阿爾茲海默癥生物標(biāo)志物和早期診斷新技術(shù)

李 瑩，錢美齊，邱 雪，2*

（1.中國(guó)海洋大學(xué) 海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，醫(yī)藥學(xué)院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室海洋藥物與生物制品功能實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266237）

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種漸進(jìn)性癡呆癥，目前影響全球超過5 000萬人，預(yù)計(jì)到2050年將影響1.5億人［1］。由于AD的致病機(jī)理尚未被完全闡明，針對(duì)AD的上市藥物主要為癥狀緩解類，疾病修正類藥物極少，因此目前人類尚無治愈AD的方法，其中一個(gè)很重要的原因在于我們尚未檢測(cè)到疾病時(shí)，它已發(fā)生不可逆進(jìn)展，并產(chǎn)生明顯的記憶喪失和神經(jīng)功能下降。疾病早期診斷的生物標(biāo)志物對(duì)通過早期干預(yù)策略延緩疾病或改變疾病進(jìn)程甚至預(yù)防疾病都至關(guān)重要［2－5］。本文將總結(jié)經(jīng)典的和近年來新發(fā)現(xiàn)的AD生物標(biāo)志物，并調(diào)研針對(duì)這些生物標(biāo)志物發(fā)展的新的檢測(cè)技術(shù)。

1 AD核心標(biāo)志物

1.1 β-淀粉樣蛋白

β-淀粉樣蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）是由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶介導(dǎo)裂解產(chǎn)生的肽，有37～43個(gè)氨基酸殘基，是一個(gè)非常古老的、保守的分子序列［6－8］。Aβ是一種無序的蛋白，缺乏穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，其分子的生命周期為從單體到低聚形式到原纖維［9］。

Aβ的生理效應(yīng)表現(xiàn)為濃度依賴性，即生理濃度下有助于記憶鞏固；但病理濃度時(shí)會(huì)抑制記憶功能［9］。Aβ單體通過激活煙堿乙酰膽堿受體來調(diào)節(jié)突觸功能，因此Aβ單體穩(wěn)態(tài)對(duì)正常的突觸功能至關(guān)重要。超過一個(gè)臨界濃度（納摩爾范圍）時(shí)，單體開始聚集成不同的Aβ聚集體［10］。普遍認(rèn)為Aβ的合成與清除之間的不平衡導(dǎo)致Aβ的積累，引發(fā)了AD。從AD患者的腦脊液中共鑒定出26種Aβ蛋白形態(tài)，其中分別含有40和42個(gè)氨基酸殘基的Aβ1－40和Aβ1－42是累積的Aβ的主要成分。Aβ1－42具有更大的疏水性從而更易聚集［11］，被認(rèn)為是腦內(nèi)老年斑起始的罪魁禍?zhǔn)住β1－42水平或比例的增加會(huì)誘導(dǎo)Aβ淀粉樣纖維形成，積累的Aβ淀粉樣纖維發(fā)展為腦內(nèi)老年斑，并導(dǎo)致神經(jīng)毒性［12］。Aβ聚集物能夠激活半胱氨酸蛋白酶，該酶能夠切割tau蛋白，使正常的tau蛋白構(gòu)象發(fā)生變化，導(dǎo)致tau蛋白不能與微管結(jié)合而聚集，誘導(dǎo)tau蛋白病理的產(chǎn)生而引發(fā)AD［13］。

目前測(cè)定大腦中Aβ的常用方法是腦脊液分析和正電子發(fā)射斷層掃描技術(shù)（Positron emission computed tomography，PET），但這兩種技術(shù)的侵入性和昂貴的費(fèi)用限制了其應(yīng)用。因此，通過外周體液研究Aβ受到廣泛關(guān)注［14］。Aβ單體可以通過多種方式從大腦清除到血液，例如血腦屏障清除系統(tǒng)和腦脊液吸收清除循環(huán)系統(tǒng)等［14－15］。但是由于血漿中Aβ1－42的濃度較低，不同的檢測(cè)技術(shù)之間的靈敏度不同導(dǎo)致結(jié)果之間存在較大的差異［16］。

