野生扁蓿豆種子硬實破除方法研究

伊風(fēng)艷， 楊 鼎， 溫 超， 曄薷罕， 鞏 青， 吳玉霞， 布仁朝古拉， 張璞進

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 呼和浩特 010031； 2.卓資縣農(nóng)牧和科技局, 內(nèi)蒙古 卓資 012300;3.內(nèi)蒙古師范大學(xué)附屬第二學(xué)校， 呼和浩特 010090)

硬實種子是指種皮致密、不透水或透水性差而導(dǎo)致不能吸脹發(fā)芽且保持原來大小狀態(tài)的一類種子，該類種子常見于豆科、百合科、旋花科、錦葵科、山茶科等植物種子中，但以豆科種子硬實現(xiàn)象最為普遍[1-4]。種子硬實是植物的一種休眠形式，能使物種避免不良環(huán)境的影響，長時間保持其生活力，保持物種的正常繁衍，對種質(zhì)資源的保存和促進植物遠(yuǎn)距離傳播十分有利，但在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)實踐中會導(dǎo)致幼苗建植難、出苗不整齊等問題[5-7]。因此，在科研試驗及農(nóng)業(yè)生產(chǎn)利用中，掌握種子硬實原因和解除硬實方法一直是種子科學(xué)研究的熱點問題。針對種子硬實問題，國內(nèi)外學(xué)者開展了大量研究，主要包括物理方法、化學(xué)方法和生物方法[8-9]。在實際應(yīng)用過程中，不同植物種子由于硬實程度、種皮厚度等存在較大差異，最優(yōu)處理措施也不盡相同。

扁蓿豆(Medicagoruthenica)是豆科苜蓿屬多年生草本植物，具有廣適性和極強的抵抗干旱、低溫、鹽堿脅迫的能力，可在干旱、石質(zhì)和沙漠環(huán)境生長，是唯一能夠在青藏高原高寒地區(qū)生長的苜蓿屬多年生豆科植物，也是我國土壤貧瘠地區(qū)必不可少的優(yōu)質(zhì)牧草之一[10-13]。扁蓿豆在草地改良、生態(tài)治理及牧草育種中具有重要意義。扁蓿豆種子與其他豆科牧草種子一樣，存在嚴(yán)重的硬實現(xiàn)象，種子硬實率高達(dá)80%以上，自然發(fā)芽率只有20%[14]，這種硬實特性嚴(yán)重影響其在生產(chǎn)與研究中的直接利用。為此，李悅煊[15]、杜建才等[16]分別采用不同方法對細(xì)葉扁蓿豆以及扁蓿豆品系(90-36)種子硬實破除開展了相關(guān)研究。本試驗以野生扁蓿豆種子為材料，采用物理方法和化學(xué)方法處理種子，開展不同處理下種子萌發(fā)特性的研究，旨在探討適宜破除扁蓿豆種子硬實的最佳方法，為扁蓿豆新品種培育、栽培技術(shù)研究及其推廣利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

扁蓿豆種子于2019年采集于內(nèi)蒙古通遼市科爾沁沙地。

1.2 試驗方法

1.2.1種子基本性狀

挑選發(fā)育良好且成熟飽滿的種子置于解剖鏡下，觀察其性狀、顏色、表面紋理等特征；用游標(biāo)卡尺測量其長、寬、厚，10次重復(fù)；選取 1 000 粒種子，用萬分之一天平測定種子千粒重，3次重復(fù)。

1.2.2種子的硬實率測定

隨機選取凈種子100 粒浸泡于45 ℃溫水中，自然冷卻，浸泡24 h，統(tǒng)計未吸脹的種子數(shù)，計算種子的硬實率，3次重復(fù)。

1.2.3種子硬實的破除

1) 物理破除法

打磨處理：取一定量飽滿干凈的種子，利用砂紙打磨，直至種子表面失去光澤、出現(xiàn)砂劃的痕跡，進行萌發(fā)試驗。

切破處理：取一定量飽滿干凈的種子，用解剖刀切破胚根相對端種皮，注意在處理過程中不得傷胚，處理完進行萌發(fā)試驗。

熱水浸種處理：將一定量飽滿干凈的種子分別置于溫度為60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃的水中，設(shè)置浸泡時間為5 min和10 min，取出待水自然冷卻到室溫后，置于濾紙上晾干后進行萌發(fā)實驗。

