的應(yīng)用潛力。Yan等［47］結(jié)合不對(duì)稱PCR和指數(shù)富集的配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)（SELEX）篩選出針對(duì)創(chuàng)傷弧菌的新型DNA適配體。研究結(jié)果表明，該DNA適配體對(duì)創(chuàng)傷弧菌具有較高的特異性與親和性，Kd為（26.8±5.3）nmol/L，檢測(cè)范圍為8～2.0×108CFU/mL。該研究為創(chuàng)傷弧菌核酸適配體傳感器的進(jìn)一步開發(fā)奠定了基礎(chǔ)。

圖5 脫氧核酶（DNAzyme）熒光傳感器用于創(chuàng)傷弧菌的體外檢測(cè)［46］Fig.5 DNAzyme fluorescence sensor for detection of V.vulnif ic us i n vitr o［46］

5 總結(jié)與展望

近些年，隨著全球氣候變暖，創(chuàng)傷弧菌致病案例頻發(fā)，其檢測(cè)方法也在不斷發(fā)展。目前，常規(guī)的平板培養(yǎng)和生化鑒定方法仍是創(chuàng)傷弧菌檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)方法，但該方法耗時(shí)較長(zhǎng)，無(wú)法滿足高通量快速檢測(cè)需求。相比于傳統(tǒng)的檢測(cè)方法，免疫學(xué)及分子生物學(xué)檢測(cè)法在一定程度上縮短了檢測(cè)時(shí)間，但其所涉及的富集程序有待進(jìn)一步優(yōu)化。因此，開發(fā)更好的細(xì)菌富集方法應(yīng)是未來(lái)研究的重要方向之一。

值得注意的是，由于死細(xì)胞和活細(xì)胞中均存在DNA，PCR技術(shù)難以區(qū)分活細(xì)胞和非活細(xì)胞，通常會(huì)導(dǎo)致假陽(yáng)性。且由于rRNA穩(wěn)定性強(qiáng)，細(xì)胞死亡后其降解速率較慢，以rRNA作為靶標(biāo)檢測(cè)目標(biāo)菌株也會(huì)產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。微流控芯片技術(shù)推動(dòng)了菌體樣本處理和檢測(cè)的一體化發(fā)展，具備高通量?jī)?yōu)勢(shì)，但較高的開發(fā)成本以及復(fù)雜先進(jìn)的操作平臺(tái)使其難以普及，更無(wú)法應(yīng)用于基層實(shí)驗(yàn)室的細(xì)菌檢測(cè)中。而生物傳感器的優(yōu)勢(shì)在于其對(duì)微生物毒素和細(xì)菌的敏感性更高，只需少量樣品，檢測(cè)時(shí)間通常少于30 min，且納米材料的引入降低了該方法的檢出限，拓寬了檢測(cè)范圍，實(shí)驗(yàn)操作更加簡(jiǎn)便，還能實(shí)現(xiàn)現(xiàn)場(chǎng)、無(wú)標(biāo)記的檢測(cè)。但在傳感過(guò)程中納米材料的結(jié)構(gòu)及性能變化仍有待探索。生物傳感器也在朝著小型化、高通量系統(tǒng)和更高的集成度發(fā)展，從而能夠開發(fā)出手持式設(shè)備，以更簡(jiǎn)單的支持系統(tǒng)、更快的響應(yīng)時(shí)間和更低的成本對(duì)樣品進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)分析?？傮w而言，各種檢測(cè)方法都存在優(yōu)缺點(diǎn)，實(shí)際應(yīng)用中應(yīng)綜合考慮選取適當(dāng)?shù)臋z測(cè)技術(shù)，且多技術(shù)交叉聯(lián)合應(yīng)用也已成為當(dāng)下提高病原菌檢測(cè)準(zhǔn)確性的發(fā)展方向。