1.2 tau蛋白

tau蛋白是大腦中最常見的微管蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)，在遠(yuǎn)端軸突中以六種亞型存在于人類腦中，是軸突細(xì)胞骨架的重要結(jié)構(gòu)元件［17－18］。tau蛋白的翻譯后修飾包括磷酸化、硝化、乙?；⒎核鼗?、甲基化等，這些翻譯后修飾與AD的發(fā)病機(jī)制相關(guān)［19］。tau蛋白包含多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，目前已通過質(zhì)譜鑒定出超過47個(gè)磷酸化位點(diǎn)，主要位于其C端和脯氨酸結(jié)構(gòu)域［19－20］。細(xì)胞內(nèi)磷酸化tau蛋白（Phosphorylated tau，p-tau）形成的聚集體將導(dǎo)致微管功能、軸突運(yùn)輸功能損傷和神經(jīng)細(xì)胞骨架破壞以及神經(jīng)元病變［21］。激酶和磷酸化酶可分別誘導(dǎo)tau蛋白磷酸化和去磷酸化，tau蛋白磷酸化受多種蛋白激酶和磷酸化酶的調(diào)控［20］。磷酸化和蛋白質(zhì)去磷酸化之間的失衡將導(dǎo)致該蛋白與微管的結(jié)合受損，以及神經(jīng)原纖維纏結(jié)的形成。p-tau蛋白的結(jié)構(gòu)還可能受到Aβ、氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥等的影響［22］。

腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）中總tau蛋白（Total-tau，t-tau）和p-tau蛋白升高是AD的明確標(biāo)志［23］?？扇苄詐-tau181和t-tau的濃度在顯性遺傳性AD和散發(fā)性AD的癥狀出現(xiàn)前就開始增加［24］。腦脊液中的t-tau蛋白、p-tau蛋白和Aβ1－42可以預(yù)測(cè)輕度認(rèn)知障礙（Mild cognitive impairment，MCI）和早期AD，具有較高的敏感性和特異性［25］。與腦源性血清外泌體相關(guān)的t-tau蛋白和p-tau蛋白可以更準(zhǔn)確地區(qū)分輕度AD和MCI［26］。此外還發(fā)現(xiàn)，這些血清外泌體相關(guān)蛋白的水平升高可以預(yù)測(cè)長(zhǎng)期的認(rèn)知能力下降［21］。

2 AD新型生物標(biāo)志物

2.1 載脂蛋白E基因

載脂蛋白（Apolipoprotein，Apo）是血漿脂蛋白中的蛋白質(zhì)成分，主要有A、B、C、D、E五大類，能夠結(jié)合和運(yùn)輸脂質(zhì)到機(jī)體各組織進(jìn)行代謝及利用，在神經(jīng)元的生長(zhǎng)、修復(fù)、重組和保護(hù)中也具有重要作用。研究表明，與AD關(guān)系最為緊密的是載脂蛋白E（ApoE），ApoE 112位和158位兩個(gè)氨基酸的不同使之可形成3種ApoE亞型：ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4，分別由3個(gè)常見的等位基因（ε2、ε3、ε4）編碼。其中，ApoEε4可顯著增加患AD的風(fēng)險(xiǎn)，這使得攜帶ApoEε4等位基因的AD患者發(fā)病年齡更早，并且傾向于有更明顯的神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊聚集［27］，然而ApoEε4對(duì)AD風(fēng)險(xiǎn)的潛在機(jī)制尚不明確；ApoEε3等位基因是最常見的基因變體，可能會(huì)導(dǎo)致長(zhǎng)期炎癥反應(yīng)；ApoEε2等位基因與降低AD的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，可以減少神經(jīng)纖維纏結(jié)和淀粉樣斑塊的積累?？偟膩碚f，ApoE對(duì)AD患者大腦有調(diào)節(jié)作用［28］。進(jìn)一步的研究結(jié)果表明，大腦中的TOMM40－APOE基因座在調(diào)控ApoE水平和AD神經(jīng)病理學(xué)方面具有復(fù)雜的作用［29］。研究者通過分析腦脊液的ApoE水平與ApoE的基因變異和臨床特征，發(fā)現(xiàn)腦脊液ApoE水平具有性別特異性，表明腦脊液ApoE可能以性別特異性的方式參與AD病理的發(fā)病機(jī)制［30－31］。在ApoEε2對(duì)AD的預(yù)防作用方面，有研究表明ApoEε2已被確定為長(zhǎng)壽基因，其對(duì)衰老過程具有系統(tǒng)性影響，然而ApoEε2并非完全有益，其攜帶者患某些腦血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加［32］。

2.2 β-分泌酶1

β-分泌酶1（Beta-site app cleaving enzyme 1，BACE1），即β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1，是在外周神經(jīng)細(xì)胞中形成髓鞘的一種重要的天冬氨酸蛋白酶，亦是促進(jìn)Aβ形成的關(guān)鍵酶，是一個(gè)包含兩個(gè)活性位點(diǎn)的跨膜蛋白，可在細(xì)胞外形成二聚體。在AD患者腦脊液中，BACE1蛋白濃度和活性均升高，并且其升高程度與海馬體體積縮小相關(guān)。此外，在MCI向AD轉(zhuǎn)化的患者腦脊液中也發(fā)現(xiàn)BACE1的活性升高，已經(jīng)達(dá)到AD患者中BACE1活性的同等水平。研究人員發(fā)現(xiàn)，MCI時(shí)期患者的組織中BACE1的活性與對(duì)照組相比顯著增加27%，但優(yōu)于AD現(xiàn)有的臨床診斷指標(biāo)，可能是AD神經(jīng)功能障礙或病變的早期指標(biāo)，也可能作為治療AD的靶標(biāo)［33］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在最終轉(zhuǎn)化為AD的MCI患者血液中BACE1酶的活性更高，而未轉(zhuǎn)化為AD的MCI患者血液中的BACE1活性相對(duì)較低，表明檢測(cè)血液中BACE1的活性可在MCI階段預(yù)測(cè)AD的發(fā)生及發(fā)展［34］。

