清金化痰湯聯(lián)合亞胺培南體外抑菌活性研究*

杜 蕾 焦偉杰 張翔云 趙 旭

河南省中醫(yī)院藥學(xué)部，鄭州 450000

肺炎克雷伯菌為革蘭氏染色陰性腸桿菌科細(xì)菌，廣泛存在于自然界的水和土壤中，也存在于人、動(dòng)物上呼吸道和腸道中，是一種重要的條件致病菌，可引起肺部、尿路、血流、中樞及腹腔等部位感染，尤其是肺部感染和尿路感染[1]。根據(jù)歷年中國(guó)細(xì)菌耐藥監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示[2-4]，以肺炎克雷伯菌為代表的多重耐藥菌的檢出率呈急速上漲趨勢(shì)，給臨床的抗感染治療帶來了巨大壓力。目前臨床上普遍認(rèn)為，碳青霉烯類抗生素是治療多重耐藥肺炎克雷伯菌最有效的藥物[5]，其中亞胺培南為臨床常用治療肺炎克雷伯菌的碳青霉烯類抗菌藥物。但是，近年來隨著碳青霉烯類抗菌藥物的廣泛應(yīng)用，該類藥物的療效也逐漸減弱，常常導(dǎo)致臨床抗感染治療的失敗和病程的遷延[6]。清金化痰湯為清肺化痰之名方，最早記載于明代葉文齡的《醫(yī)學(xué)統(tǒng)旨》，并且收錄于2018年國(guó)家中醫(yī)藥管理局發(fā)布的《古代經(jīng)典名方目錄(第一批)》中。全方有化痰止咳、清肺潤(rùn)燥之功，是治療痰熱壅肺證的代表方劑。現(xiàn)代藥理研究[7-10]表明，清金化痰湯中的各味中藥大都具有抑菌、抗炎、調(diào)節(jié)免疫的功效。臨床研究表明，清金化痰湯可運(yùn)用于痰熱壅肺型肺部疾病的治療，如社區(qū)獲得性肺炎[11]、呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎[12]、重癥肺炎[13]、腦卒中相關(guān)肺炎[14]等，均可提高臨床總有效率，降低中醫(yī)癥狀評(píng)分，縮短發(fā)熱、咳嗽消失時(shí)間和胸部X線改善時(shí)間，從而提高療效、改善癥狀，減輕肺部炎癥反應(yīng)。為擴(kuò)大多重耐藥肺炎克雷伯菌的治療藥物選擇范圍，本研究通過體外抑菌實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)了清金化痰湯聯(lián)合亞胺培南對(duì)多重耐藥肺炎克雷伯菌的抑菌效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物

清金化痰湯由黃芩12 g、梔子12 g、桔梗15 g、麥門冬(去心)9 g、桑白皮9 g、浙貝母9 g、知母9 g、瓜蔞9 g、橘紅9 g、茯苓9 g、甘草3 g組成，購于河南省中醫(yī)院藥學(xué)部。采用煮沸法制備溶液，加2000 mL純化水浸泡30 min，煎煮30 min，尼龍網(wǎng)過濾留存藥液；藥渣再加入2000 mL純化水煎煮30 min，尼龍網(wǎng)過濾留存藥液；將2次煎煮后的藥液合并、離心后濃縮配制為1000 mg/mL的母液；將母液121 ℃、15 min高壓滅菌后裝于玻璃瓶4 ℃保存。每次實(shí)驗(yàn)藥物現(xiàn)配現(xiàn)用，實(shí)驗(yàn)時(shí)對(duì)藥物進(jìn)行倍比稀釋。注射用亞胺培南西司他丁鈉(杭州默沙東制藥有限公司，進(jìn)口藥品注冊(cè)證號(hào)H20130347，批號(hào)T024597)。

1.2 實(shí)驗(yàn)菌株

40株實(shí)驗(yàn)菌株均來自2019年7月1日—2020年12月31日河南省中醫(yī)院臨床分離株，排除同一患者重復(fù)株，通過微生物鑒定系統(tǒng)鑒定為肺炎克雷伯菌，并選出多重耐藥株(藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示對(duì)青霉素、頭孢唑林、頭孢曲松、頭孢吡肟、阿米卡星、慶大霉素、氨曲南、哌拉西林/他唑巴坦、頭孢哌酮/舒巴坦、環(huán)丙沙星、左氧氟沙星、厄他培南、亞胺培南、呋喃妥因、復(fù)方磺胺甲噁唑等均耐藥)，質(zhì)控菌為大腸埃希菌ATCC25922。

