基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)探討二陳湯調(diào)節(jié)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥脂骨代謝紊亂的藥效機(jī)制

張 欣，韓一旦，許云騰，王曉寧，嚴(yán) 輝，王 杰，李西海，4，王珊珊*

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122；3.中國(guó)科學(xué)院精密測(cè)量科學(xué)與技術(shù)創(chuàng)新研究院，湖北武漢430071；4.福建省中西醫(yī)結(jié)合老年性疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350122）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是女性絕經(jīng)后卵巢功能衰退、雌激素水平下降而引起的以骨髓脂肪化、骨質(zhì)流失、骨微結(jié)構(gòu)受損、骨強(qiáng)度降低為主要特征的代謝性疾?。?］。雌激素水平的下降不僅可以直接影響骨代謝，還可引起脂代謝異常與功能障礙，間接引起骨髓微循環(huán)障礙、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）成骨成脂分化失衡，進(jìn)而降低骨代謝能力、促進(jìn)骨丟失［2-3］。同時(shí)，脂代謝紊亂易導(dǎo)致脂肪細(xì)胞增多，誘發(fā)脂肪組織擴(kuò)張，故PMOP脂骨代謝紊亂患者時(shí)常伴隨肥胖癥狀，而肥胖可通過(guò)多種作用機(jī)制對(duì)骨骼產(chǎn)生不利影響［4-6］。肥胖癥是PMOP脂骨代謝紊亂的常見(jiàn)并發(fā)癥，二陳湯對(duì)脂代謝紊亂具有較好的改善作用［7］，基于脂代謝異常以及肥胖癥對(duì)骨代謝產(chǎn)生的不利影響，推測(cè)二陳湯對(duì)脂代謝的調(diào)節(jié)作用可間接影響骨代謝，具備調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂、降低PMOP患者并發(fā)肥胖癥的概率，以延緩PMOP疾病發(fā)展進(jìn)程、改善其臨床癥狀的潛力，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索與驗(yàn)證，故本文選取PMOP與肥胖癥的基因數(shù)據(jù)進(jìn)行整合，應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對(duì)接技術(shù)從二陳湯的物質(zhì)基礎(chǔ)出發(fā)，探究其調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的潛在分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 PMOP與肥胖癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集與整理 通過(guò)GeneCards（https：//www.genecards.org/）、DRUGBANK（https：//www.drugbank.com/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）、OMIM（https：//omim.org/）以及TTD（http：//db.idrblab.net/ttd/）數(shù)據(jù)庫(kù)分別查找PMOP、肥胖癥的相關(guān)疾病靶點(diǎn)，其中Gene-Cards數(shù)據(jù)庫(kù)的Relevance score值越高則代表該靶點(diǎn)與疾病關(guān)系越密切，若靶點(diǎn)過(guò)多則可根據(jù)Relevance score值篩除相關(guān)性較小的靶點(diǎn)。利用R 4.0.3軟件將各數(shù)據(jù)庫(kù)所得靶點(diǎn)匯總后刪除重復(fù)項(xiàng)。

1.2 二陳湯有效成分及作用靶點(diǎn)收集與整理 在TCMSP中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（https：//old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）分別檢索半夏、陳皮、茯苓、甘草四味藥的有效成分，并根據(jù)生物口服利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且類(lèi)藥性（druglikeness，DL）≥0.18篩選出具有較高活性的有效成分及其作用的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。利用Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.uniprot.org）對(duì)所有藥物靶點(diǎn)信息統(tǒng)一進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，去重后即得二陳湯相關(guān)作用靶點(diǎn)。

1.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治?利用R 4.0.3軟件將篩選后的PMOP、肥胖癥疾病靶點(diǎn)與二陳湯藥物作用靶點(diǎn)取交集，得到二陳湯作用于PMOP與肥胖癥的共同靶點(diǎn)，將共同靶點(diǎn)提交至STRING 11.0（https：//www.string-db.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，生物種類(lèi)選定“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設(shè)定為“highest confidence”（＞0.9），閾值越高，得到網(wǎng)絡(luò)的可信度越高，最后隱藏網(wǎng)絡(luò)中斷開(kāi)連接的節(jié)點(diǎn)，其余設(shè)置不變，得到蛋白互作（protein-protein interaction network，PPI）網(wǎng)絡(luò)。然后使用Cytoscape 3.8.1軟件中的CytoNCA插件對(duì)所得PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選核心靶點(diǎn)。計(jì)算PPI網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)的中介中心性（betweenness centrality，BC）、緊密中心性（closeness centrality，CC）、度中心性（degree centrality，DC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、局部邊連通性（local average connectivity-based method centrality，LAC）、網(wǎng)絡(luò)中心性（network centrality，NC）等六項(xiàng)拓?fù)鋮?shù)值，分析每個(gè)節(jié)點(diǎn)在PPI網(wǎng)絡(luò)中的重要性，取各項(xiàng)參數(shù)值均高于中位數(shù)值的節(jié)點(diǎn)，所得節(jié)點(diǎn)即為具有顯著意義的核心作用靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG富集分析 將二陳湯調(diào)節(jié)PMOP與肥胖癥的共同靶點(diǎn)輸入Metascape平臺(tái)，默認(rèn)P＜0.01，對(duì)其生物學(xué)過(guò)程與信號(hào)通路進(jìn)行聚類(lèi)富集分析，并將所得數(shù)據(jù)結(jié)果利用Hiplot（https：//hiplot.com.cn）平臺(tái)進(jìn)行可視化。

