新型肝動脈栓塞微球制劑的制備

宋鵬錦，韓嘯，孫彩鳳，孫海川，曹曉亮，胡連棟

(1.河北大學(xué) 河北省藥物質(zhì)量分析控制重點實驗室，藥學(xué)院，河北 保定 071002；2.保定市第一中心醫(yī)院 醫(yī)務(wù)處，河北 保定 071000；3.保定市第一醫(yī)院 介入醫(yī)學(xué)科，河北 保定 071000)

據(jù)2020年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示[1]，原發(fā)性肝癌是第三大癌癥死亡原因，約有8.3×105例死亡.肝移植和手術(shù)切除是肝癌患者治療的主要選擇[2-3].大于3 cm腫瘤切除難度大，同時考慮到腫瘤的大小、數(shù)量和分布，手術(shù)切除并非適用所有患者[4].然而，接受了手術(shù)切除的患者中，術(shù)后5年復(fù)發(fā)率仍高達(dá)60%[5-6].

肝動脈灌注化療栓塞(TACE)是一種臨床上可接受的技術(shù)[7]，其主要原理是依次將化療藥物和栓塞材料注入腫瘤供血動脈內(nèi)，進(jìn)行化療栓塞.TACE優(yōu)勢如下：1)通過一次性大劑量灌注化療藥物，局部靶向腫瘤藥物濃度得到提高，靶向化療藥物接觸腫瘤組織的時間延長，患者的生存質(zhì)量顯著改善；2)選擇性閉塞病變血管，造成腫瘤組織供血不足和缺氧，達(dá)到治療目的[8].TACE已成為治療中晚期肝癌的首選方法[9].

現(xiàn)階段常見的栓塞材料有明膠海綿、碘化油乳劑、載藥微球、聚乙烯醇(PVA)顆粒等[10].隨著技術(shù)手段及栓塞材料的革新，相較于傳統(tǒng)的灌注化療和碘化油栓塞，載藥栓塞微球技術(shù)治療肝癌已成為近年來臨床研究的熱點.載藥栓塞微球技術(shù)具有藥物灌注化療和栓塞的雙重效果，能保證腫瘤區(qū)域足夠藥物濃度，降低全身血藥濃度水平，將原本每月1次的治療周期延長至3個月，比傳統(tǒng)TACE安全性更高[11].新型載藥微球產(chǎn)品能夠大幅度降低治療成本，拓寬治療范圍，受到專家的廣為期待.

姜黃素是一種天然的酚類色素[12].已有臨床數(shù)據(jù)和大量研究表明，姜黃素可通過多種機制影響癌細(xì)胞生長和凋亡，在多種惡性腫瘤治療方面發(fā)揮作用[13-15]，包括肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌、結(jié)直腸癌和卵巢癌等.

本文以PVA為載體，采用反相乳化交聯(lián)法制備了姜黃素載藥微球.確定最佳制備條件后，對微球的結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行了研究.建立了兔VX2肝癌模型[16]，同時對比分析了姜黃素栓塞微球?qū)Ω闻K腫瘤的治療效果和安全性.

1 儀器與試劑

聚乙烯醇(PVA 1788)購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；失水山梨醇單油酸酯(span 80)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚氧乙烯失水山梨醇單油酸酯(Tween 80)購自天津市天大化工實驗廠；姜黃素購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；液體石蠟購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；鹽酸購自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；T6紫外可見分光光度計購自北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；BT-9300ST激光粒度分布儀購自丹東百特儀器有限公司；JSM-7500冷場發(fā)射掃描電子顯微鏡購自日本電子株式會社；FJ-200 高速剪切勻質(zhì)機購自上海標(biāo)本模型廠；UNIQFD20C DSA血管造影介入治療系統(tǒng)購自荷蘭飛利浦公司；FV3000激光共聚焦掃描顯微鏡購自奧林巴斯(中國)有限公司.

2 方法

2.1 PVA栓塞微球的制備

稱取PVA溶解在去離子水中，制得PVA溶液，冷卻至室溫.將表面活性劑Span 80加入100 mL液體石蠟中攪拌，形成油相.取PVA溶液和鹽酸溶液混合，加熱并快速攪拌，形成水相.將水相加入油相中，攪拌(300 r/min)20 min，得到均勻的W/O型乳液.隨后加入交聯(lián)劑戊二醛，使其與PVA發(fā)生交聯(lián)反應(yīng).持續(xù)攪拌1 h，過濾，清洗，干燥，得白色粉末狀微球.

