川龍抑癌湯治療前列腺癌的作用機(jī)制探討

李文驥, 胡 芳, 徐 魏

(揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 1.江蘇省中西醫(yī)結(jié)合老年病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2.中馬分子腫瘤及中藥遞送國(guó)際聯(lián)合研究中心, 江蘇 揚(yáng)州, 225000)

前列腺癌是威脅男性生命健康的常見疾病之一，發(fā)病例數(shù)在全球新發(fā)癌癥病例中位列第4，其發(fā)病率與病死率在男性最常見癌癥類型中僅次于肺癌，且發(fā)病率仍在持續(xù)上升[1-2]。研究[3]發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)藥治療有助于改善晚期前列腺癌患者的相關(guān)癥狀，延長(zhǎng)生存期，對(duì)放化療等治療造成的不良反應(yīng)有一定減輕作用，可提高患者生活質(zhì)量。前列腺癌在中醫(yī)學(xué)中歸于“癃閉”“癥瘕積聚”等范疇，基本病機(jī)為正虛導(dǎo)致膀胱氣化不利，濕熱痰濁瘀毒阻滯[4]。川龍抑癌湯[5]是近代醫(yī)家在PC-SPES[6]基礎(chǔ)上總結(jié)臨床經(jīng)驗(yàn)，根據(jù)中醫(yī)辨證論治理論加減所得，全方組成包括靈芝孢子、地龍、莪術(shù)、川足、三七粉、紅花、大青葉，具有扶正益氣、活血化瘀的功效。研究[7-8]表明，川龍抑癌湯聯(lián)合抗雄激素治療或經(jīng)尿道前列腺切除(TURP)術(shù)治療晚期前列腺癌均取得了顯著效果，可改善患者臨床癥狀，且具有較高安全性。但目前關(guān)于川龍抑癌湯治療前列腺癌作用機(jī)制的研究較少，缺乏細(xì)胞及分子水平上的系統(tǒng)闡述。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)[9]是基于系統(tǒng)生物學(xué)、多向藥理學(xué)、基因組學(xué)等學(xué)科理論，運(yùn)用高通量篩選、網(wǎng)絡(luò)分析等技術(shù)，反映“中藥成分-靶點(diǎn)-疾病”作用關(guān)系的綜合性研究方法，有利于解析中藥復(fù)方的配伍規(guī)律及作用機(jī)制。本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析川龍抑癌湯治療前列腺癌的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及機(jī)制，旨在為后期實(shí)驗(yàn)研究提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 藥物活性成分及作用靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索靈芝、紅花、三七、莪術(shù)、大青葉的化學(xué)成分，以口服生物利用度(OB)≥30%和藥物相似性(DL)≥0.18為條件進(jìn)行篩選，獲取有效成分。川足、地龍為動(dòng)物藥，尚未被TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)收錄，需在中國(guó)知網(wǎng)、維普、萬(wàn)方、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，通過(guò)PubChem平臺(tái)查詢成分的簡(jiǎn)化分子線性輸入規(guī)范(SMILES)結(jié)構(gòu)，將SMILES結(jié)構(gòu)輸入Swiss ADME[10]網(wǎng)站進(jìn)行篩選，篩選條件包括藥代動(dòng)力學(xué)和類藥性相關(guān)參數(shù)，即胃腸道吸收(GI absorption)結(jié)果為“High”, 5種類藥性(Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge)結(jié)果中有2個(gè)及以上為“Yes”, 以此作為具有較好口服生物利用度和類藥性。將篩選得到的活性成分SMILES結(jié)構(gòu)輸入SwissTargetPrediction[11]網(wǎng)站，設(shè)置“Homo Sapiens”, 以“probability>0.1”為篩選條件，預(yù)測(cè)潛在靶點(diǎn)。

1.2 前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)篩選

通過(guò)GeenCards、OMIM及PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“Prostate Cancer”, 得到前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)，構(gòu)建前列腺癌靶點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.3 中藥成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

為明確川龍抑癌湯成分與前列腺癌潛在靶點(diǎn)間的相互作用，利用Hiplot在線工具將成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)取交集，通過(guò)Venn圖展現(xiàn)交集靶點(diǎn)，運(yùn)用Cytoscape 3.8.2軟件進(jìn)行可視化分析，構(gòu)建中藥成分-交集靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。

1.4 蛋白互作(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)驗(yàn)證

將篩選得到的川龍抑癌湯-疾病共同靶點(diǎn)上傳至STRING在線平臺(tái)，選擇“Homo Sapiens”, 設(shè)置置信度0.4, 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)模型，下載TSV文件，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.2, 通過(guò)Cytohubba插件篩選排名前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白并輸入GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)，驗(yàn)證其在前列腺癌組織中的表達(dá)是否存在意義。