2.3 早老素

早老素（Presenilin，PSEN）有兩個(gè)亞型，即PSEN1和PSEN2，是兩個(gè)同源的多跨膜蛋白，有約67%的同源序列，其同源序列為γ-分泌酶的催化核心。Braggin等［35］報(bào)告了早發(fā)性AD病例中一種罕見的PSEN2移碼變體（PSEN2 p.K115Efs*11），其γ分泌酶活性異常，表明PSEN2 K115Efs*11可能是與AD相關(guān)的致病性變體，提示了PSEN變異可能是AD發(fā)病的潛在機(jī)制。PSEN1和PSEN2基因突變是家族性早發(fā)型AD最常見的原因，特別是PSEN1基因。這兩個(gè)基因的突變通常會(huì)引起γ-分泌酶活性的破壞，可促使APP形成有致病性的Aβ，進(jìn)而導(dǎo)致Aβ1－42過度產(chǎn)生或Aβ1－40產(chǎn)生不足，或者兩種情況同時(shí)存在，最終導(dǎo)致Aβ1－42和Aβ1－40之間的比值增加［36］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中的神經(jīng)元信號(hào)，特別是鈣離子（Ca2+）信號(hào)受PSEN調(diào)節(jié)，并受其基因突變的影響，而細(xì)胞內(nèi)的Ca2+信號(hào)不僅控制神經(jīng)元的活動(dòng)，還影響基因的表達(dá)模式、細(xì)胞骨架的結(jié)構(gòu)功能、突觸的信號(hào)傳導(dǎo)；此外PSEN對(duì)AD的細(xì)胞氧化應(yīng)激和細(xì)胞活力也有一定的調(diào)節(jié)作用［37－38］。

2.4 小膠質(zhì)細(xì)胞受體（CD33）

CD33是一種介導(dǎo)細(xì)胞－細(xì)胞相互作用的細(xì)胞表面受體，為唾液酸結(jié)合受體跨膜蛋白家族中的一種，是細(xì)胞生長(zhǎng)和存活的重要受體，也是網(wǎng)格蛋白非依賴性內(nèi)吞途徑以及先天性和適應(yīng)性免疫系統(tǒng)功能的關(guān)鍵受體［39］，其基因多態(tài)性與晚發(fā)型AD有關(guān)［40］，有證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞中CD33的表達(dá)情況和淀粉樣斑塊負(fù)荷與認(rèn)知功能相關(guān)［41］。另有研究顯示，CD33的多態(tài)性可通過使腦組織中海馬回和海馬旁回的神經(jīng)元變性而增加AD發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)［42］。然而CD33唾液酸結(jié)合域的表達(dá)下調(diào)可降低AD發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)，因此抑制CD33是一種有效的抑制AD病情發(fā)展的途徑，CD33上的唾液酸結(jié)合位點(diǎn)是一個(gè)有前景的藥效團(tuán)［40］。

2.5 神經(jīng)絲輕鏈蛋白

神經(jīng)絲輕鏈蛋白（Neurofilament light chain，NfL）是細(xì)胞骨架蛋白的一種，其主要功能是維持軸突功能和穩(wěn)定的神經(jīng)傳導(dǎo)，是軸突損傷的非特異性標(biāo)志物。正常生理?xiàng)l件下軸突釋放少量的Nf L，但在病理?xiàng)l件下NfL的釋放量顯著增加，腦脊液和血液中的NfL濃度與神經(jīng)病變程度密切相關(guān)。臨床研究表明具有患AD風(fēng)險(xiǎn)的人群在發(fā)病之前有比正常情況下更高的NfL水平，而且血液和腦脊液中的NfL水平早在這些患者開始出現(xiàn)神經(jīng)病變癥狀之前（疾病發(fā)作前16年）就開始上升［43］。研究結(jié)果顯示在有遺傳風(fēng)險(xiǎn)的非癡呆個(gè)體中，血漿NfL水平、認(rèn)知能力和tau病理學(xué)三者之間存在關(guān)聯(lián)，這些個(gè)體可能會(huì)發(fā)展為AD［44］。然而NfL水平在許多神經(jīng)退行性疾病中均會(huì)升高，并不具有疾病特異性，因此是否可將其作為AD診斷的標(biāo)志物尚待考究，但其在判斷疾病分期、預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展和疾病預(yù)后中仍有一定的價(jià)值［44］。