2.2 微球的形貌和粒度

使用碳導(dǎo)電雙面膠帶將微球固定在金屬樁上，真空下噴金，10 kV激發(fā)電壓下使用掃描電子顯微鏡觀察微球表面形態(tài)的變化.

將適量栓塞微球放入投料池中，啟動超聲循環(huán)，直至遮光率達(dá)到 10%～15%時停止，接著超聲循環(huán)約3 min，用激光粒度分布儀測量載藥微球粒度分布范圍，對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行整理記錄和計算，用跨距(Span)評估栓塞微球粒徑的均勻性.

式中，D90、D50 和D10分別代表 90%、50%和 10%栓塞微球最大粒徑小于該值所示粒徑.

2.3 生物安全性測試

取最優(yōu)化微球進(jìn)行急性溶血、細(xì)胞凋亡和體外細(xì)胞毒性實驗以證明微球的安全性.

2.3.1 急性溶血實驗

取 10 mL玻璃試管 7 支，每支試管中加入 2.5 mL體積分?jǐn)?shù)2%紅細(xì)胞混懸液，進(jìn)行編號：1號管加2.5 mL水作陽性對照組，2號管加2.5 mL生理鹽水作陰性對照組，將0.5 mL質(zhì)量濃度為12.5、25、50、100、150 mg/mL的微球分別加入到含2 mL生理鹽水的3至7號管中.

2.3.2 細(xì)胞凋亡

采用激光共聚焦掃描顯微鏡觀測MGC-803細(xì)胞在姜黃素藥物誘導(dǎo)下的凋亡過程.通過熒光雙染法，對處于各個凋亡時期的腫瘤細(xì)胞進(jìn)行考察.熒光雙染中用到的DAPI(4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二鹽酸鹽)屬于一種熒光染料，將癌細(xì)胞細(xì)胞核染成藍(lán)色；Alexa Fluro?488是一種熒光探針，將細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染成綠色[17].

2.3.3 體外細(xì)胞毒性實驗

選取小鼠 L929 纖維細(xì)胞，設(shè)置微球組、陰性對照組和陽性對照組.將小鼠 L929細(xì)胞稀釋至 5×104/mL，在無菌孔板中以 90 μL/孔加入細(xì)胞懸液，培養(yǎng) 12 h.微球組分別加入 1、3、 6.25、12.5、25、50、100、150 mg/mL栓塞微球；陰性對照組加入 100 μL 細(xì)胞培養(yǎng)基；陽性對照組加入 100 mL體積分?jǐn)?shù)5% DMSO 溶液，培養(yǎng) 48 h，置顯微鏡下觀察不同組的細(xì)胞形態(tài).每孔加入 10 μL 噻唑藍(lán)(MTT) 溶液，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，490 nm處測定吸光值，計算細(xì)胞相對增殖率(RGR)，將 RGR值轉(zhuǎn)化成 6 級，評定材料毒性，見表1.

以空白對照孔調(diào)零，按照公式計算各培養(yǎng)孔RGR.

式中,RGR為相對增殖率，%；X1為實驗樣品組的吸光度；X2為陰性對照組吸光度；X0為空白對照組吸光度.

表1 細(xì)胞毒性反應(yīng)分級

2.4 藥效學(xué)研究

2.4.1 VX2肝癌動物模型的建立

家兔術(shù)前禁食12 h，禁水4 h，操作見圖1.1)將VX2腫瘤細(xì)胞移植于兔后腿肌肉外側(cè)，植入1個月后可見實質(zhì)性腫塊，即荷瘤兔；2)處死荷瘤兔，在無菌條件下分離出VX2腫瘤，制成2 mm×2 mm×3 mm的腫瘤組織，然后將碎片儲存在生理鹽水中；3)進(jìn)行兔腹部正中切口手術(shù)，將VX2腫瘤接種于肝左葉候選肝區(qū)，用明膠覆蓋穿刺部位，左肝葉置換入腹腔，縫合切口，表面涂抹紅霉素軟膏；4)所有兔在VX2腫瘤植入后肌注硫酸慶大霉素(8×104U/d，2 mL)3 d.腫瘤在兔子的肝臟中生長14 d.

