基于核酸分子光開(kāi)關(guān)的閉管可視化環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增檢測(cè)方法

王 芳，董 菁，李艷妮，徐秦峰

（陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021）

核酸分子的快速檢測(cè)對(duì)疾病診斷、環(huán)境監(jiān)測(cè)以及食品安全等領(lǐng)域具有十分重要的意義。傳統(tǒng)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）［1］具有靈敏、準(zhǔn)確度高等優(yōu)勢(shì)，但是需要復(fù)雜的操作和精密的溫控儀器［2］。環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP）技術(shù)可以在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)特異、高效的核酸擴(kuò)增，其靈敏度和擴(kuò)增產(chǎn)物量比傳統(tǒng)PCR高出一個(gè)數(shù)量級(jí)，適合于現(xiàn)場(chǎng)和檢測(cè)條件較簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行快速核酸檢測(cè)［3－5］。

目前LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)方法主要有凝膠電泳法、濁度法和熒光染料法［6－7］。凝膠電泳法用時(shí)較長(zhǎng)不適合現(xiàn)場(chǎng)分析，并且需要開(kāi)管操作，極易造成氣溶膠污染；濁度法檢測(cè)避免了開(kāi)蓋操作但僅在短時(shí)間內(nèi)穩(wěn)定，且存在主觀誤差和檢出限高的缺點(diǎn)。LAMP可視化熒光染料如鈣黃綠素和SYBR Green I均對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)有一定抑制，且存在Stoke's位移?。?0 nm）等問(wèn)題，影響其對(duì)于核酸檢測(cè)的實(shí)際應(yīng)用。與有機(jī)染料相比，無(wú)機(jī)配合物核酸分子光開(kāi)關(guān)［Ru（bpy）2（dppz）］2+具有Stoke's位移大（150 nm）、性質(zhì)穩(wěn)定、易于合成等優(yōu)點(diǎn)［8－11］，適合用作可視化核酸檢測(cè)染料。最近有研究將［Ru（phen）2dppz］2+用于檢測(cè)紙基芯片上的LAMP擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物［12］，但開(kāi)管檢測(cè)容易造成擴(kuò)增產(chǎn)物氣溶膠的污染［13－15］。

本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的［Ru（bpy）2（dppz）］2+對(duì)LAMP擴(kuò)增的抑制作用較小，因此可以在擴(kuò)增反應(yīng)前加入，用于LAMP的實(shí)時(shí)熒光定量檢測(cè)［8］。雖然實(shí)時(shí)檢測(cè)可以實(shí)現(xiàn)全程閉管，但需要大型儀器，無(wú)法普及使用。為能閉管引入高濃度染料而不影響LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)采用微晶蠟［16－18］將擴(kuò)增體系與［Ru（bpy）2（dppz）］2+檢測(cè)試劑在一個(gè)反應(yīng)管中分隔開(kāi)，使擴(kuò)增與檢測(cè)染料在LAMP反應(yīng)時(shí)互不接觸，待反應(yīng)結(jié)束時(shí)熔化微晶蠟使兩者混合即可在藍(lán)光激發(fā)下產(chǎn)生明顯的紅色熒光信號(hào)（圖1）。該方法既克服了可視化檢測(cè)所需的高濃度染料直接添加至反應(yīng)溶液中對(duì)LAMP造成的強(qiáng)烈抑制，也避免了由于開(kāi)蓋引起的氣溶膠交叉污染問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了一種常見(jiàn)食源性致病菌（金黃色葡萄球菌，S.aur eus）DNA模型分析物的閉管、快速、可視化熒光檢測(cè)。

圖1 閉管可視化LAMP檢測(cè)示意圖Fig.1 Schematic diagram of visualized closed-tube LAMP detection

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

高速冷凍離心機(jī)、移液槍（Eppendorf AG公司）；移液槍槍頭（Axygen Scientific公司）；電熱恒溫水槽（上海精宏試驗(yàn)設(shè)備有限公司）；分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；瓊脂糖水平電泳儀（Bio－Rad Laboratories公司）；電泳圖像分析系統(tǒng)（上海復(fù)日科技有限公司）；B－BOX藍(lán)光透射儀（Smobio Technology公司）；超微量分光光度計(jì)（Thermo Scientific公司）；生物潔凈型標(biāo)準(zhǔn)潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；微孔板（Corning公司）；全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀（Thermo Scientific公司）；紫外－可見(jiàn)－近紅外分光光度計(jì)（美國(guó)安捷倫公司）。

