微小RNA-21和程序性細(xì)胞死亡因子4在慢性阻塞性肺疾病患者支氣管肺泡灌洗液肺泡巨噬細(xì)胞中的表達(dá)研究

郭青春, 張杰根, 高雅倩, 呂永盛, 周鵬飛, 李欽招

(河北省涿州市醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科, 河北 保定, 072750)

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是臨床較為常見的慢性肺部疾病，以進(jìn)行性氣流受限為臨床表現(xiàn)，損害肺功能，嚴(yán)重威脅患者生存質(zhì)量[1]。目前, COPD發(fā)病相關(guān)因素尚未完全闡明，但學(xué)者認(rèn)為其發(fā)病與免疫紊亂、炎癥反應(yīng)、微小RNA(miRNA)等相關(guān)[2-3]。miRNA可調(diào)控有關(guān)基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)，其可能參與并影響COPD病理發(fā)展過程[4], 其中miR-21可通過增加自噬，進(jìn)而在COPD發(fā)生發(fā)展中起重要作用[5]。此外，程序性細(xì)胞死亡因子4(PDCD4)在非小細(xì)胞肺癌中表達(dá)下調(diào)，其可能在非小細(xì)胞肺癌病變過程中發(fā)揮作用[6]。但miR-21、PDCD4在COPD患者肺泡灌洗液(BALF)肺泡巨噬細(xì)胞(AM)中的表達(dá)及兩者聯(lián)合診斷COPD的研究較少?；诖?，本研究通過檢測(cè)COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4表達(dá)情況，有效克服了傳統(tǒng)檢測(cè)血清/血漿中待測(cè)指標(biāo)受多種因素的影響，可較為準(zhǔn)確地反映兩者相關(guān)性及其診斷COPD的價(jià)值，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年10月—2020年1月河北省涿州市醫(yī)院診治的135例COPD患者(COPD組)，其中COPD穩(wěn)定期患者62例(COPD穩(wěn)定組), COPD急性加重期(AECOPD)患者73例(AECOPD組)。135例患者中男95例，女40例; 年齡48～75歲，平均(62.59±7.70)歲; 體質(zhì)量指數(shù)(BMI)為18.74～26.56 kg/m2, 平均(23.83±2.46)kg/m2。另選取同期73例因喉部異物感、咳嗽等原因做纖維支氣管鏡檢查的健康者為正常組，其中男50例，女23例; 年齡48～76歲，平均(63.27±7.93)歲; BMI為18.93～25.07 kg/m2, 平均(22.64±2.27)kg/m2; 均無吸煙史或戒煙5年以上，且臨床診斷及鏡檢無明顯病變。另外，收集所有受試者入院時(shí)用力肺活量(FVC)、第1秒用力呼氣容積(FEV1)，計(jì)算FEV1/FVC及FEV1占預(yù)計(jì)值百分比(FEV1%)。

診斷標(biāo)準(zhǔn): 根據(jù)《慢性阻塞性肺疾病診治指南》[7]有關(guān)COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行判定。納入標(biāo)準(zhǔn): 患者均符合COPD診斷標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)合胸片、臨床表現(xiàn)、病史及有關(guān)實(shí)驗(yàn)室檢查將患者判定為AECOPD/COPD穩(wěn)定期患者; 患者均知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn): 合并血液病和心、肝、腎器官功能損害者; 合并支氣管擴(kuò)張、間質(zhì)性肺纖維化、免疫風(fēng)濕病、哮喘、肺結(jié)核、惡性腫瘤者; 合并妊娠者; 不能配合肺功能檢查者。COPD穩(wěn)定期診斷標(biāo)準(zhǔn): FEV1/FVC<70%，近2個(gè)月內(nèi)咳嗽、咳痰及呼吸困難無明顯加重者。AECOPD診斷標(biāo)準(zhǔn): 二氧化碳分壓>50 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa), 呼吸頻率>30次/min, 氧分壓<60 mmHg，同時(shí)伴有咳嗽、咳痰及呼吸困難癥狀明顯加重者?；颊呋蚱浼覍俸炇鹬橥鈺?，本項(xiàng)研究符合《赫爾辛基宣言》，獲得本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)號(hào)LL2017150215-0008)后進(jìn)行。

1.2 試劑與儀器

Trizol Reagent(B1277)購買于上海西唐生物科技有限公司, Transcriptor One-Step RT-PCR Kit(4655885001)購買于上海意杰生物科技有限公司, Perfectstart SYBR Green qPCR master mix(TQ2300-01)購買于上?，庬嵣锟萍加邢薰尽?/p>