1.5 基因富集分析

將川龍抑癌湯與前列腺癌的交集靶點(diǎn)上傳Hiplot在線平臺(tái)，以P<0.05為篩選條件進(jìn)行基因本體(GO)功能分析，了解川龍抑癌湯的主要作用過(guò)程，采用京都基因和基因組百科全書(KEGG)通路富集分析觀察靶點(diǎn)分布的通路情況，探討川龍抑癌湯治療前列腺癌的生物學(xué)過(guò)程及信號(hào)通路。

1.6 主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的分子對(duì)接

選取川龍抑癌湯中3個(gè)主要活性成分(槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素)與3個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)[基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP9)、前列腺素內(nèi)過(guò)氧化物合酶2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A(VEGFA)]進(jìn)行分子對(duì)接，通過(guò)PubChem在線網(wǎng)站獲取活性成分的2D結(jié)構(gòu)保存為SDF格式，將其導(dǎo)入Chem3D, 經(jīng)計(jì)算后獲得mol2格式。利用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)下載關(guān)鍵靶點(diǎn)的3D結(jié)構(gòu)，通過(guò)PyMOL軟件去水及小分子配體后，利用AutoDockTools 1.5.6軟件獲取成分與靶點(diǎn)的pdbqt文件，最后運(yùn)用Vina進(jìn)行分子對(duì)接，并通過(guò)PyMOL軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行可視化展現(xiàn)，一般以結(jié)合自由能<-5 kcal/mol為具有較好結(jié)合性。

2 結(jié) 果

2.1 川龍抑癌湯的有效成分及作用靶點(diǎn)

通過(guò)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)按照條件篩選得到成分?jǐn)?shù)為靈芝61個(gè)、莪術(shù)3個(gè)、紅花22個(gè)、三七8個(gè)、大青葉10個(gè)，手動(dòng)搜索并通過(guò)PubChem、Swiss ADME篩選得到川足[12]成分19個(gè)(見表1)、地龍[13]成分26個(gè)，經(jīng)SwissTargetPrediction預(yù)測(cè)并篩重后共得到575個(gè)靶點(diǎn)。

表1 中藥川足的活性成分

2.2 前列腺癌靶點(diǎn)檢索及獲取交集靶點(diǎn)

在Genecards、OMIM及PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞“Prostate cancer”, 篩重后共獲得10 207個(gè)前列腺癌疾病靶點(diǎn)，利用Hiplot在線工具獲得川龍抑癌湯與疾病靶點(diǎn)交集Venn圖，顯示共有486個(gè)交集靶點(diǎn)，見圖1。

圖1 川龍抑癌湯有效成分靶點(diǎn)與前列腺癌相關(guān)靶點(diǎn)Venn圖

2.3 川龍抑癌湯成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及可視化分析

通過(guò)Cytoscape 3.8.2軟件計(jì)算川龍抑癌湯中藥成分與交集靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系，其中共包含656個(gè)節(jié)點(diǎn)、1 641條邊, Dgree結(jié)果顯示，川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要成分包括槲皮素、β-谷甾醇、亞油酸、二氫辣椒素(DHC)和姜黃素等。

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)基因的驗(yàn)證

將篩選得到的486個(gè)共同靶點(diǎn)上傳至STRING 在線平臺(tái)，選擇“Homo Sapiens”, 設(shè)置置信度0.4, 構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，下載TSV文件，經(jīng)Cytoscape 3.8.2分析，顯示有563個(gè)節(jié)點(diǎn)發(fā)生相互作用，同時(shí)產(chǎn)生11 740條邊。通過(guò)Cytohubba插件篩選排名前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白(圖2), 將其輸入至GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行驗(yàn)證，設(shè)置|Log2FC|的截?cái)嘀禐?,P-value的截?cái)嘀禐?.01, 顯示PTGS2、VEGFA、MMP9等靶點(diǎn)基因在前列腺癌組織與正常組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3。

圖2 川龍抑癌湯治療前列腺癌的排名前30的關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白

A: PTGS2基因在不同組織中的表達(dá); B: VEGFA基因在不同組織中的表達(dá);C: MMP9基因在不同組織中的表達(dá)。紅色*表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.5 GO功能富集分析

通過(guò)Hiplot在線工具對(duì)486個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行GO功能富集分析，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得GO生物學(xué)過(guò)程及功能，主要涉及受體活性、轉(zhuǎn)錄因子活性、酶活性以及生物合成過(guò)程調(diào)控等方面，列舉生物學(xué)功能排名前20的條目，主要是核受體的活動(dòng)、配體激活的轉(zhuǎn)錄因子活性、蛋白絲氨酸/蘇氨酸激酶活性、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)酪氨酸激酶活性、G蛋白偶聯(lián)胺受體活性、前列腺素類受體活性、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等，見圖4。