Deoxynucleotide（dNTP）Solution Mix、Bst 2.0 WarmStar?DNA Polymerase、MgSO4Solution（New England Biolabs）；細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒、普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（天根生化科技（北京）有限公司）；瓊脂糖（Thermo Fisher Scientific）；NaCl（Sigma公司）；微晶蠟（滄州東方蜂蠟?zāi)z業(yè)有限公司）；［Ru（bpy）2（dppz）］2+（Jena Bioscience公司）。

金黃色葡萄球菌和單核細(xì)胞增生李斯特菌的4條引物，以及沙門(mén)氏菌的4條引物均購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。引物序列如表1所示。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物序列Table 1 Sequence of primers used in the experiment

1.2 食源性致病菌DNA提取

本實(shí)驗(yàn)采用磁珠法［19］提取增菌培養(yǎng)液中的DNA。食源性致病菌分別為金黃色葡萄球菌（S.aureus）、沙門(mén)氏菌（S.spp）、單核細(xì)胞增生李斯特菌（L.mon）、溶藻弧菌（V.al g）。使用超微量核酸定量?jī)x測(cè)定DNA濃度和純度后分裝放置于－20℃保存，備用。

1.3 閉管可視化LAMP檢測(cè)

1.3.1 閉管LAMP擴(kuò)增與可視化檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)采用10μL LAMP反應(yīng)體系，包括等溫?cái)U(kuò)增緩沖液（1.00μL，200 mmol/L Tris－HCl，100 mmol/L（NH4）2SO4，500 mmol/L KCl，20 mmol/L MgSO4，1%Tween－20，pH 8.8，25℃），dNTP（1.40μL，10 mmol/L），甜菜堿（1.60μL，5 mol/L），MgSO4（0.45μL，100 mmol/L），酶（0.40μL，8 000 U/mL），S.aur－F3（0.50μL，4 mol/L），S.aur－B3（0.50μL，4 mol/L），S.aur－FIP（0.32μL，50 mol/L），S.aur－BIP（0.32μL，50 mol/L）。按上述劑量配制反應(yīng)基液，裝入PCR管中，加入1μLS.aureusDNA；同時(shí)設(shè)置無(wú)模板陰性對(duì)照并用雙蒸水補(bǔ)齊10μL體系。

在200μL PCR管中加入［Ru（bpy）2（dppz）］2+溶液，取適量微晶蠟（熔點(diǎn)78℃左右）加熱至80℃使蠟融化，將檢測(cè)溶劑密封于管底。待微晶蠟?zāi)毯螅谙炆戏郊尤霐U(kuò)增體系并設(shè)置有模板與空白對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增，水浴鍋60℃溫育60 min。在LAMP擴(kuò)增時(shí)微晶蠟呈固態(tài)，染料與擴(kuò)增體系分離，互不干擾。待擴(kuò)增結(jié)束后升高溫度至80℃使微晶蠟融化并使核酸擴(kuò)增酶失活，搖晃離心管使染料與擴(kuò)增產(chǎn)物接觸，在藍(lán)光透射儀下觀察顏色。

1.3.2 凝膠電泳及熒光光譜表征采用2%的瓊脂糖凝膠電泳法對(duì)S.aur eus的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析鑒定。另取待檢測(cè)樣品100μL于微孔板中，使用全波長(zhǎng)掃描式多功能讀數(shù)儀測(cè)定熒光光譜，激發(fā)波長(zhǎng)450 nm，激發(fā)和發(fā)射狹縫12 nm。