1.5 構(gòu)建中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò) 運(yùn)用Cytoscape 3.8.1軟件和Java代碼聯(lián)合分析構(gòu)建二陳湯藥物有效成分作用于PMOP和肥胖癥共同靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，即二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，從網(wǎng)絡(luò)中可以得到二陳湯作用于PMOP與肥胖癥共同的主要活性成分及作用靶點(diǎn)。

1.6 分子對(duì)接 使用Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)查找二陳湯主要活性成分的2D構(gòu)象，用ChemOffice 14.0.0.117軟件轉(zhuǎn)換為3D結(jié)構(gòu)并優(yōu)化其最小自由能，使用PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.rcsb.org/）查找疾病靶點(diǎn)蛋白，并運(yùn)用PyMOL 2.4.1軟件去除水分子和原有配體后加氫，然后將處理過(guò)的活性成分與靶點(diǎn)蛋白導(dǎo)入AutoDock 1.5.6，對(duì)接位點(diǎn)選擇以原有配體為中心，設(shè)置相應(yīng)的網(wǎng)格箱（gird box）參數(shù)，運(yùn)用Vina軟件進(jìn)行分子對(duì)接，對(duì)接結(jié)果可用PyMOL軟件打開(kāi)并查看圖像，一般認(rèn)為結(jié)合能＜-5.0 kcal/mol時(shí)，說(shuō)明活性成分與靶點(diǎn)蛋白具有較好的結(jié)合活性，而結(jié)合能＜-7.0 kcal/mol時(shí)具有強(qiáng)烈的結(jié)合活性［8］。

2 結(jié)果

2.1 PMOP與肥胖癥相關(guān)疾病靶點(diǎn)收集與整理結(jié)果 GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP相關(guān)靶點(diǎn)1 099個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)9 166個(gè)，經(jīng)過(guò)Relevance score值篩選后，得到PMOP相關(guān)靶點(diǎn)839個(gè)（Relevance score≥1）、肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)483個(gè)（Relevance score≥10）；OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP相關(guān)靶點(diǎn)10個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)28個(gè)；DRUGBANK數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP相關(guān)靶點(diǎn)101個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)63個(gè)；PharmGkb數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP相關(guān)靶點(diǎn)15個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)4個(gè)；TTD數(shù)據(jù)庫(kù)獲得PMOP相關(guān)靶點(diǎn)4個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)81個(gè)。將各數(shù)據(jù)庫(kù)PMOP和肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)取并集刪除重復(fù)值后，最終得到PMOP相關(guān)靶點(diǎn)918個(gè)，肥胖癥相關(guān)靶點(diǎn)563個(gè)。

2.2 二陳湯有效成分及作用靶點(diǎn)收集與整理結(jié)果 在TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)共篩得符合OB≥30%且DL≥0.18的半夏有效成分13個(gè)，靶點(diǎn)169個(gè)；陳皮有效成分5個(gè)，靶點(diǎn)95個(gè)；茯苓有效成分15個(gè)，靶點(diǎn)118個(gè)；甘草有效成分92個(gè)，靶點(diǎn)2506個(gè)，去重后共得到二陳湯有效成分107個(gè)，經(jīng)Uniprot蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)標(biāo)準(zhǔn)化并去重后最終得到作用靶點(diǎn)233個(gè)。