圖4 關(guān)鍵靶點(diǎn)的GO功能富集分析柱狀圖

2.6 KEGG通路富集分析

通過(guò)Hiplot在線工具對(duì)486個(gè)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析，以P<0.05為篩選標(biāo)準(zhǔn)，經(jīng)校正排序后對(duì)位于前20的細(xì)胞信號(hào)通路進(jìn)行氣泡圖展示(圖5)，川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要細(xì)胞信號(hào)通路包括癌癥蛋白聚糖通路、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物及其受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路、C型凝集素受體信號(hào)通路、缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)信號(hào)通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號(hào)通路、白細(xì)胞介素-17(IL-17)信號(hào)通路、程序性細(xì)胞死亡蛋白-1/程序性死亡配體-1(PD-1/PD-L1)通路以及前列腺癌等癌癥通路。

圖5 關(guān)鍵靶點(diǎn)的KEGG通路富集分析氣泡圖

2.7 分子對(duì)接結(jié)果

運(yùn)用分子對(duì)接技術(shù)將主要成分槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白MMP9、PTGS2、VEGFA分別進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，槲皮素、β-谷甾醇、姜黃素均與關(guān)鍵靶點(diǎn)有較好的結(jié)合性，見表2。以姜黃素為例，其分子對(duì)接圖見圖6。

圖6 姜黃素與MMP9、PTGS2、VEGFA靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接示意圖

表2 川龍抑癌湯主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)蛋白的分子對(duì)接結(jié)果 kcal/mol

3 討 論

目前，前列腺癌正成為影響中國(guó)老年男性健康的重要疾病之一，且發(fā)病率仍在上升[14]。川龍抑癌湯方中的靈芝孢子為君藥可扶正益氣，靈芝孢子中的三萜類及多糖類等成分具有明顯的免疫調(diào)節(jié)作用，可增強(qiáng)患者免疫力，發(fā)揮抗腫瘤作用[15]。川足、地龍共為臣藥攻毒通絡(luò)，并可助靈芝扶益正氣，對(duì)腫瘤增殖具有明顯抑制作用[16]。三七、紅花、莪術(shù)、大青葉共為佐藥，具有活血散瘀解毒之功。三七總皂苷具有抑制腫瘤細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等抗腫瘤作用[17]; 紅花中的活性成分紅花多糖可通過(guò)增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬能力等作用調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)[18]; 莪術(shù)醇是莪術(shù)中的重要藥效物質(zhì)，可通過(guò)多種作用機(jī)制抗腫瘤，如抑制原癌基因、抑制腫瘤細(xì)胞核酸合成等[19]。川龍抑癌湯全方用藥符合現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果，兼顧標(biāo)本，共奏益氣扶正解毒之功效，符合前列腺癌正氣虛損，膀胱氣化不利，瘀毒阻絡(luò)的病機(jī)。呂水林等[20]研究發(fā)現(xiàn)，川龍抑癌湯聯(lián)合前列腺綠激光切除術(shù)治療前列腺癌與單純手術(shù)治療相比，可減輕患者相關(guān)臨床癥狀，提高患者生存質(zhì)量。

本研究結(jié)果顯示，川龍抑癌湯中有效活性成分共149個(gè)，對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)575個(gè)，其中與前列腺癌相關(guān)的共同作用靶點(diǎn)486個(gè)，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)圖發(fā)現(xiàn)姜黃素、β-谷甾醇、槲皮素、亞油酸、DHC等是川龍抑癌湯治療前列腺癌的主要活性成分。姜黃素作為天然化合物，具有良好的抗癌、抗炎特性，但存在一定缺陷，如低吸收與代謝快等, RUTZ J等[21]發(fā)現(xiàn)小劑量姜黃素聯(lián)合光照能顯著增強(qiáng)對(duì)體外前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移的抑制作用。PAN L等[22]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過(guò)調(diào)控miR-30a-5p/PCLAF軸抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、侵襲。AWAD A B等[23]發(fā)現(xiàn), β-谷甾醇通過(guò)增加活性氧(ROS)和基礎(chǔ)前列腺素的釋放促使人前列腺癌PC-3細(xì)胞凋亡來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)。槲皮素是一種生物黃酮，在抑制前列腺癌細(xì)胞增殖、遷移和促進(jìn)凋亡、逆轉(zhuǎn)前列腺癌耐藥性方面均有顯著效果[24]。共軛亞油酸(CLA)是亞油酸的異構(gòu)體混合物，可通過(guò)內(nèi)質(zhì)途徑、核途徑等多方面抑制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)與增殖[25], 如CLA拮抗前列腺素過(guò)氧化物合成酶的轉(zhuǎn)化，影響前列腺素合成，從而促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡。DHC是辣椒素的主要成分之一，對(duì)多種惡性腫瘤如乳腺癌、結(jié)直腸癌等均有一定抗癌作用, SHI S M等[26]發(fā)現(xiàn)經(jīng)DHC處理后的黑色素瘤A375和MV3細(xì)胞株，通過(guò)下調(diào)β-Catenin表達(dá)表現(xiàn)出對(duì)黑色素瘤細(xì)胞的顯著抑制作用。