2.6 補(bǔ)體系統(tǒng)與激肽系統(tǒng)

AD與突觸缺失密切相關(guān)，而補(bǔ)體系統(tǒng)已被證明參與突觸的清除。一些研究指出AD與補(bǔ)體系統(tǒng)之間存在關(guān)聯(lián)。與未發(fā)展為AD的MCI相比，AD患者腦脊液中補(bǔ)體C3和補(bǔ)體C4的水平升高，這些結(jié)果表明異常的補(bǔ)體水平可影響AD的發(fā)展過程，故可將其作為AD診斷的生物標(biāo)志物［45］。此外Aβ蛋白可激活血漿的激肽系統(tǒng)，導(dǎo)致激肽釋放酶介導(dǎo)的完整的高分子量激肽原（HKi）被切割成裂解的高分子量激肽原（HKc），可通過Western blot觀察到AD患者血漿的HKi分裂增加，HKc濃度升高［46］。

2.7 microRNA

microRNA（miRNA）是一類內(nèi)源基因編碼的長(zhǎng)度約為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA，參與轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控。異常的miRNA水平通過調(diào)控AD相關(guān)病理蛋白影響AD的疾病發(fā)展過程，不同類別的miRNA水平上調(diào)或下調(diào)均會(huì)影響AD的發(fā)展過程，進(jìn)而可影響AD患者體內(nèi)Aβ或tau蛋白的水平。miRNA主要通過調(diào)控APP的表達(dá)、剪切以及相應(yīng)酶的活性改變Aβ水平。相關(guān)研究顯示，與對(duì)照組相比，MCI和AD組的miR－193b、miR－101、miR－124的水平降低，與Aβ水平呈負(fù)相關(guān)，這些miRNA的表達(dá)水平降低可使APP表達(dá)增加或者促進(jìn)APP外顯子剪切，進(jìn)而影響患者體內(nèi)Aβ的水平［47－49］；此外，影響B(tài)ACE1活性和表達(dá)量的miRNA表達(dá)水平改變也會(huì)影響Aβ的合成，miR－29c、mi R－195、miR－124基因表達(dá)的下調(diào)可通過調(diào)節(jié)BACE1蛋白水平、促進(jìn)Aβ合成及細(xì)胞損傷等途徑促進(jìn)Aβ斑塊的形成［50－52］。已有研究表明miRNA也會(huì)通過影響tau蛋白的合成進(jìn)而影響AD的發(fā)生、發(fā)展，其中，miR－219表達(dá)水平下調(diào)可抑制tau的合成，miR－132/212水平下調(diào)將增加tau的表達(dá)和磷酸化，miR－34a水平上調(diào)會(huì)促進(jìn)內(nèi)源性tau表達(dá)，miR－128水平上調(diào)則促進(jìn)tau的降解和聚集，miR－125b表達(dá)水平上調(diào)可促進(jìn)tau的磷酸化［53－56］。除此之外，外周血中多種miRNAs水平顯著變化也可作為AD的診斷指標(biāo)，但其診斷價(jià)值未被大規(guī)模臨床研究證實(shí)。

2.8 金屬離子

2.8.1 鐵離子鐵是大腦中含量最豐富的過渡金屬，參與神經(jīng)遞質(zhì)合成（如血清素、去甲腎上腺素和多巴胺）、髓鞘生成、神經(jīng)元發(fā)育等生理過程。然而，鐵在AD患者大腦中的積累和在皮質(zhì)中的異常分布被認(rèn)為是AD的致病因素，研究者已經(jīng)確認(rèn)鐵蓄積的程度與腦組織中Aβ斑塊的數(shù)量、tau病理學(xué)以及AD疾病分期相關(guān)［57－58］。鐵的異常分布導(dǎo)致的鐵穩(wěn)態(tài)失調(diào)是AD的一個(gè)特征，鐵可以通過促氧化劑分子（例如羥基自由基等）與AD病理學(xué)蛋白（淀粉樣前體蛋白和tau蛋白）相互作用，進(jìn)一步促進(jìn)蛋白聚集；鐵還可以與AD中的tau蛋白結(jié)合，通過與神經(jīng)原纖維纏結(jié)的相互作用增強(qiáng)tau蛋白的毒性，并誘導(dǎo)這些纏結(jié)的積累，這些病理變化與AD的發(fā)展和認(rèn)知能力下降有關(guān)［59－60］。