1.3 儀器與試劑

M-H肉湯培養(yǎng)基(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)、麥康凱平板(OXOID公司)、培養(yǎng)基血平板(上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司)、電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海精密儀器儀表有限公司，DHP-9162)、全自動(dòng)微生物鑒定藥敏分析儀(BD公司，Phoenix-100)、比濁儀(南京威美特科學(xué)儀器有限公司，HNTD5-TDR-1002)、1000 μL微量加樣器(Thermo Scientific，F(xiàn)INNPIPETTE F3)、200 μL微量加樣器(Thermo Scientific，F(xiàn)INNPIPETTE F3)、醫(yī)用離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司，L530R)、電子天平(上海上平儀器有限公司，F(xiàn)A2004)、營(yíng)養(yǎng)肉湯(杭州濱和微生物試劑有限公司)、0.9%NaCl注射液(四川科倫藥業(yè)股份有限公司)等。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 實(shí)驗(yàn)菌株液配制 取40株鑒定分離純化的多重耐藥肺炎克雷伯菌菌落，分別配制為0.5麥?zhǔn)媳葷?，再用M-H肉湯稀釋10倍備用。

1.4.2 最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)測(cè)定 取96孔平板，于1～12孔中加入100 μL肉湯，再將100 μL藥液加入第1孔內(nèi)，依次倍比稀釋到第10孔，取出100 μL棄去，1～10孔加100 μL懸菌液，使清金化痰湯在孔內(nèi)的最終濃度依次為250、125、62.5、31.25、15.625、7.813、3.906、1.953、0.977、0.488 mg/mL，亞胺培南在孔內(nèi)的最終濃度依次為1024、512、256、128、64、32、16、8、4、2 μg/mL，第11孔僅加入肉湯作陰性對(duì)照，第12孔僅加入菌液和肉湯作陽性對(duì)照。放置在37 ℃恒溫箱培養(yǎng)24～36 h后觀察結(jié)果，無細(xì)菌生長(zhǎng)且孔內(nèi)澄清即為MIC，同時(shí)觀察半數(shù)抑菌濃度(minimum inhibitory concentration reached by 50%，MIC50)和90%抑菌濃度(minimum inhibitory concentration reached by 90%，MIC90)。在讀取結(jié)果前，先觀察生長(zhǎng)對(duì)照管的細(xì)菌生長(zhǎng)情況是否良好，并檢查接種物的傳代培養(yǎng)是否污染。采用肉湯稀釋法測(cè)定單用及聯(lián)用清金化痰湯、亞胺培南的MIC范圍。

1.4.3 聯(lián)合抑菌試驗(yàn) 根據(jù)40株試驗(yàn)菌株的MIC結(jié)果，最高稀釋濃度為2倍MIC，分別配制對(duì)倍稀釋的清金化痰湯40組、亞胺培南8組。采用棋盤法取不同濃度的清金化痰湯和亞胺培南藥液各0.5 mL，兩兩組合加入試管，混合后每管藥液1 mL；再將試驗(yàn)菌液50 μL加入每組的各管藥液中，在35 ℃條件下培養(yǎng)24 h，讀取兩藥聯(lián)用最佳組合效應(yīng)時(shí)的分別MIC值，再計(jì)算FIC指數(shù)。

1.4.4 結(jié)果判讀 計(jì)算FIC指數(shù)，F(xiàn)IC指數(shù)=MIC(甲藥聯(lián)合)/MIC(甲藥單用)+MIC(乙藥聯(lián)合)/MIC(乙藥單用)。FIC≤0.5判定為協(xié)同作用，0.52判定為拮抗作用。

2 結(jié)果

2.1 MIC范圍、MIC50、MIC90比較

清金化痰湯、亞胺培南聯(lián)合用藥時(shí)的MIC范圍、MIC50、MIC90均較單獨(dú)用藥時(shí)明顯降低。見表1。

表1 單用及聯(lián)用的MIC范圍、MIC50、MIC90比較

2.2 FIC指數(shù)分布

聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，F(xiàn)IC≤0.5為42.5%，0.52為7.5%。

3 討論

多重耐藥菌所造成的感染已成為整個(gè)醫(yī)學(xué)界關(guān)注的焦點(diǎn)之一，目前治療耐藥菌感染疾病的藥物進(jìn)入了“新藥研發(fā)-臨床應(yīng)用-細(xì)菌耐藥”的惡性循環(huán)，對(duì)于多重耐藥菌，當(dāng)現(xiàn)有的抗菌藥物治療方案療效欠佳時(shí)，我們可以考慮運(yùn)用中醫(yī)藥方法來進(jìn)行治療，中藥治療就是其中非常行之有效的策略之一[15]。

清金化痰湯由黃芩、梔子、桔梗、麥門冬(去心)、桑白皮、浙貝母、知母、瓜蔞、橘紅、茯苓、甘草共11味中藥組成。方中黃芩清熱燥濕，善清肺胃之火，尤其善于清泄上焦?jié)駸?，為該方君藥。梔子、知母、瓜蔞、桑白皮共為方中臣藥；梔子，瀉火除煩、清熱利濕、涼血解毒，能清泄上、中、下三焦火邪；知母，清熱瀉火、滋陰潤(rùn)燥，長(zhǎng)于瀉肺熱、潤(rùn)肺燥；瓜蔞，清熱化痰、寬胸散結(jié)、潤(rùn)腸通便，《本草綱目》中記載該藥“潤(rùn)肺燥，降火，治咳嗽，滌痰結(jié)，利咽喉，止消渴”，善清肺熱，潤(rùn)肺燥而清熱痰、燥痰；桑白皮，能清泄肺火兼瀉肺中水氣而行平喘之功。方中佐藥為浙貝母、麥冬、橘紅、茯苓、桔梗，其中浙貝母清熱瀉肺、化痰止咳；麥冬養(yǎng)肺陰、清肺熱，益胃生津，清心除煩；橘紅寬中理氣、燥濕化痰；茯苓善滲利水濕，使?jié)駸o所聚，痰無由生；桔梗宣肺祛痰，助排壅肺之膿痰。使藥為甘草，止咳、祛痰、平喘，還可調(diào)和藥性。諸藥合用，共奏化痰止咳、清肺潤(rùn)燥之效。