核酸蛋白質(zhì)分析儀(ND-3800Q3000)購買于北京儀器有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)儀(MA-4800)購買于蘇州雅睿生物技術(shù)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本收集: 入院24 h內(nèi)，使用100 mL生理鹽水對(duì)所有受試者行支氣管鏡肺泡灌洗術(shù)，負(fù)壓回收量>40%定義為回收成功，利用Ficoll密度梯度離心及貼壁法原代分離BALF中AM, 于37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)12 h后，備用。

1.3.2 qRT-PCR法檢測(cè)BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA表達(dá)水平: 無菌環(huán)境條件下，按Trizol法提取所有BALF AM樣本總RNA，使用核酸蛋白質(zhì)分析儀檢測(cè)RNA純度及質(zhì)量。取2 μg總RNA, 參考Transcriptor One-Step RT-PCR Kit逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA。以U6/GAPDH為內(nèi)參, cDNA為模板，依據(jù)Perfectstart SYBR Green qPCR master mix說明書流程進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè), PCR反應(yīng)條件為: 97 ℃預(yù)變性3 min; 95 ℃變性35 s, 64 ℃退火/延伸40 s, 40個(gè)循環(huán)。miR-21、PDCD4分別以U6、GAPDH為內(nèi)參，引物序列見表1。以2-△△CT法計(jì)算miR-21、PDCD4mRNA相對(duì)表達(dá)量。

表1 miR-21、PDCD4及內(nèi)參U6、GAPDH的引物序列

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 各組一般資料比較

正常組與COPD組性別比例、年齡、BMI等比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。COPD組患者FEV1%及FEV1/FVC水平低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組一般資料比較

2.2 各組BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達(dá)水平比較

COPD穩(wěn)定組、AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平均高于正常組，PDCD4mRNA表達(dá)水平均低于正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平均高于COPD穩(wěn)定組,PDCD4mRNA表達(dá)水平低于COPD穩(wěn)定組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3。

表3 各組BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA

2.3 COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達(dá)水平與肺功能指標(biāo)相關(guān)性

COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān)(P<0.05);PDCD4mRNA表達(dá)水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈正相關(guān)(P<0.05)。見表4。

表4 COPD患者BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA

2.4 COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與PDCD4 mRNA水平的相關(guān)性

COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與PDCD4mRNA水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.467,P<0.05)。見圖1。

圖1 COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與PDCD4 mRNA水平的相關(guān)性

2.5 BALF AM中miR-21、PDCD4 mRNA表達(dá)水平對(duì)COPD的診斷價(jià)值

ROC曲線顯示, BALF AM中miR-21對(duì)COPD診斷的曲線下面積(AUC)為0.844(95%CI: 0.791～0.897), 截?cái)嘀禐?.54, 約登指數(shù)為0.567, 其靈敏度、特異度分別為70.4%、86.3%; BALF AM中PDCD4mRNA對(duì)COPD診斷的AUC為0.849(95%CI: 0.791～0.906), 截?cái)嘀禐?.70, 約登指數(shù)為0.586, 其靈敏度、特異度分別為77.8%、80.8%; 兩者聯(lián)合診斷COPD的AUC為0.903(95%CI: 0.855～0.951), 約登指數(shù)為0.753, 其靈敏度、特異度分別為90.4%、84.9%。見圖2。

3 討 論

COPD主要表現(xiàn)為肺泡結(jié)構(gòu)破壞、氣道炎癥及氣道重塑，可導(dǎo)致呼吸衰竭、肺心病，對(duì)患者生命安全及工作構(gòu)成極大威脅[8]。因此，尋找可早期診斷COPD、評(píng)估患者病情的指標(biāo)，及時(shí)給予適當(dāng)干預(yù)，對(duì)改善COPD患者生活質(zhì)量有一定的積極意義。