2.8.2 銅離子銅既是氧化劑又是抗氧化劑，在機(jī)體內(nèi)主要起催化作用。許多含銅金屬酶作為氧化酶，參與體內(nèi)氧化還原過程，已被證實(shí)在人體中有重要的生理功能。銅離子對(duì)AD的發(fā)生發(fā)展具有一定的作用，在AD患者腦組織中，銅離子的穩(wěn)態(tài)失調(diào)對(duì)Aβ和tau蛋白的生理活性有一定的影響；此外，AD患者腦內(nèi)銅離子水平和定位會(huì)發(fā)生較大變化，淀粉樣沉積物中有銅離子的積累，而一些腦組織區(qū)域的銅離子水平則不足。APP和Aβ均具有銅離子結(jié)合位點(diǎn)，可通過與銅離子發(fā)生相互作用產(chǎn)生活性氧導(dǎo)致神經(jīng)毒性；此外，AD患者的銅代謝會(huì)發(fā)生系統(tǒng)性變化，腦內(nèi)銅離子水平的改變也可能影響AD的神經(jīng)炎癥過程［61］。

2.8.3 鋅離子鋅是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）中第二豐富的微量元素，老年人和AD患者存在鋅穩(wěn)態(tài)受損的情況［62］。越來越多的證據(jù)表明，鋅離子可以導(dǎo)致大腦中的Aβ沉積和老年斑形成，因此大腦中的鋅離子水平亦可作為AD的病理特征指標(biāo)［63］。

3 檢測(cè)方法

3.1 臨床診斷方法

現(xiàn)階段對(duì)于AD的臨床診斷大多基于四個(gè)方面，分別為基于量表的認(rèn)知功能評(píng)估、PET、腦脊液診斷以及危險(xiǎn)基因ApoE檢測(cè)。老年癡呆診斷測(cè)試量表常用Mini－Mental State Examination，即MMSE，可評(píng)估記憶和其他認(rèn)知功能，是目前最具影響的認(rèn)知缺損篩選工具之一。MMSE置信度良好，總分與患者CT的腦萎縮呈正相關(guān)；PET顯像屬于分子顯像和功能顯像范疇，可通過向病人體內(nèi)注射成像劑（如18F－FDG、18F－FDDNP、11C－PBBB3、11C－PIB3等），直觀地顯示患者的神經(jīng)元突觸功能、Aβ沉積、tau蛋白磷酸化程度、多種神經(jīng)遞質(zhì)和受體變化情況等；腦脊液診斷是一種有創(chuàng)性檢查，通過腰椎穿刺，從脊椎骨間隙抽取一定量的腦脊液進(jìn)行檢測(cè)，AD患者腦脊液中的Aβ42水平明顯低于正常人，小于550 pg/mL，而tau蛋白水平明顯高于正常人，一般大于375 pg/mL，結(jié)合檢測(cè)腦脊液的Aβ42和tau水平可診斷無癥狀A(yù)D，準(zhǔn)確率可達(dá)90%左右［64］；ApoE危險(xiǎn)基因檢測(cè)是通過檢測(cè)患者體內(nèi)ApoE基因的表達(dá)情況預(yù)測(cè)和推斷病人患AD的風(fēng)險(xiǎn)，ApoE基因檢測(cè)結(jié)果分為一般風(fēng)險(xiǎn)型、較低風(fēng)險(xiǎn)型和較高風(fēng)險(xiǎn)型3類，可反映受試者患AD的風(fēng)險(xiǎn)情況。

3.2 臨床診斷試劑盒

現(xiàn)有的臨床診斷試劑盒大多以Aβ42和tau蛋白作為診斷標(biāo)志物，少有基于其他新型生物標(biāo)志物開發(fā)的診斷試劑盒，國(guó)內(nèi)外臨床診斷公司均有生產(chǎn)和開發(fā)AD檢測(cè)試劑盒。

國(guó)內(nèi)的診斷公司主要包括先聲診斷、豪思生物、貝格爾生物等多家生物公司。先聲診斷提供兩款A(yù)D診斷試劑盒，其一為運(yùn)用ELISA方法進(jìn)行腦脊液中4種生物標(biāo)志物（Aβ1－42、Aβ42/Aβ40、t－tau、p－tau181）的檢測(cè)，其二為利用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，通過受試者外周血基因型分析進(jìn)行ApoE基因高風(fēng)險(xiǎn)人群鑒別。而豪思生物正在研發(fā)的AD診斷試劑盒是采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）技術(shù)檢測(cè)受試者血漿中的8種AD相關(guān)生物標(biāo)志物，該試劑盒希望通過外周血測(cè)試幫助臨床醫(yī)生進(jìn)行AD的早期診斷、疾病分期，監(jiān)測(cè)癡呆疾病進(jìn)程和評(píng)價(jià)治療效果。貝格爾生物公司正在與海外科研團(tuán)隊(duì)合作研究基于血清外泌體的AD診斷技術(shù)，與PET－Aβ等臨床診斷“金標(biāo)準(zhǔn)”結(jié)果相比，AD相關(guān)血清外泌體生物標(biāo)志物顯示出較好的靈敏度與特異性［65］。該公司正在進(jìn)行大規(guī)模臨床樣品測(cè)試?？梢钥闯?，國(guó)內(nèi)的生物公司對(duì)于AD檢測(cè)試劑盒的研發(fā)尚處于起步階段，簡(jiǎn)便、高效、準(zhǔn)確的檢測(cè)試劑盒有待開發(fā)。