低溫浸種處理：將一定量飽滿干凈的種子分別置于液氮中處理5、10、15、20、30、40 min，取出進行萌發(fā)試驗。

2) 化學(xué)破除法

98%濃硫酸處理：將一定量飽滿干凈的種子放入小燒杯中，利用98%的濃硫酸溶液分別處理種子5、10、15、20、25、30、40 min，用玻璃棒攪拌，使種子充分接觸硫酸溶液，達(dá)到處理時間后，立即取出用蒸餾水反復(fù)沖洗直至將濃硫酸完全去除，置于濾紙上晾干后進行萌發(fā)試驗。

鹽酸溶液處理：將一定量飽滿干凈的種子放入100 mL的三角瓶中，利用濃度為20%的HCl溶液分別處理種子20、40、60、80、100 min，處理期間三角瓶用封口膜封口并不斷搖晃，使種子充分接觸溶液，達(dá)到處理時間后，取出用蒸餾水沖洗干凈，置于濾紙上晾干后進行萌發(fā)試驗。

氫氧化鈉溶液處理：將一定量飽滿干凈的種子放入小燒杯中，利用30%的氫氧化鈉溶液分別處理種子1、2、3、4、5、6 h，處理期間用玻璃棒不斷攪拌，使種子充分接觸溶液，達(dá)到處理時間后，立即取出用蒸餾水反復(fù)沖洗直至將氫氧化鈉溶液完全去除，置于濾紙上晾干后進行萌發(fā)實驗。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)發(fā)芽試驗

將處理后的種子均勻擺放于鋪有雙層濾紙直徑為90 mm培養(yǎng)皿中，置于12 h/12 h(光/暗)，溫度為(25±2)℃的光照培養(yǎng)箱中進行萌發(fā)試驗，4 次重復(fù)，每重復(fù)50粒種子，并設(shè)置對照(未做任何處理，ck)。第 4天初次計數(shù)，第14 天統(tǒng)計正常幼苗數(shù)和硬實種子數(shù)，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率、硬實率和霉變率。

發(fā)芽勢(%) =(前4 d正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

發(fā)芽率(%) =(14 d內(nèi)正常發(fā)芽的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

硬實率(%) =(14 d未吸脹的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%；

霉變率(%) =(霉變的種子數(shù)/供試種子數(shù))×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

利用Microsoft Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)處理與作圖，利用SAS軟件進行單因素顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 種子形態(tài)特征

扁蓿豆種子為橢圓形，種皮黃褐色或褐色，種臍位于一側(cè)，表面較光滑，長度(2.971 4 ± 0.179 0)mm，寬度(2.057 1±0.145 0)mm，厚度(0.971 4±0.109 7)mm。千粒重(3.447 8±0.050 9)g，平均硬實率92.5%。

2.2 切割和打磨處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果

扁蓿豆種子在自然狀態(tài)下存在嚴(yán)重的硬實現(xiàn)象，未經(jīng)處理的扁蓿豆種子發(fā)芽率為9.00%左右，硬實率高達(dá)91.00%。但經(jīng)過砂紙打磨和切割處理后，扁蓿豆種子的硬實率顯著下降(p<0.05)。經(jīng)過適度的砂紙打磨，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均比對照顯著提高了74.00%和73.50%，硬實率顯著降低了84.50%，但種子霉變率顯著提高；經(jīng)過切割處理，種子硬實率降為0，硬實完全被破除，發(fā)芽率達(dá)99.00%，與對照相比顯著提高了90.00%，只有1%的種子發(fā)生死種現(xiàn)象。