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及拓?fù)浞治鼋Y(jié)果 通過(guò)R 4.0.3軟件得到PMOP、肥胖癥與二陳湯共同靶點(diǎn)48個(gè)，利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，得到共同靶點(diǎn)的PPI蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，除去無(wú)相互作用的節(jié)點(diǎn)后，網(wǎng)絡(luò)共顯示45個(gè)節(jié)點(diǎn)，148條邊（圖1），節(jié)點(diǎn)代表蛋白質(zhì)，邊代表蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)關(guān)聯(lián)，邊的不同顏色表示蛋白質(zhì)之間相互作用證據(jù)的不同類(lèi)型。通過(guò)Cytoscape 3.8.1軟件中的CytoNCA插件對(duì)所得PPI網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，結(jié)果顯示BC、CC、DC、EC、LAC、NC六項(xiàng)拓?fù)鋮?shù)中位數(shù)值分別為18.069 230 6、0.686 167 945 5、25.5、0.159 415 334 5、19.268 065 265、21.716 469 98，其中拓?fù)鋮?shù)值均大于中位數(shù)值的核心靶點(diǎn)共有15個(gè)，見(jiàn)表1，即二陳湯調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的潛在核心靶點(diǎn)。

表1 PPI網(wǎng)絡(luò)拓?fù)浞治鰠?shù)

圖1 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO和KEGG富集分析結(jié)果 GO富集及聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，滿(mǎn)足條件的生物過(guò)程（biological processes，BP）共585條，根據(jù)功能相似性分為20類(lèi)，包括對(duì)脂多糖的反應(yīng)、對(duì)細(xì)胞外刺激的反應(yīng)、對(duì)無(wú)機(jī)物的反應(yīng)、細(xì)胞遷移的積極調(diào)控、細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、活性氧代謝的反應(yīng)、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌二醇的反應(yīng)等，其中細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌二醇的反應(yīng)與脂骨代謝具有明顯相關(guān)性；細(xì)胞成分（cellular components，CC）46條，根據(jù)功能相似性分為8類(lèi)，包括膜筏、囊腔、網(wǎng)格蛋白包膜囊泡膜、RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合物、小窩、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)腔、膜側(cè)和細(xì)胞器外膜等；分子功能（molecular function，MF）66條，根據(jù)功能相似性分為14類(lèi)，包括血紅素結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、受體-配體活性、磷酸酶結(jié)合、伯胺氧化酶活性等，見(jiàn)圖2。KEGG富集及聚類(lèi)分析結(jié)果顯示，滿(mǎn)足條件的信號(hào)通路共130條，根據(jù)功能相似性分為16類(lèi)，其中較為重要的通路包括AGERAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路以及卵巢類(lèi)固醇生成，見(jiàn)圖3。

圖2 GO富集分析圖

圖3 KEGG富集分析圖

2.5 中藥復(fù)方調(diào)控網(wǎng)絡(luò)結(jié)果分析 利用Cytoscape 3.8.1軟件構(gòu)建二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)并進(jìn)行分析，見(jiàn)圖4。調(diào)控網(wǎng)絡(luò)總共包括148個(gè)節(jié)點(diǎn)（100個(gè)藥物活性成分節(jié)點(diǎn)、48個(gè)蛋白靶點(diǎn)節(jié)點(diǎn)）和468條邊，節(jié)點(diǎn)越大說(shuō)明Degreed值越大，與之作用的活性成分越多，重要性越高，每條邊則表示有效成分與靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，Degreed≥60的蛋白靶點(diǎn)包括前列腺素內(nèi)酯合成酶2（PTGS2）、雌激素受體1（ESR1）、雄激素受體（AR）、過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ），見(jiàn)表2；Degreed≥10的活性成分包括槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、柚皮素（naringenin）以及刺芒柄花素（formononetin），見(jiàn)表3。

表2 二陳湯作用的主要靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

表3 二陳湯主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)

圖4 二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

2.6 分子對(duì)接驗(yàn)證結(jié)果 一般認(rèn)為結(jié)合構(gòu)象越穩(wěn)定耗能越低，發(fā)生的作用可能性越大，將關(guān)鍵靶點(diǎn)與槲皮素、山奈酚、柚皮素以及刺芒柄花素進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果顯示，17個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)結(jié)合能均小于-5.0 kcal/mol，說(shuō)明二陳湯中的主要活性成分與疾病關(guān)鍵靶點(diǎn)有較強(qiáng)的結(jié)合能力，見(jiàn)表4。其中PPARG、PTGS2不僅是二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的主要靶點(diǎn)，同時(shí)還是PPI拓?fù)浞治龅贸龅暮诵陌悬c(diǎn)，ESR1是多條顯著性較高的生物進(jìn)程與信號(hào)通路中的均含有的靶點(diǎn)基因，ESR1、PPARG、PTGS2與槲皮素、山奈酚、柚皮素以及刺芒柄花素的結(jié)合能力均＜-7.0 kcal/mol，見(jiàn)圖5。