1.3.3 LAMP擴(kuò)增與檢測(cè)條件優(yōu)化對(duì)熒光染料［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度（5、10、15、20、25μmol/L）、擴(kuò)增溫度（50、55、60、65、70℃）、擴(kuò)增時(shí)間（20、40、60、80、100 min）以及鎂離子濃度（0、2、4、6、8、10 mmol/L）等實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行了優(yōu)化。10μL LAMP反應(yīng)體系中，擴(kuò)增體系配置同“1.3.1”，在水浴鍋中進(jìn)行擴(kuò)增后于藍(lán)光透射儀下觀察顏色，并通過(guò)智能手機(jī)進(jìn)行拍照。

1.3.4 可視化閉管LAMP方法的靈敏度與特異性將S.aur eus模板DNA以10倍比例梯度稀釋，濃度依次為：2×105、2×104、2×103、2×102、2×101、2拷貝/反應(yīng)。每個(gè)梯度取1μL為模板，按優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)，驗(yàn)證方法靈敏度。

以S.s pp、L.mon、V.alg的基因組DNA分別作為待測(cè)樣品模板，S.aureus的基因組DNA作為模板陽(yáng)性對(duì)照，雙蒸水作為模板陰性對(duì)照（NTC）。按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)觀察顏色變化驗(yàn)證方法特異性。

1.3.5 可視化閉管LAMP方法的通用性及模擬樣品檢測(cè)將目標(biāo)引物更換為S.s pp、L.mon的引物，以S.s pp、L.mon的基因組DNA分別作為待測(cè)樣品模板，其它菌種基因組DNA和沒(méi)有模板的樣品作為對(duì)照。按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)觀察顏色變化驗(yàn)證方法通用性。

以S.aureus人工污染超高溫瞬時(shí)滅菌（UHT）常溫奶作為模擬樣品，磁珠法提取DNA作為擴(kuò)增模板。按照優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后通過(guò)觀察顏色變化驗(yàn)證方法實(shí)用性。

2 結(jié)果與討論

2.1 基于核酸分子“光開(kāi)關(guān)”的LAMP目視檢測(cè)可行性驗(yàn)證

由實(shí)驗(yàn)室前期研究成果可知［8］：［Ru（bpy）2（dppz）］2+在LAMP擴(kuò)增體系中的最大耐受濃度為2μmol/L，超過(guò)該濃度會(huì)抑制LAMP擴(kuò)增反應(yīng)；但［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度較高時(shí)（＞10μmol/L）方能得到較好的可視化比色效果。LAMP擴(kuò)增過(guò)程與可視化比色過(guò)程對(duì)［Ru（bpy）2（dppz）］2+的濃度要求差異較大，無(wú)法同時(shí)滿足。因此不能將［Ru（bpy）2（dppz）］2+在擴(kuò)增前直接加入至擴(kuò)增體系中。而在擴(kuò)增后開(kāi)管加入［Ru（bpy）2（dppz）］2+進(jìn)行比色，容易引起氣溶膠污染造成“假陽(yáng)性”，影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)。因此本實(shí)驗(yàn)采用微晶蠟構(gòu)建LAMP擴(kuò)增與檢測(cè)的閉管模式。該方法原理如圖1所示，利用微晶蠟將位于反應(yīng)管底部的［Ru（bpy）2（dppz）］2+檢測(cè)溶液體系與LAMP擴(kuò)增溶液體系分隔開(kāi)來(lái)。由于LAMP擴(kuò)增反應(yīng)溫度（60℃）低于微晶蠟熔點(diǎn)溫度（78℃），因此在整個(gè)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)過(guò)程中微晶蠟呈固態(tài)，擴(kuò)增體系與染料分別處于微晶蠟的上下層，高濃度的染料不會(huì)對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)造成干擾。待擴(kuò)增結(jié)束后升溫至80℃使微晶蠟融化，染料與擴(kuò)增產(chǎn)物DNA相互混合，即可在閉管狀態(tài)通過(guò)藍(lán)光透射儀檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)是否發(fā)生。陽(yáng)性發(fā)射紅色熒光，陰性則無(wú)熒光發(fā)射。該方法解決了染料抑制擴(kuò)增和開(kāi)管氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)的問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)的閉管可視化檢測(cè)。