海外生物公司生產(chǎn)的AD診斷試劑盒也主要基于傳統(tǒng)的生物標(biāo)志物，其中拜爾公司開發(fā)的試劑盒通過檢測(cè)腦脊液中的Aβ1－42、t－tau和p－tau水平進(jìn)行AD診斷；德國(guó)歐蒙公司以及Fujirebio公司的檢測(cè)項(xiàng)目為腦脊液中的Aβ1－40/Aβ1－42、p－tau181、t－tau等；Quanterix公司的試劑盒可通過患者腦脊液或血液樣本測(cè)定AβAβ1－40/Aβ1－42、p－tau181、t－tau的含量，進(jìn)而進(jìn)行AD的臨床診斷；而Seebio公司可檢測(cè)組織上清液、組織勻漿、腦脊液、血漿等樣品，但其測(cè)量只限于科研用途，不用做臨床診斷，其檢測(cè)的生物標(biāo)志物主要為Aβ1－42。

3.3 新型檢測(cè)技術(shù)研究進(jìn)展

3.3.1 基于免疫反應(yīng)的AD早期診斷Chen等［66］通過單分子陣列（Single-molecule array，Simoa）免疫法檢測(cè)血清、血漿和CSF中的p－tau181，其靈敏度比ELISA高出1 000倍以上。該技術(shù)直接將蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)帶入到單分子、數(shù)字化檢測(cè)時(shí)代，能夠進(jìn)行超低豐度蛋白質(zhì)的檢測(cè)［43］。通過單克隆抗體捕獲p－tau181，再加入生物素標(biāo)記的tau蛋白抗體進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中的p－tau181水平是對(duì)照組的2倍，腦脊液中的p－tau181水平是對(duì)照組的10倍。

Budde等［67］開發(fā)了一種可重復(fù)使用的表面免疫紅外傳感器，用于檢測(cè)人腦脊液中的Aβ和tau蛋白。該傳感器的關(guān)鍵元件是表面具有化學(xué)修飾的衰減全反射（Attenuated total reflectance，ATR）晶體，可將生物標(biāo)志物從體液中捕獲出來。傳感器表面用免疫球蛋白結(jié)合蛋白A或蛋白G共價(jià)包被，蛋白A和蛋白G能夠與IgG抗體Fc恒定區(qū)發(fā)生高親和力相互作用，該相互作用與常規(guī)N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）偶聯(lián)相比具有更強(qiáng)的特異性，并且可通過化學(xué)處理（例如pH值變化）逆轉(zhuǎn)。蛋白A和蛋白G可用于抗體的非共價(jià)結(jié)合和抗原的分析，因此這種免疫平臺(tái)可以與蛋白A和G的所有抗體聯(lián)合使用。這種檢測(cè)方法為快速分析AD患者血液和CFS樣本提供了一個(gè)可逆平臺(tái)。

Kim等［68］將一種具有Tau－381亞型特異性的DNA適配體和抗體應(yīng)用于表面等離子體共振平臺(tái)上（Surface plasmon resonance platform，SPR）進(jìn)行人血漿中Tau－381亞型的濃度分析，檢測(cè)限為10 fmol/L。通過與商品化的ELISA試劑盒進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，該檢測(cè)方法的性能增強(qiáng)了1 000倍，同時(shí)還能夠測(cè)量ELISA無法測(cè)量到的2 pmol/L的濃度。

3.3.2 基于熒光的AD早期診斷Zhang等［69］首次以丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，BChE）和活性氧（Reactive oxygen species，ROSs）為雙靶點(diǎn)，亞甲藍(lán)作為熒光指示劑進(jìn)行AD的早期診斷。環(huán)丙基甲酸酯是BChE的特異性反應(yīng)位點(diǎn)，而水解之后暴露的羥苯基碳酰胺則作為ROS氧化還原的基團(tuán)。此探針使BChE催化的酶水解反應(yīng)與ROS誘導(dǎo)的氧化還原反應(yīng)發(fā)生偶聯(lián)，在酶水解和氧化還原兩個(gè)因素的共同作用下，亞甲藍(lán)產(chǎn)生熒光。該雙靶點(diǎn)探針還可避免假陽(yáng)性反應(yīng)。