現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，該方中的多個(gè)單味中藥成分也顯示有抗菌作用。例如，黃芩是臨床最常用的清熱解毒類中藥之一，其中所含的黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素是其特有的成分，也是其產(chǎn)生抑菌作用的主要成分，有研究[16]結(jié)果顯示黃芩苷可抑制細(xì)菌核酸代謝中的DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶Ⅰ和Ⅱ的一些關(guān)鍵催化亞基，從而抑制其功能，產(chǎn)生抑菌效應(yīng)。梔子含有的梔子苷是主要活性成分，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、溶血性鏈球菌、木霉菌等多種細(xì)菌、真菌均有一定的抑制作用[17]。桑白皮的提取物具有一定的殺菌防腐作用，一般認(rèn)為該作用是通過影響細(xì)菌的細(xì)胞結(jié)構(gòu)或相關(guān)的代謝酶而產(chǎn)生，有研究[18]發(fā)現(xiàn)桑白皮甾醇對(duì)大腸桿菌菌體分裂及菌體蛋白代謝有明顯的抑制作用，同時(shí)桑白皮甾醇對(duì)其他菌種也有一定的抑制作用，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑菌活性。浙貝母中含有多種甾體類生物堿化合物、有機(jī)酸及其脂類、揮發(fā)油、多糖等成分，能有效抑制金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、卡他球菌、銅綠假單胞菌等多種細(xì)菌的生長(zhǎng)[19]。桔梗具有藥食兩用性，其中含有桔梗多酚、桔梗多糖、桔梗皂苷等多種有效成分，桔梗提取物有抗炎、抗氧化、抗腫瘤等藥理作用，有研究[20]表明桔梗多酚對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門氏菌等抑菌作用顯著，有良好的抗菌活性。

肺炎克雷伯菌為呼吸道感染常見致病菌，所導(dǎo)致的肺炎可歸屬中醫(yī)學(xué)“咳嗽”范疇。病位在肺，與肺脾兩臟關(guān)系密切，其中以痰熱阻肺型在臨床較為常見；其病因病機(jī)多為熱邪或風(fēng)燥之邪犯肺，熱傷津液，煉液成痰，痰熱互結(jié)，加之脾虛生痰，痰熱相搏，壅結(jié)于內(nèi)，阻遏肺氣，致肺氣失于宣降，肺氣上逆。癥狀可見咳嗽或喘促、咳痰，身熱，胸悶胸痛，痰多、質(zhì)黏、色黃，舌苔黃膩，舌質(zhì)紅，脈滑數(shù)。清金化痰湯具有潤(rùn)肺清燥、清熱化痰、止咳平喘的功效，多用于痰濁不化、蘊(yùn)而化熱之證[21]。中藥具有天然、低毒甚至無毒、靶位多、不易產(chǎn)生耐藥性、安全性高等優(yōu)點(diǎn)，但面對(duì)耐藥菌，中藥大多直接抑菌殺菌效果不強(qiáng)。亞胺培南為臨床常用治療肺炎克雷伯菌的抗菌藥物，但近年來該藥物的耐藥率逐年增加，給臨床治療帶來極大挑戰(zhàn)[22]。中藥與抗菌藥物聯(lián)用可通過影響細(xì)菌生物被膜、調(diào)控耐藥基因表達(dá)或轉(zhuǎn)移、抑制滅活酶活性等機(jī)制改善甚至逆轉(zhuǎn)細(xì)菌耐藥性，從而達(dá)到事半功倍的治療效果[23]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，單用藥物時(shí)，清金化痰湯的MIC范圍為15.625～125 mg/mL，亞胺培南的MIC范圍為32～512 μg/mL；聯(lián)用藥物時(shí)，清金化痰湯的MIC范圍為7.813～62.5 mg/mL，亞胺培南的MIC范圍為32～256 μg/mL，均較單用時(shí)明顯降低。聯(lián)合抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，清金化痰湯聯(lián)合亞胺培南以相加和協(xié)同作用為主。

綜上所述，與單獨(dú)用藥相比，清金化痰湯與亞胺培南聯(lián)合用藥對(duì)多重耐藥肺炎克雷伯菌可表現(xiàn)出更好的抑菌作用。清金化痰湯聯(lián)合亞胺培南的抑菌效果大多表現(xiàn)為協(xié)同作用和相加作用。