如圖2A所示，直接添加［Ru（bpy）2（dppz）］2+試劑未用蠟分隔時(shí)，陽(yáng)性與陰性無(wú)明顯區(qū)分；而用蠟將染料與擴(kuò)增體系分隔開(kāi)時(shí)，產(chǎn)生明顯的顏色變化，紅色陽(yáng)性樣品與無(wú)色陰性樣品顏色對(duì)比明顯。對(duì)兩組樣品進(jìn)行熒光光譜掃描，結(jié)果與目視比色結(jié)果一致（圖2B）：用蠟分隔的陽(yáng)性與陰性樣品在［Ru（bpy）2（dppz）］2+最大發(fā)射波長(zhǎng)處的熒光強(qiáng)度具有很大差異；而未用蠟隔開(kāi)的樣品，陽(yáng)性與陰性樣品的熒光強(qiáng)度均很弱且無(wú)明顯區(qū)分。凝膠電泳表征結(jié)果（圖2C）顯示，直接加［Ru（bpy）2（dppz）］2+未用蠟分隔開(kāi)時(shí)，高濃度的染料抑制了LAMP擴(kuò)增反應(yīng)，在凝膠電泳圖中無(wú)LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特征條帶出現(xiàn)；當(dāng)用蠟將染料與擴(kuò)增體系分隔開(kāi)時(shí)，在凝膠電泳圖中有LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特征條帶出現(xiàn)，LAMP擴(kuò)增反應(yīng)正常，與可視化比色結(jié)果、熒光光譜圖一致。綜上所述，采用微晶蠟分隔擴(kuò)增體系與檢測(cè)染料可以實(shí)現(xiàn)可視化LAMP檢測(cè)，且全程閉管避免污染。

圖2 LAMP檢測(cè)的目視比色圖（A）、熒光光譜圖（B）與瓊脂糖凝膠電泳圖（C）Fig.2 Visual image（A），fluorescence spectrogram（B）and agarose gel electropherogram（C）of LAMP detection

2.2 實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化

為了達(dá)到最佳的可視化檢測(cè)效果，分別對(duì)擴(kuò)增條件和檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化。［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3A所示。只有當(dāng)染料濃度大于10μmol/L時(shí)方可達(dá)到較明顯的紅色陽(yáng)性、無(wú)色陰性的顏色對(duì)比。綜合考慮檢測(cè)效果的穩(wěn)定性和實(shí)驗(yàn)成本，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇15μmol/L作為［Ru（bpy）2（dppz）］2+染料濃度。Mg2+濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3B所示，鎂離子濃度為8 mmol/L時(shí)，顯色反應(yīng)最為明顯，當(dāng)鎂離子濃度小于8 mmol/L時(shí)，擴(kuò)增效果不好，不能達(dá)到較好的顯色。因此確定擴(kuò)增最佳鎂離子濃度為8 mmol/L。

對(duì)LAMP擴(kuò)增反應(yīng)時(shí)間和溫度進(jìn)行了優(yōu)化。結(jié)果如圖3C、D所示：反應(yīng)時(shí)間大于60 min，陽(yáng)性樣品均有明顯的顏色變化；反應(yīng)溫度為60℃時(shí)，陽(yáng)性陰性顏色對(duì)比最為明顯。綜合考慮時(shí)間和最佳檢測(cè)效果，選擇60℃溫度下反應(yīng)60 min進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖3 ［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度（A）、Mg2+濃度（B）、反應(yīng)時(shí)間（C）及反應(yīng)溫度（D）的優(yōu)化Fig.3 Optimization of［Ru（bpy）2（dppz）］2+concentration（A），Mg2+concentration（B），reaction time（C）and reaction temperature（D）

2.3 閉管可視化LAMP檢測(cè)的靈敏度及特異性

為確定方法能夠檢測(cè)到的最低模板DNA的含量，以10倍比例梯度稀釋S.aur eus模板DNA進(jìn)行熒光目視比色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖4A所示：可視化檢測(cè)可達(dá)到20拷貝/反應(yīng)的檢出限，且可視化檢測(cè)結(jié)果與凝膠電泳驗(yàn)證結(jié)果（圖4B）相一致。表明基于［Ru（bpy）2（dppz）］2+的可視化檢測(cè)方法具有較高的檢測(cè)靈敏度。