Zhang等［70］開發(fā)了一種四價(jià)十字形DNA納米結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的級(jí)聯(lián)催化發(fā)夾結(jié)構(gòu)擴(kuò)增反應(yīng)，用于Aβ低聚物的檢測(cè)。兩個(gè)DNA納米結(jié)構(gòu)的末端分別被修飾上帶有熒光共振能量轉(zhuǎn)移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）供受體探針的DNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)，作為整個(gè)檢測(cè)的信號(hào)放大部分。他們還設(shè)計(jì)了一個(gè)能夠識(shí)別Aβ低聚物的DNA識(shí)別發(fā)卡和一個(gè)在打開后能夠釋放與DNA納米結(jié)構(gòu)結(jié)合的DNA單鏈的激活發(fā)夾。當(dāng)Aβ低聚物存在時(shí)，識(shí)別發(fā)夾與激活發(fā)卡結(jié)合釋放出激活發(fā)卡的DNA鏈，該鏈能夠觸發(fā)DNA納米結(jié)構(gòu)中的發(fā)夾打開，產(chǎn)生FRET信號(hào)，對(duì)Aβ低聚物的檢測(cè)限為0.69 pmol/L。

3.3.3 基于探針成像的AD早期診斷發(fā)射波長(zhǎng)在近紅外范圍內(nèi)的熒光探針允許光穿透組織，同時(shí)可以避免生物自發(fā)熒光。近紅外熒光（Near-infrared fluorescence，NIRF）已經(jīng)成為光學(xué)成像的首選工具。Seo等［71］設(shè)計(jì)了一種近紅外熒光探針，該探針以不同的構(gòu)象與tau聚集物、Aβ聚集物結(jié)合，且只有與tau聚集物識(shí)別時(shí)的構(gòu)象可以產(chǎn)生熒光。同時(shí)該探針表現(xiàn)出分子轉(zhuǎn)子特性，隨著溶液黏度的增加，探針的熒光強(qiáng)度增加。

Ge等［72］設(shè)計(jì)了一種熒光壽命探針，該探針以兩個(gè)鋅吡啶胺作為識(shí)別單元，可以與p－tau的磷酸化位點(diǎn)特異性結(jié)合，通過光致電子轉(zhuǎn)移機(jī)制（Photoinduced electron transfer mechanism，PET）實(shí)現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)p－tau蛋白的熒光壽命成像。

3.3.4 基于電化學(xué)的AD早期診斷Duan等［73］通過在多孔11-巰基十一碳酸（Mercapto undecanoic acid，MUA）修飾的Au電極上覆蓋平面雙層脂質(zhì)膜（Bilayer lipid membrane，BLM）構(gòu)建了電化學(xué)生物傳感器，根據(jù)可溶性低聚Aβ1－42（Low－mass，soluble oligomers，L－Aβ42O）和可溶性低聚Aβ40（L－Aβ40O）誘導(dǎo)BLM損傷的動(dòng)態(tài)差異，基于電化學(xué)阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）實(shí)現(xiàn)了兩者的選擇性測(cè)定。Au電極上的MUA層放大了與膜損傷相對(duì)應(yīng)的抗阻信號(hào)，提高了檢測(cè)靈敏度。BLM的弱電荷表面可以降低CFS中其他蛋白的非特異性吸附。該傳感器可在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)L－Aβ42O的測(cè)定，線性范圍為5～500 pmol/L，檢測(cè)限為3 pmol/L；可在60 min內(nèi)測(cè)定L－Aβ40O，線性范圍為60 pmol/L～6.0 nmol/L，檢測(cè)限為26 pmol/L。

3.3.5 基于納米材料的AD早期診斷Hadjidemetriou等［74］使用納米粒獲得血漿中的蛋白冠，監(jiān)測(cè)了血漿蛋白質(zhì)組隨AD進(jìn)展的變化。由于納米粒與體液孵育時(shí)，可以自發(fā)在表面捕獲數(shù)百種蛋白質(zhì)形成蛋白冠，因此可通過蛋白冠深入分析血漿蛋白質(zhì)組。通過LC－MS對(duì)所得的蛋白冠進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在Aβ斑塊形成前，AD患者血漿蛋白質(zhì)組的豐度開始出現(xiàn)波動(dòng)，并可以根據(jù)豐度變化確定疾病分期。

Iglesias－Mayor等［75］將雙功能Au@Pt/Au核@殼納米粒作為電化學(xué)免疫傳感的新型標(biāo)簽，基于水氧化反應(yīng)過程產(chǎn)生的催化電流的變化檢測(cè)p53的構(gòu)象變化，方法在血漿中的檢測(cè)限為66 nmol/L。構(gòu)象改變的p53在輕度認(rèn)知障礙患者中表達(dá)，并與認(rèn)知障礙的進(jìn)展呈正相關(guān)［76］。在Au@Pt納米粒表面的Au突起使納米粒更易與抗體進(jìn)行生物偶聯(lián)，且Au與Pt在納米粒表面的協(xié)同作用可提高催化活性，進(jìn)而提高檢測(cè)的靈敏度。

