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    西達本胺通過線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)結(jié)腸癌HCT-15細胞凋亡

    2022-04-22 08:55:42趙琳珊李玉苗李楠賈友超王曉芳韓強臧愛民
    關(guān)鍵詞:西達乙?;?/a>細胞周期

    趙琳珊,李玉苗,李楠,賈友超,王曉芳,韓強,臧愛民

    (1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河北省腫瘤放化療機制與規(guī)程研究 重點實驗室,河北 保定 071000;2.河北大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院,河北 保定 071000)

    結(jié)腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,早期結(jié)腸癌患者采取手術(shù)為主的綜合治療,部分患者可以治愈[1]. 隨著靶向治療和免疫治療的進展,晚期結(jié)腸癌患者生存期逐漸延長,但治愈希望仍然渺茫,難以控制的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前臨床治療所面臨的難題,因此需要從不同角度進一步探索結(jié)腸癌生物學(xué)治療的手段.表觀遺傳修飾的改變在多種惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥過程中發(fā)揮重要作用,其中組蛋白乙?;c腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān).組蛋白乙酰化修飾由組蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?;?histone deacetylases,HDAC)協(xié)調(diào)進行.在腫瘤細胞中,HDAC的過度表達增強了組蛋白去乙酰化作用,DNA與組蛋白結(jié)合緊密,不利于抑癌基因的轉(zhuǎn)錄,導(dǎo)致基因“沉默”.由組蛋白乙?;揎椀母淖円鸬漠惓;虮磉_水平可以使用表觀遺傳藥物HDAC抑制劑調(diào)節(jié)或逆轉(zhuǎn)[2].

    西達本胺(Chidamide)化學(xué)名是N-(2-氨基-4-氟苯基)-4-{N-[(E)-3-(3-吡啶)丙烯?;鵠氨甲基}苯甲酰胺,是一種口服的組蛋白去乙?;敢种苿?,通過選擇性抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC10[3],調(diào)節(jié)染色體上的組蛋白和非組蛋白乙?;剑M一步調(diào)控基因的表達,從而誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡,阻滯細胞周期.西達本胺在外周T細胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤臨床試驗中顯示出較好的治療效果[4-7],但在實體瘤治療方面的價值仍不確定.本文旨在研究西達本胺對結(jié)腸癌細胞HCT-15的細胞凋亡和細胞周期的影響,并初步探討其作用機制,為結(jié)腸癌治療提供新的思路.

    1 材料與方法

    1.1 細胞株及培養(yǎng)條件

    人結(jié)腸癌細胞系HCT-15細胞株由南方科技大學(xué)饋贈.將含有10%(體積分數(shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于溫度為37 ℃,在體積分數(shù)5% CO2且相對濕度為90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),傳2-3代后取對數(shù)生長期細胞用于實驗.

    1.2 藥物和主要試劑

    西達本胺由深圳微芯科技公司饋贈,使用二甲基亞砜(DMSO)進行溶解,配制儲備液濃度為40 mmol/L,-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?Histone H3、Histone H4、Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4、Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved Caspase 3、Caspase 9、Cleaved Caspase 9、PARP、Cleaved PARP、Cytc、γH2AX、p21、p27、CDK2、CyclinA2抗體均購自cell signaling公司;CCK-8試劑盒購自MedChemExpress公司;FITC Annexin V凋亡檢測試劑盒購自BD生物公司;EdU細胞增殖檢測試劑盒購自銳博生物公司.

    1.3 CCK-8實驗檢測細胞活力

    將對數(shù)生長期HCT-15細胞每孔100 μL(4×103/孔)接種于96孔板,24 h后按不同濃度梯度(64、32、16、8、4、2、1 μmol/L)加入西達本胺含藥培養(yǎng)基,每組均設(shè)置了RPMI-1640培養(yǎng)基空白對照組和DMSO陰性對照組,并同時設(shè)置6個復(fù)孔.待培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后,避光加入CCK-8溶液10 μL,孵育4 h后,酶標(biāo)儀檢測波長450 nm光密度值(OD值),進行3次獨立重復(fù)實驗.計算抑制率,抑制率=(OD加藥組-OD空白組)/(OD對照組-OD空白組).