2.3 熱水浸種處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果

由表1可知，經(jīng)過不同溫度的熱水處理，種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢與對照組相比均有所提高，硬實率有所降低?？傮w來看，隨著處理水溫的提高，扁蓿豆種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢均呈上升趨勢。60 ℃和70 ℃處理下，種子萌發(fā)的各項指標(biāo)與對照無顯著差異；80～100 ℃處理下，種子發(fā)芽率和發(fā)芽勢均顯著高于對照，硬實率顯著降低，在100 ℃下浸種5 min時達(dá)到最大發(fā)芽率(77.00%)和最大發(fā)芽勢(74.00%)，硬實率降低到12.00%，但霉變率顯著升高；而在100 ℃下浸種10 min，發(fā)芽率和發(fā)芽勢呈現(xiàn)顯著降低，霉變率顯著升高。由此可見，100 ℃熱水浸種5 min對扁蓿豆種子打破硬實效果較好。

表1 熱水浸種處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果Table 1 Effects of hot water soaking on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.4 低溫處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果

與對照相比，經(jīng)液氮處理5～40 min，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率均顯著提高(p<0.05)，硬實率顯著降低(表2)。各處理時間下的指標(biāo)差異基本不顯著，處理時間為30 min時種子的發(fā)芽率達(dá)到最高，為71.00%，比對照提高了62.00%，硬實率顯著降低到26.50%，比對照降低了64.50%。試驗中發(fā)現(xiàn)，隨著液氮處理時間的延長，萌發(fā)后的幼苗根系和子葉受到的影響越大，根系逐漸縮短甚至出現(xiàn)不同程度的斷裂現(xiàn)象，子葉從培軸上掉落。由此可見，液氮處理雖然能破除扁蓿豆種子的硬實，提高其發(fā)芽率，但對種苗也造成了很大的傷害。

表2 液氮處理破除扁蓿豆種子硬實效果Table 2 Effects of liquid nitrogen treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.5 98%濃硫酸處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果

98%濃硫酸破除硬實主要是利用其強氧化性，腐蝕并破壞種皮結(jié)構(gòu)，使種子能夠吸水萌發(fā)。由表3可看出，98%濃硫酸浸種不同時間對扁蓿豆的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和硬實率均產(chǎn)生了不同的影響。處理時間在0～15 min時，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率隨著處理時間的延長均顯著提高，硬實率顯著降低，但處理時間達(dá)到15 min后，各處理時間之間種子發(fā)芽勢、硬實率均無顯著差異，而發(fā)芽率在處理時間為30～40 min時呈現(xiàn)降低趨勢，霉變率顯著升高，處理40 min時，霉變率高達(dá)9.50%，并且幼苗出現(xiàn)斷苗、根系變粗等現(xiàn)象。綜合各項指標(biāo)以及種苗生長狀態(tài)，利用98%濃硫酸打破扁蓿豆種子硬實比較合理的時間為20 min。

表3 98%濃硫酸處理破除扁蓿豆種子硬實效果Table 3 Effects of 98% sulfuricacid treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

注：不同小寫字母表示差異顯著(p<0.05)。下同。圖1 切割和打磨處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果Fig.1 Effects of cutting and grinding treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

2.6 鹽酸溶液和氫氧化鈉溶液處理對破除扁蓿豆種子硬實的效果

由圖2可知，利用20%HCl溶液浸泡對扁蓿豆種子的硬實破除效果均不理想。20%HCl溶液處理20 min時發(fā)芽率反而低于對照，當(dāng)處理時間為40～100 min時，發(fā)芽率有所提升，但提升均未達(dá)到顯著水平(p>0.05)，種子硬實率依然在88.00%以上。

由圖3可知，30% NaOH 溶液浸泡不同時間，扁蓿豆種子的發(fā)芽率與對照相比均無顯著的差異(p>0.05)。

圖3 30% NaOH 溶液處理破除扁蓿豆種子硬實效果Fig.3 Effects of 30% NaOH treatment on breaking hardness of M. ruthenica seeds