方法的特異性檢測(cè)結(jié)果如圖4C所示：只有加入目標(biāo)菌種S.aur eus模板DNA時(shí)有明顯的紅色，無(wú)模板或者加入其它非目標(biāo)致病菌模板時(shí)均無(wú)明顯顏色變化。凝膠電泳結(jié)果（圖4D）顯示，只有S.aureus樣品有LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物特征梯狀條帶產(chǎn)生；其它非目標(biāo)菌樣品以及陰性對(duì)照無(wú)擴(kuò)增條帶產(chǎn)生?？梢暬瘷z測(cè)結(jié)果與凝膠電泳結(jié)果一致，表明所建立的方法特異性強(qiáng)。

圖4 LAMP熒光目視比色法的靈敏度目視圖（A）和凝膠電泳圖（B），以及特異性目視圖（C）和凝膠電泳圖（D）Fig.4 Fluorescent（A），gel electrophoresis（B）images for sensitivity detection，and fluorescent（C），gel electrophoresis（D）images for specificity detection of visualized closed-tube LAMP detection

2.4 閉管可視化LAMP的通用性及模擬樣品檢測(cè)

為驗(yàn)證該方法的通用性，分別采用L.mon和S.sp p特異性引物進(jìn)行熒光目視比色實(shí)驗(yàn)。結(jié)果如圖5A所示：只有加入目標(biāo)菌種模板DNA時(shí)有明顯的紅色，無(wú)模板或加入其它非目標(biāo)致病菌模板時(shí)均無(wú)明顯顏色變化，表明該方法具有較好的通用性。

為驗(yàn)證所建立方法的實(shí)用性，對(duì)人工S.aur eus污染的UHT常溫牛奶樣品進(jìn)行熒光目視比色檢測(cè)。在無(wú)菌環(huán)境及操作下，設(shè)置S.aureus陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組、UHT常溫奶中加入S.aureus實(shí)驗(yàn)組、UHT常溫奶實(shí)驗(yàn)組模擬樣品進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置相應(yīng)的無(wú)模板陰性對(duì)照。結(jié)果如圖5B所示，向UHT常溫奶中加入S.aureus實(shí)驗(yàn)組有明顯的紅色，與S.aur eus陽(yáng)性實(shí)驗(yàn)組現(xiàn)象相一致，但UHT常溫奶實(shí)驗(yàn)組并無(wú)明顯顏色變化（圖5B上排）；并且3組無(wú)模板陰性對(duì)照均無(wú)明顯的顏色變化（圖5B下排）。因此，該方法在樣品檢測(cè)中具有一定的實(shí)用性且檢測(cè)結(jié)果可靠。

圖5 LAMP熒光目視比色法通用性目視圖（A）和模擬樣品檢測(cè)熒光光譜圖（B）Fig.5 Fluorescent images for universality detection of visualized closed-tube LAMP detection（A）and fluorescent images for milk sample detection（B）

3 結(jié) 論

本文將LAMP恒溫?cái)U(kuò)增與［Ru（bpy）2（dppz）］2+相結(jié)合，建立了基于［Ru（bpy）2（dppz）］2+的閉管可視化LAMP檢測(cè)方法。該方法采用微晶蠟分隔構(gòu)建閉管檢測(cè)模式，避免了LAMP大量產(chǎn)物可能造成的氣溶膠污染風(fēng)險(xiǎn)問(wèn)題。通過(guò)優(yōu)化［Ru（bpy）2（dppz）］2+濃度、Mg2+濃度、反應(yīng)時(shí)間與反應(yīng)溫度等實(shí)驗(yàn)條件，實(shí)現(xiàn)了高特異性和高靈敏度的可視化檢測(cè)。該檢測(cè)能夠在1 h內(nèi)完成，檢出限低至20拷貝/反應(yīng)。該方法具有可視化檢測(cè)對(duì)比效果明顯、特異性好、靈敏度高、通用性強(qiáng)以及簡(jiǎn)單快速等優(yōu)勢(shì)，可應(yīng)用于環(huán)境檢測(cè)、食品安全、臨床診斷等領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)快速核酸檢測(cè)。