    1.4 細胞形態(tài)學(xué)觀察

    消化對數(shù)生長期HCT-15細胞每孔2.5 mL(5×105/孔)接種于6孔板,24 h后分別加入終濃度1.272、2.815、10.943 μmol/L的西達本胺含藥培養(yǎng)基,并設(shè)置DMSO陰性對照組,繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h后于顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化并拍照.

    1.5 克隆形成實驗

    取經(jīng)不同濃度西達本胺處理48 h后的HCT-15細胞,消化后按500/孔接種于6孔板,十字形晃動使細胞分散均勻,置于培養(yǎng)箱培養(yǎng),10 d后出現(xiàn)大于50個細胞肉眼可見的克隆集落且克隆之間不發(fā)生融合終止培養(yǎng).棄去培養(yǎng)基,PBS清洗2~3次,經(jīng)質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛固定20 min后,使用質(zhì)量分量1%的結(jié)晶紫染液染色15 min,洗去多余染色劑放置室溫干燥,待水漬消失后掃描拍照.

    1.6 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡

    消化對數(shù)生長期HCT-15細胞,5×105/孔,每孔2.5 mL接種于6孔板,24 h后分別加入終濃度2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基,并設(shè)置DMSO陰性對照組.繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用Annexin V-FITC/PI雙染法對細胞進行處理染色;避光、室溫(25 ℃)孵育15 min后,上機檢測.

    1.7 EdU細胞增殖實驗

    消化對數(shù)生長期HCT-15細胞,5×105/孔,每孔2.5 mL接種于6孔板,24 h后分別加入終濃度0.612、1.272、2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基.每組均設(shè)置DMSO對照組,繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進行EdU標(biāo)記.制備25 μmol/L的EdU工作液,加入6孔板孵育2 h,PBS清洗后加入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛使細胞固定,室溫孵育30 min,棄固定液后加入甘氨酸溶液,搖床孵育5 min以去除多余的固定液.清洗后加入滲透劑室溫孵育10 min.再次清洗后加入Apollo染色液,避光搖床孵育30 min.滲透劑清洗之后加入Hoechst染色液進行細胞核染色,避光搖床孵育30 min.PBS清洗2次洗去多余染色液,使用熒光倒置顯微鏡在鏡下觀察并拍照.

    1.8 蛋白免疫印跡實驗檢測細胞凋亡途徑

    收集經(jīng)不同濃度(1.272、2.815、10.943 μmol/L)西達本胺處理48 h后的HCT-15細胞蛋白.每個樣品取30 μg蛋白進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳,上層濃縮膠用60 V電壓,分離膠電壓調(diào)至100 V.將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,恒壓90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h.質(zhì)量分量5%脫脂奶粉室溫封閉2 h,洗膜3次,每次10 min.一抗采用1∶1 000體積比稀釋, 4 ℃孵育過夜,二抗采用1∶2 000體積比稀釋,室溫下孵育1 h.加入1∶1(體積比)配制的ECL化學(xué)發(fā)光A液、B液顯色3 min,使用化學(xué)發(fā)光儀顯影拍照.

    1.9 統(tǒng)計學(xué)分析

    采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism 8.0軟件進行數(shù)據(jù)分析及作圖,所有實驗均進行3次獨立重復(fù)實驗.(SPSS軟件計算72 h的 IC10、IC20、IC50值分別為1.272、2.815、10.943 μmol/L).采用單因素方差分析或獨立樣本t檢驗方法分析組間差異,P<0.05視為差異有統(tǒng)計學(xué)意義.