圖1 包埋法建立肝癌模型Fig.1 Establishment of hepatocellular carcinoma model

2.4.2 TACE治療

對植入VX2肝腫瘤的兔進(jìn)行TACE治療.將15只實驗兔隨機分為3組(姜黃素載藥微球栓塞組、空白微球栓塞組和單純造影組)，每組5只.載藥組和空白組做全麻處理，對每只家兔的下肢動脈進(jìn)行解剖，在DSA血管造影介入治療系統(tǒng)引導(dǎo)下，將導(dǎo)管導(dǎo)絲從股動脈移至肝腫瘤供血動脈，然后將栓塞微球分別注入家兔的供血動脈.縫合兔腿動脈，肌注硫酸慶大霉素(8×104U/d)3 d，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng).單純造影組在完成造影后直接撤出導(dǎo)管，縫合后采用與栓塞組相同的術(shù)后管理方式.

2.4.3 CT灌注掃描

所有接受TACE治療的實驗兔分別于術(shù)后14、21 d進(jìn)行CT掃描，與術(shù)前1周的CT影像數(shù)據(jù)對比，確認(rèn)成瘤情況，操作見圖2.依據(jù)CT影像測量腫瘤長寬高，計算體積：V=1/2×ab2，其中，a為腫瘤最長直徑，b為腫瘤最短直徑.

圖2 實驗兔 CT 檢查Fig.2 CT examination of experimental rabbits

2.4.4 生存期觀察

為了評估姜黃素載藥微球?qū)δ[瘤組織影響，動脈栓塞給藥后，觀察各組動物生長情況，記錄動物死亡數(shù)和平均生存時間，計算生命延長率(ILS).

對比各組實驗動物平均生存時間并做出生存曲線，用生存曲線分析動物存活率.

2.4.5 組織學(xué)評估

將TACE術(shù)后的3組肝癌兔解剖，取出肝癌組織后進(jìn)行H&E染色，置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，評價栓塞術(shù)后肝組織是否發(fā)生病理學(xué)改變.實驗過程中均按照動物倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)對動物進(jìn)行處置.

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)結(jié)果采用 SPSS 10.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析和處理，組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有顯著性意義.

3 結(jié)果

3.1 微觀形態(tài)

制備的微球外觀圓整、光滑，實驗結(jié)果見圖3a.激光粒度分布儀測得PVA載藥微球的平均粒徑為94.19 μm，粒徑分布在45～200 μm的微球為84.67%.D10為 39.22 μm、D50為 89.85 μm、D90為158.3 μm，計算得跨距為1.325，實驗結(jié)果見圖3b.

圖3 PVA微球的掃描電鏡照片(a)和粒徑分布(b)Fig.3 Scanning electron microscope of PVA microspheres(a) and size distribution of PVA microspheres(b)

3.2 載藥栓塞微球的安全性評價結(jié)果

3.2.1 急性溶血實驗結(jié)果

實驗結(jié)果見圖4(從左至右分別為1～7號管).1號管(陽性對照組)中紅細(xì)胞破裂(4 h)，溶液呈現(xiàn)紅色.2號管(陰性對照組)與含有微球樣品的3～7號管中上清液均為無色透明，底部有紅細(xì)胞沉降.

取微球樣品(150 mg/mL)及陰性和陽性對照組樣品分別置于顯微鏡下觀察.實驗結(jié)果見圖5.微球組與陰性對照組中的紅細(xì)胞形態(tài)完整，分散性良好，無聚集現(xiàn)象，而陽性對照組中的細(xì)胞破碎.實驗表明微球安全性較好，不會引起溶血現(xiàn)象.

圖4 溶血實驗結(jié)果(室溫放置4 h，從左至右1～7號管)Fig.4 Result of hemolysis test( for 4 h，tube 1—7 from left to right)

圖5 溶血實驗結(jié)果的光學(xué)顯微鏡照片F(xiàn)ig.5 Optical microscope images of hemolysis test

3.2.2 細(xì)胞凋亡結(jié)果

熒光雙染后，激光共聚焦掃描顯微鏡下的觀察結(jié)果見圖6.DAPI細(xì)胞核染色顯示，實驗組活細(xì)胞數(shù)量減少，微球粒徑大于細(xì)胞粒徑，難以被細(xì)胞攝取，載藥微球可釋放姜黃素將細(xì)胞殺死；香豆素6細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)染色顯示，載藥微球濃度增大，癌細(xì)胞數(shù)量減少，可通過調(diào)整給藥濃度殺死癌細(xì)胞.

圖6 激光共聚焦掃描顯微鏡觀察Fig.6 Fluorescence images under laser scanning confocal microscope

3.2.3 細(xì)胞毒性結(jié)果

體外細(xì)胞毒性實驗顯示，1、3、6.25、12.5、25、50 mg/mL質(zhì)量濃度組計算所得RGR均大于等于100%，空白微球和載藥微球的細(xì)胞毒性反應(yīng)分級均為 0 級，未對正常鼠 L929 纖維細(xì)胞造成明顯的毒性反應(yīng).