3 討 論

由于種皮具有發(fā)達(dá)的角質(zhì)層、柵欄狀細(xì)胞和骨狀石細(xì)胞，使種皮的透水透氣性較差，對胚的生長產(chǎn)生機械束縛，導(dǎo)致種子不能萌發(fā)[17-19]，造成硬實現(xiàn)象。不同的物種機械束縛和透水性不同，硬實程度也存在一定差異，所以，破除硬實的最佳處理方式也會有所不同。關(guān)于硬實的破除研究已有大量的報道，物理方法(劃破種皮、砂紙打磨、熱水浸泡)或化學(xué)方法(強酸、強堿)等都能有效破除種子硬實[20-22]。本研究中，野生扁蓿豆種子的硬實率高達(dá)92.50%，采用劃破種皮和砂紙打磨可使其硬實率降低到0和7.50%，該類方法雖然操作簡單、安全，但耗時耗力，尤其不適宜處理大量種子，且砂紙打磨程度較難掌握，易導(dǎo)致種子受損死亡。

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，熱水浸種處理破除種子硬實更為實用。熱水浸種，可以軟化種皮，去掉種皮表層的蠟質(zhì)和油脂，提高種皮的透水性和透氣性，浸出種子內(nèi)發(fā)芽的抑制物，促進種子萌發(fā)，操作簡單、經(jīng)濟環(huán)保、效果顯著，在實際應(yīng)用中具有顯著的優(yōu)勢。但不同種子破除硬實所需求的浸泡溫度、浸種時間都有所不同，如刺槐種子在100 ℃熱水中浸泡24 h[23]、美麗決明種子在40 ℃熱水中浸泡30 min[24]、印度田菁種子在80 ℃熱水中浸泡3 min[25]、任豆種子在70 ℃熱水中浸泡30 min[26]均達(dá)到最佳破除效果。本研究中100 ℃熱水浸種5 min，其發(fā)芽率可達(dá)77.00%，硬實率顯著降低到12.00%，但有11.00%的種子出現(xiàn)糜爛現(xiàn)象，這一結(jié)果與杜建才等[16]對扁蓿豆品系(90-36)種子硬實破除研究結(jié)果一致，說明熱水浸泡能夠有效地打破扁蓿豆種子硬實現(xiàn)象，但對種子本身會產(chǎn)生一定的傷害。

液氮可用于儲藏種子，也可用于解除種子的硬實。通過液氮處理可以增加種子的透性。本研究中經(jīng)過不同時間的液氮處理，均能有效破除扁蓿豆種子的硬實，硬實率可降低到26.50%，但隨著處理時間的延長，出現(xiàn)斷苗斷根現(xiàn)象。這一結(jié)果與前人在黃花苜蓿[22,27]、額濟納旗苦豆子[25]等種子上的研究結(jié)果一致，液氮浸種容易引起子葉柄、根系斷裂，導(dǎo)致不正常苗增多。但也有研究表明，液氮處理能夠有效破除紫花苜蓿、草木樨、百脈根等種子硬實，且對種子活力沒有傷害[25]。由此可見，不同的物種由于種皮結(jié)構(gòu)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)不同，對液氮的反應(yīng)也不同，因此，在實際操作中應(yīng)根據(jù)物種選擇適宜的處理方法。

濃硫酸具有強氧化性，濃硫酸浸種處理是破除種子硬實最常用的方法之一。通過98%濃硫酸處理，可使存在硬實的山地巖黃芪種子[28]、黃花苜蓿種子[21]、草木樨種子[29]、野大豆種子[30]的發(fā)芽率分別提高到96.67%、99.00%、100%、99.50%，但不同的物種處理的最佳時間存在差異。本研究中98%濃硫酸對破除扁蓿豆種子硬實效果也比較顯著，經(jīng)98%濃硫酸處理后，種子的硬實率逐漸降低，當(dāng)處理時間為25 min，種子的發(fā)芽率高達(dá)96.50%，隨著處理時間的延長，種子硬實被完全打破，但發(fā)芽率開始降低，種子腐爛壞死數(shù)增多，幼苗生長緩慢，該類現(xiàn)象在其他物種上也存在[22,31]。濃硫酸雖然增加了種皮的通透性，但強腐蝕會傷及種子內(nèi)部組織，對種子產(chǎn)生毒害作用，進而導(dǎo)致該類現(xiàn)象的產(chǎn)生。

20%HCl溶液和30% NaOH溶液對破除扁蓿豆種子硬實作用很小或沒有作用，其原因可能是種皮堅硬不透水導(dǎo)致溶液很難發(fā)揮作用。