Vilela等［77］開發(fā)了一種基于上轉(zhuǎn)換納米顆粒－石墨烯氧化物的光學(xué)傳感器，可特異性檢測(cè)與AD相關(guān)的mi RNA。該傳感器將近紅外光上轉(zhuǎn)換與低背景光子計(jì)數(shù)相結(jié)合，能夠可靠地檢測(cè)fmol/L范圍內(nèi)的少量小寡核苷酸序列。即使在血漿和細(xì)胞裂解液等復(fù)雜介質(zhì)中，該傳感器對(duì)特定靶標(biāo)同樣具有高度的選擇性。

Zhang等［78］構(gòu)建了一個(gè)多路復(fù)用的表面增強(qiáng)拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）生物傳感器，用于檢測(cè)Aβ1－42低聚物和tau蛋白。他們將一段用于靶標(biāo)識(shí)別的適配體和一段用于修飾在金納米粒子（AuNPs）表面的polyA偶聯(lián)，當(dāng)靶蛋白與適配體特異性結(jié)合后，polyA寡核苷酸會(huì)偏離AuNPs，破壞溶液中納米偶聯(lián)物的穩(wěn)定性，引發(fā)相鄰AuNPs之間的等離子體共振耦合效應(yīng)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物的SERS檢測(cè)。該生物傳感器能夠在15 min內(nèi)完成檢測(cè)，并可以同時(shí)檢測(cè)tau蛋白和Aβ1－42低聚物。

3.3.6 基于miRNA檢測(cè)的AD早期診斷Dong等［79］首先采用高通量Solexa測(cè)序篩選AD血清miRNA的全基因組表達(dá)譜，然后采用個(gè)體水平的多重RT－qPCR檢測(cè)確定AD的特異性miRNA譜。與對(duì)照組相比，AD患者血清中有4種miRNA（miR－31、mi R－93、mi R－143和miR－146a）顯著減少，MCI中的miR－93和miR－146a顯著升高，可作為通過外周血進(jìn)行AD診斷的依據(jù)。

Chandrasekaran等［80］使用一種名為miRacles的技術(shù)進(jìn)行AD相關(guān)RNA的檢測(cè)。當(dāng)識(shí)別目標(biāo)miRNA后，DNA納米結(jié)構(gòu)由線型變成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由于線型結(jié)構(gòu)和環(huán)狀結(jié)構(gòu)的電泳速率存在差異，因此能夠通過電泳讀數(shù)報(bào)告其開/關(guān)狀態(tài)，實(shí)現(xiàn)miRNA的檢測(cè)。該方法能夠直接檢測(cè)天然miRNA，不需要擴(kuò)增、標(biāo)記以及酶的催化。該研究篩選了56種與AD相關(guān)的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中4種在AD患者腦中表達(dá)存在異常。該納米開關(guān)對(duì)與AD相關(guān)的mi R－107具有fmol/L級(jí)的靈敏度。

4 結(jié) 論

綜上所述，現(xiàn)階段被用于AD診斷的生物標(biāo)志物，包括腦脊液tau蛋白和β淀粉樣蛋白水平，以及能反映結(jié)構(gòu)和功能的PET成像等。但在通過早期診斷來干預(yù)AD的發(fā)展中作用有限，因?yàn)檫@些方法侵入性高，費(fèi)用昂貴，受眾群體較小?；谕庵苎纳飿?biāo)志物是更好的選擇，但由于血腦屏障的存在，腦脊液中各種疾病相關(guān)蛋白的表達(dá)量與外周血中相關(guān)蛋白的表達(dá)量可能相差甚遠(yuǎn)，現(xiàn)階段尚無滿足AD的血清學(xué)早期診斷靈敏度和特異性需求的生物標(biāo)志物供臨床應(yīng)用。但越來越多的生物標(biāo)志物可用于AD的診斷，相關(guān)研究也日益深入，日后有望開發(fā)出新的便捷、靈敏、高效、準(zhǔn)確的基于外周體液的AD分子診斷方法，以實(shí)現(xiàn)無創(chuàng)、傷害性小的輔助診斷。發(fā)掘疾病相關(guān)性高的外周體液生物標(biāo)志物并開發(fā)相應(yīng)的高效靈敏檢測(cè)方法是未來重要的研究方向，通過對(duì)AD的疾病篩查和早期診斷以及后續(xù)及時(shí)的預(yù)防和干預(yù)手段，將大大降低阿爾茲海默癥的疾病發(fā)病率，具有極為重要的臨床價(jià)值和社會(huì)意義。