3.3 栓塞微球在VX2荷瘤兔體內(nèi)的栓塞效果

3.3.1 CT掃描結(jié)果

VX2荷瘤兔接受栓塞微球治療后，腫瘤體積出現(xiàn)不同程度的增長.栓塞治療21 d后，姜黃素微球栓塞組、空白微球栓塞組和造影劑組腫瘤體積分別為(4.32±1.46)、(5.96±1.07)和(9.30±1.38)cm3.姜黃素載藥微球組、空白微球栓塞組腫瘤體積明顯小于單純造影組(P<0.05).

3.3.2 存活結(jié)果

VX2荷瘤兔動脈栓塞后的存活曲線，實驗結(jié)果見圖7.平均生存時間分別為單純造影組 32.40 d、空白微球栓塞組37.60 d、姜黃素載藥微球栓塞組 47.80 d.計算可得，姜黃素載藥微球和空白微球治療組的ILS分別為46.80%和36.60%.由此可以看出栓塞給藥具有明顯的治療效果，且姜黃素載藥微球栓塞組優(yōu)于空白微球組.

3.3.3 H&E染色結(jié)果

肝臟組織病理學(xué)切片H&E染色結(jié)果見圖8.單純造影組腫瘤細(xì)胞形態(tài)多樣，病變周圍發(fā)現(xiàn)腫瘤巢，在腫瘤組織周圍見到厚厚的纖維間隔，幾乎沒有血管.與空白微球組相比，姜黃素微球組可見血管內(nèi)微球，周圍腫瘤組織不同程度減少，并可見腫瘤邊緣的凝血壞死區(qū)域.

圖7 各實驗組荷瘤兔 K-M 生存曲線Fig.7 K-M survival curves of tumor-bearing rabbits in each experimental group

a1、a2.單純造影組；b1、b2.姜黃素微球組；c1、c2.空白微球組.圖8 每組肝臟的組織病理學(xué)圖像(H&E染色)Fig.8 Histopathological images of liver in each group (H&E stain)

4 結(jié)論

目前廣泛的研究和臨床實驗證實，載藥微球可選擇性地將大部分藥物遞送至腫瘤部位，降低全身藥物濃度，但載藥微球的臨床使用受限于其單一的載藥模式和高昂的價格.本文以PVA為原料制備姜黃素栓塞微球.確定的最佳工藝參數(shù)為：質(zhì)量分?jǐn)?shù)5% PVA水溶液，含有質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.5% span 80的液體石蠟溶液，1 mol/L鹽酸作催化劑，乳化溫度為60 ℃.掃描電子顯微鏡顯示載藥微球球形好，平均粒徑為94.19 μm.生物安全性測試證明載藥微球安全指數(shù)較高，對癌細(xì)胞有抑制作用.藥效學(xué)實驗發(fā)現(xiàn)姜黃素微球?qū)ν酶伟┯兄委熥饔?綜上，本實驗研制的姜黃素栓塞微球安全性高，對肝癌的治療效果良好，有望用于臨床肝癌的治療.

5 討論

肝動脈化療栓塞能夠在降低化療藥物毒性的同時提高療效，應(yīng)用范圍廣，發(fā)展前景優(yōu)越.微球遞藥系統(tǒng)一直是藥劑學(xué)領(lǐng)域的研究熱點之一，姜黃素栓塞微球能夠緩慢釋放藥物，載藥量高，副作用少.國內(nèi)外研究均表明，載藥栓塞微球?qū)τ诙喾N類型腫瘤的臨床效果比常規(guī)栓塞和化療好.國內(nèi)外已上市銷售的有DC Bead?栓塞微球(英國)、Hepasphere?栓塞微球(美國)以及CalliSphere?栓塞微球(中國).當(dāng)前上市栓塞微球主要通過機械吸附或正負(fù)電荷結(jié)合方式載藥，載藥模式單一，同時載藥種類有限(臨床限于阿霉素、吡柔比星、伊立替康等)，價格昂貴.本研究將姜黃素包埋于載體內(nèi)制備微球，擴(kuò)大了栓塞載藥微球藥物的選擇范圍.今后實驗將進(jìn)一步優(yōu)化制劑工藝，加速栓塞微球向臨床應(yīng)用階段轉(zhuǎn)化，早日實現(xiàn)微球的生產(chǎn)上市.