    2 結(jié)果

    2.1 西達本胺抑制HCT-15細胞的增殖

    CCK-8法檢測西達本胺對HCT-15細胞增殖的抑制作用,結(jié)果顯示,HCT-15細胞經(jīng)不同濃度藥物處理24、48、72、96、120 h后,能夠明顯抑制細胞增殖,相同濃度不同時段對比,隨著時間延長抑制率明顯增高,有明顯的時間依賴性,P<0.000 1(圖1a);相同時間不同濃度對比,隨著加藥濃度的增加抑制率明顯增高,當(dāng)藥物濃度為4 μmol/L時,抑制率出現(xiàn)明顯的濃度依賴性,P<0.000 1(圖1b).上述結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加和時間的延長,西達本胺抑制HCT-15細胞的增殖且呈一定的時間和濃度依賴性.

    a.相同濃度不同時段的抑制率;b.同時段不同濃度的抑制率.(與對照組比較:*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001,****P<0.000 1).圖1 西達本胺對HCT-15細胞的增殖抑制呈濃度-時間依賴性Fig.1 Concentration-dependent effect of Chidamide on HCT-15 cell proliferation

    2.2 西達本胺影響HCT-15細胞形態(tài)及克隆形成能力

    細胞經(jīng)不同濃度藥物處理后形態(tài)發(fā)生變化(圖2a),隨著藥物濃度及作用時間的增加,細胞形態(tài)變?yōu)殚L梭形,觸角增多,細胞內(nèi)顆粒物增多,并且可見空泡;同時相鄰細胞之間連接疏松,細胞膜折光度下降,細胞數(shù)量也隨之減少.平板克隆的結(jié)果顯示,隨著加藥濃度的增加克隆集落數(shù)減少,且單個集落體積逐漸減小(圖2b).平板克隆結(jié)晶紫染色結(jié)果同樣印證了上述結(jié)果,集落數(shù)明顯減少(圖2c).由此可見,西達本胺顯著影響了結(jié)腸癌HCT-15細胞的生物學(xué)形態(tài)和克隆形成能力.

    a.不同濃度西達本胺作用于HCT-15細胞48 h和72 h后的細胞形態(tài)變化; b.平板克隆形成實驗第10的集落形成情況; c.平板克隆形成實驗結(jié)晶紫染色.圖2 西達本胺抑制細胞增殖的形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Chidamide inhibits morphological changes of cell proliferation

    2.3 西達本胺誘導(dǎo)HCT-15細胞凋亡并阻滯細胞周期

    流式細胞術(shù)檢測到明顯的細胞凋亡,隨著加藥濃度的升高,細胞凋亡數(shù)量增多,早期凋亡細胞、晚期凋亡細胞和壞死細胞的數(shù)量都隨之上升(圖3a).測得實驗組凋亡率分別為12.32%±0.84%(P<0.05)、15.63%±0.91%(P<0.001),與對照組相比,有統(tǒng)計學(xué)意義(圖3b).與此同時通過EdU實驗檢測其細胞周期的變化(圖3c),隨著加藥濃度的增高,Hoechst藍色熒光染色細胞數(shù)目減少,即活細胞數(shù)減少,藥物對細胞殺傷作用顯著;EdU綠色熒光染色細胞數(shù)減少,即進入DNA復(fù)制期的細胞數(shù)量減少.表明西達本胺可以明顯促進HCT-15細胞凋亡、抑制其增殖且阻滯細胞周期.

    a.流式細胞術(shù)檢測HCT-15細胞凋亡;b.凋亡率與對照組相比具有顯著性差異(*P<0.05,**P<0.01,***P<0.001);c.EdU檢測HCT-15細胞周期阻滯.圖3 西達本胺對細胞凋亡和周期的影響Fig.3 Effects of chidamide on apoptosis and cell cycle

    2.4 西達本胺通過線粒體凋亡機制介導(dǎo)細胞凋亡

    Western blot 結(jié)果顯示,隨著加藥濃度增大,乙?;M蛋白Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4表達上調(diào)(圖4a).由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號通路相關(guān)蛋白Bcl-2表達下調(diào),Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達上調(diào).DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX表達上調(diào)(圖4b).細胞周期相關(guān)蛋白p21、p27表達上調(diào),CDK2、CyclinA2蛋白的表達水平下調(diào)(圖4c).