miRNA可在氣道重塑、免疫調(diào)節(jié)、自噬、信號(hào)傳導(dǎo)、炎癥反應(yīng)、血管重構(gòu)、細(xì)胞增殖、凋亡等過程中起調(diào)控作用，其與肺癌、急性呼吸窘迫綜合征、哮喘、COPD等肺部疾病密切相關(guān)[9-12]。研究[13]發(fā)現(xiàn), miR-21可促進(jìn)細(xì)胞遷移，參與血管新生過程，并參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)過程，其在COPD小鼠肺組織中表達(dá)失調(diào)，與肺功能呈負(fù)相關(guān)，可作為診治COPD的靶標(biāo)，且其水平有助于評(píng)估COPD嚴(yán)重程度; 另外, miR-21在COPD患者血清中表達(dá)上調(diào)，其可能通過參與炎癥反應(yīng)，影響肺血管重塑、蛋白酶及抗蛋白酶活性，從而在COPD發(fā)生發(fā)展中起促進(jìn)作用[14]。本研究中AECOPD組患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平明顯高于COPD穩(wěn)定組及正常組，且COPD穩(wěn)定組患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平明顯高于正常組，提示miR-21異常表達(dá)可能與COPD發(fā)生發(fā)展進(jìn)程關(guān)系密切，BALF AM miR-21表達(dá)水平有利于評(píng)估COPD患者病情嚴(yán)重程度，推測(cè)高水平miR-21可能通過促進(jìn)炎癥反應(yīng)，改變蛋白酶及抗蛋白酶活性，促使肺血管重塑等過程，進(jìn)而促進(jìn)COPD發(fā)生發(fā)展，但其具體生物作用機(jī)制有待深入研究證實(shí)。

研究發(fā)現(xiàn),PDCD4是常見的抑癌基因，其可能通過影響相關(guān)信號(hào)通路，抑制肺癌發(fā)生發(fā)展,PDCD4可能是治療肺癌的潛在靶標(biāo)[15]; 另外,PDCD4在哮喘中表達(dá)異常，其可影響支氣管膠原沉積、氣道嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)、黏液產(chǎn)生，其有望成為變應(yīng)性肺部炎癥類疾病氣道重塑的指標(biāo)[16]。上述研究表明，表達(dá)異常的PDCD4可能在肺部疾病中具有重要作用。相關(guān)研究[17]發(fā)現(xiàn), COPD等慢性呼吸道疾病患者發(fā)生肺癌風(fēng)險(xiǎn)更高, miR-21及其靶基因PDCD4在COPD相關(guān)的肺癌中呈異常表達(dá)，兩者可能在肺癌病變過程中起作用。本研究中AECOPD組患者BALF AM中PDCD4mRNA表達(dá)水平明顯低于COPD穩(wěn)定組、正常組，且COPD穩(wěn)定組BALF AM中PDCD4mRNA表達(dá)水平低于正常組，提示PDCD4可能參與并影響COPD發(fā)病進(jìn)程，檢測(cè)BALF AM中PDCD4mRNA表達(dá)水平有助于判定COPD疾病嚴(yán)重程度，其可能原因是低水平PDCD4可能通過增強(qiáng)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)影響有關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過程，從而影響COPD發(fā)生發(fā)展，但仍需進(jìn)一步探究其作用機(jī)制。

FEV1%、FEV1/FVC分別用于評(píng)價(jià)COPD嚴(yán)重程度、氣流受限[18]。本研究中COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與FEV1%、FEV1/FVC均呈負(fù)相關(guān),PDCD4mRNA表達(dá)水平與FEV1、FEV1/FVC均呈正相關(guān)，提示miR-21、PDCD4可能與呼吸功能相互影響，從而共同影響COPD疾病進(jìn)程。進(jìn)一步研究顯示, COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)水平與PDCD4mRNA水平呈負(fù)相關(guān)，提示miR-21可能與PDCD4相互作用，進(jìn)而協(xié)同影響COPD發(fā)生發(fā)展，但兩者相互作用機(jī)制仍需深入研究。本研究發(fā)現(xiàn), BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA診斷COPD的AUC分別為0.844、0.849, 當(dāng)BALF AM中miR-21相對(duì)表達(dá)量高于1.54或PDCD4mRNA低于0.70時(shí), COPD發(fā)生概率增加，提示BALF AM中miR-21、PDCD4mRNA對(duì)COPD有一定診斷價(jià)值, miR-21、PDCD4mRNA聯(lián)合診斷COPD的AUC為0.903, 相應(yīng)靈敏度為90.4%, 特異度為84.9%, 提示兩者聯(lián)合可提高對(duì)COPD診斷的靈敏度，增加對(duì)COPD的診斷效能。

綜上所述, COPD患者BALF AM中miR-21表達(dá)升高,PDCD4表達(dá)降低, miR-21可能與PDCD4相互作用，進(jìn)而共同在COPD發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，檢測(cè)BALF AM中miR-21、PDCD4表達(dá)水平有利于臨床診斷COPD及判斷COPD患者病情嚴(yán)重程度。但本研究未深入探究miR-21、PDCD4在COPD中的具體生物作用機(jī)制，且樣本量較少，后期將擴(kuò)大樣本量進(jìn)行探討。