本研究PPI網(wǎng)絡(luò)顯示，川龍抑癌湯治療前列腺癌的關(guān)鍵靶點(diǎn)包括蛋白激酶(AKT1)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)、TNF、白細(xì)胞介素-6(IL-6)、MMP9、細(xì)胞腫瘤抗原基因(TP53)、PTGS2、VEGFA等，排名前30的靶點(diǎn)經(jīng)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)驗(yàn)證顯示,MMP9、PTGS2、VEGFA在前列腺癌的發(fā)生發(fā)展中具有重要意義。MMP9是一種蛋白酶，在前列腺癌、乳腺癌、肝癌等多種癌癥中均過(guò)度表達(dá)，在細(xì)胞遷移、增殖和凋亡等過(guò)程中發(fā)揮抗腫瘤作用[27]。研究[28]表明, L-茶氨酸通過(guò)下調(diào)MMP9抑制前列腺癌的轉(zhuǎn)移。TONG W H等[29]研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素可通過(guò)激活5′-磷酸腺苷激活的蛋白激酶(AMPK)顯著降低MMP9、p65等的表達(dá)，從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞的遷移與侵襲。PTGS2是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶, ZHANG Z L等[30]發(fā)現(xiàn) miR-124-3p通過(guò)滅活PTGS2 抑制蛋白激酶/核因子κB(AKT/NF-κB)通路，促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞凋亡并抑制其增殖與侵襲。MU H Q等[31]研究發(fā)現(xiàn), VEGFA通過(guò)與miR-130b/TNF-α/NF-κB信號(hào)通路之間的負(fù)反饋循環(huán)衰減前列腺癌細(xì)胞中的miR-130b表達(dá)，從而促進(jìn)前列腺癌的血管生成。LIU Y等[32]發(fā)現(xiàn)，槲皮素通過(guò)下調(diào)VEGFA、MMP9等蛋白水平抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞遷移和血管生成。

本研究通過(guò)GO功能分析和KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，潛在活性靶點(diǎn)參與多種生物學(xué)過(guò)程來(lái)促進(jìn)前列腺細(xì)胞凋亡，抑制前列腺癌細(xì)胞增殖與侵襲，主要包括癌癥蛋白聚糖通路、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、TNF信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、PD-L1通路以及癌癥通路等。研究[33]發(fā)現(xiàn)，AGE與RAGE結(jié)合后激活PI3K/AKT信號(hào)通路，可能通過(guò)調(diào)控視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白促進(jìn)前列腺癌細(xì)胞增殖。HIF-1信號(hào)通路在多種腫瘤發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用, SONG J K等[34]分析HIF-1信號(hào)通路，對(duì)免疫基因組前列腺癌子集進(jìn)行分類研究，發(fā)現(xiàn)HIF-1_H可被定義為早期前列腺癌標(biāo)志物，對(duì)前列腺癌的治療及預(yù)后均有潛在臨床意義。IL-17是一種促炎細(xì)胞因子，可促進(jìn)血管生成和腫瘤細(xì)胞遷移，也能促進(jìn)免疫應(yīng)答發(fā)揮抑制腫瘤作用，其在前列腺癌組織中的表達(dá)水平顯著高于正常組織[35]。多項(xiàng)研究[36-37]表明, PD-1/PD-L1和PD-1/PD-L1免疫治療在多種腫瘤治療中發(fā)揮重要作用, PD-L1與Gleason評(píng)分密切相關(guān)，提示其可能與前列腺癌的發(fā)展有一定聯(lián)系，但還需進(jìn)一步開展相關(guān)臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析川龍抑癌湯治療前列腺癌的潛在活性成分、作用靶點(diǎn)及機(jī)制，盡管存在一定局限性(例如未對(duì)前列腺癌進(jìn)行中醫(yī)辨證分型，未明確藥物劑量，對(duì)動(dòng)物藥成分的檢索可能不夠全面)，但從整體上分析了潛在靶點(diǎn)并探索了可能的作用機(jī)制，為后續(xù)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及更深層次的藥理學(xué)探索奠定了一定基礎(chǔ)。