    圖4 西達本胺對乙?;M蛋白、線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白、周期蛋白表達的影響Fig.4 Effects of Chidamide on expression of acetylated histones,mitochondrial apoptosis pathway related proteins and cyclins

    3 討論

    結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的活化和抑癌基因的失活緊密相關(guān).組蛋白的乙?;欣贒NA和組蛋白八聚體的解離,核小體結(jié)構(gòu)變得松弛,使得原本無法和啟動子接觸的區(qū)域成為新的轉(zhuǎn)錄靶點,各種轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合,激活轉(zhuǎn)錄過程[8].西達本胺是一種新型的組蛋白去乙酰化酶抑制劑,通過抑制組蛋白去乙?;傅幕钚裕岣呓M蛋白的乙?;剑龠M抑癌基因的表達,誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡.本研究發(fā)現(xiàn),隨著藥物濃度的升高,HCT-15結(jié)腸癌細胞凋亡增多,細胞體外克隆形成能力減弱,初步證實了西達本胺對結(jié)腸癌HCT-15細胞系的抑制作用.而后筆者檢測了經(jīng)不同濃度西達本胺處理后的組蛋白的乙?;剑Y(jié)果顯示隨著加藥濃度增加Acetyl Histone 3、Acetyl Histone 4表達水平逐漸增高,證實了西達本胺可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細胞系組蛋白乙?;皆龈?

    進一步探討了西達本胺處理后結(jié)腸癌HCT-15細胞系的具體凋亡途徑.細胞發(fā)生凋亡的主要途徑有兩種,即內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑.內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo).以往研究表明,西達本胺可以通過激活線粒體凋亡途徑來誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡[9-10].西達本胺通過Caspase依賴的凋亡途徑抑制AML細胞增殖,阻斷G1/S期轉(zhuǎn)變,誘導(dǎo)細胞凋亡[11].西達本胺下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2,激活促凋亡蛋白Bax,在p53信號的調(diào)控下,Cytc從細胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體,與線粒體膜結(jié)合釋放Cytc,在dATP的作用下,Cytc釋放到細胞質(zhì)內(nèi),與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結(jié)合形成聚合物,與Caspase 9前體結(jié)合形成凋亡體,Caspase 9被激活.Caspase 9激活了該通路下游的一系列Caspase成員,包括Caspase 7和Caspase 3,進一步誘導(dǎo)特定的凋亡底物和細胞凋亡[12-13].此外,西達本胺還具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用[14].為了驗證以上結(jié)論,本研究檢測了由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號通路相關(guān)蛋白的表達量變化,結(jié)果顯示抗凋亡蛋白Bcl-2表達下調(diào),Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達上調(diào),隨著藥物濃度的增加,γH2AX表達量上升.這說明西達本胺可能通過上調(diào)組蛋白乙?;?,使染色質(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松,從而引起細胞的DNA雙鏈損傷并激活內(nèi)源性凋亡途徑促進腫瘤細胞凋亡,發(fā)揮抗腫瘤作用.細胞周期的調(diào)控主要與Cyclin、CDK以及CDKI有關(guān).Cyclin與CDK形成復(fù)合物促進細胞周期進展,而CDKI的作用則相反.p21是CDKI的成員,可抑制CDK活性,阻滯細胞周期.在結(jié)腸癌中,西達本胺調(diào)控p21、CDK4、p53表達水平,阻滯細胞于G0/G1期[15].在淋巴瘤中,西達本胺調(diào)控p21、CyclinE表達水平,阻滯細胞周期于G0/G1期[16].本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)西達本胺處理結(jié)腸癌細胞HCT-15后,p21表達上調(diào),而CDK2、CyclinA2蛋白的表達下調(diào),EdU實驗檢測細胞總周期變慢.結(jié)果提示西達本胺可能通過上調(diào)p21的表達并抑制周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物Cyclin-CDK-CDKI的活性達到阻滯細胞周期的效果.

    乙?;{(diào)控異常是多種腫瘤的共同生物學(xué)特征之一,西達本胺在淋巴瘤、乳腺癌均獲批適應(yīng)證,應(yīng)用前景廣闊,需要我們在其他類型腫瘤對其進行更深入的探索.本研究驗證了西達本胺在結(jié)腸癌細胞系HCT-15發(fā)揮作用的主要機制,探討了造成該細胞系凋亡的具體途徑,但是藥物造成DNA損傷的具體機制尚未明確,需要在后續(xù)的工作中繼續(xù)研究.

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