圖5 ESR1、PTGS2、PPARG分子對(duì)接結(jié)果

表4 二陳湯主要活性成分與關(guān)鍵靶點(diǎn)的結(jié)合能分?jǐn)?shù)（kcal/mol）

3 討論

中醫(yī)理論認(rèn)為，脾與PMOP發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，李東垣《脾胃論·脾胃盛衰論》：“脾病……則骨乏無(wú)力……令人骨髓空虛，足不能履地。”脾為氣血生化之源，若脾失健運(yùn)則無(wú)以濡養(yǎng)腎精，以致腎之主骨生髓功能失常，進(jìn)而導(dǎo)致PMOP的發(fā)生［9］，脾失健運(yùn)還可導(dǎo)致氣血運(yùn)行不暢，水谷精微輸布失常，停聚日久而生痰濕，進(jìn)而釀成膏脂，泛溢肌腠而成肥胖［10］，二陳湯出自《太平惠民和劑局方》，陳皮理氣健脾，半夏化痰燥濕，茯苓健脾利濕，甘草補(bǔ)脾益氣、緩急止痛、調(diào)和諸藥，全方合用可益氣健脾、化痰利濕，痰消脾健則膏脂漸去、腎精得以濡養(yǎng)。二陳湯對(duì)脂代謝酶與脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的異常表達(dá)具有抑制作用，可改善脂肪因子的異常分泌，維持脂肪組織生理功能，減少脂質(zhì)異位沉積，降低高密度脂蛋白、甘油三酯等脂肪因子對(duì)骨髓和骨代謝的不利影響［7，11-12］，由此推測(cè)，二陳湯可通過(guò)抑制脂代謝異常而間接影響骨代謝，從而達(dá)到調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂、改善PMOP臨床癥狀的作用，但其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探索與證實(shí)。

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出二陳湯調(diào)治PMOP脂骨代謝紊亂的活性成分100個(gè)，其中槲皮素、山柰酚、柚皮素以及刺芒柄花素作用的疾病靶點(diǎn)最多，且對(duì)脂、骨代謝均有一定的調(diào)節(jié)作用，故推測(cè)槲皮素、山柰酚、柚皮素以及刺芒柄花素可能是二陳湯調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的主要活性成分。槲皮素可通過(guò)雌激素信號(hào)促進(jìn)RUNT相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2（RUNX2）、堿性磷酸酶（ALP）表達(dá)，抑制PPARγ（PPARG）、CCAAT增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α（C/EBPα）表達(dá)，從而促進(jìn)BMSCs的成骨分化，抑制其成脂分化，槲皮素還可促進(jìn)脂肪源性干細(xì)胞向成骨分化［13-14］。山奈酚能夠促進(jìn)RUNX2、成骨細(xì)胞特異性轉(zhuǎn)錄因子（OSX）的表達(dá)，誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞分化、提高骨密度［15］，并通過(guò)調(diào)節(jié)增強(qiáng)子結(jié)合蛋白α、脂肪甘油三酯脂酶、激素敏感性脂肪的表達(dá)水平減少脂肪細(xì)胞中的脂質(zhì)積累，調(diào)節(jié)其成脂分化［16］。柚皮素可通過(guò)抑制p38信號(hào)通路的表達(dá)進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的生成［17］，降低去卵巢大鼠的骨轉(zhuǎn)換率，保持骨礦密度，改善骨小梁結(jié)構(gòu)［18］，柚皮素還能夠降低血漿和脂肪中瘦素mRNA的表達(dá)水平，并下調(diào)脂肪組織中單核細(xì)胞趨化蛋白1（MCP1/CCl2）和白細(xì)胞介素-6（IL-6）mRNA的表達(dá)水平，減輕脂代謝紊亂［19］。刺芒柄花素可下調(diào)骨組織基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）、腫瘤壞死因子-α（TNFα）、IL-6 mRNA表達(dá)，同時(shí)上調(diào)磷酸化P38絲裂素活化蛋白激酶（P38MAPK）mRNA的表達(dá)，抑制破骨細(xì)胞骨吸收，增加骨密度［20］，還可作為PPARγ的激動(dòng)劑，促進(jìn)解偶聯(lián)蛋白1（UCP1）在脂肪細(xì)胞中的表達(dá)，通過(guò)調(diào)控白色脂肪細(xì)胞褐色化以調(diào)節(jié)脂代謝［21］。

已知女性絕經(jīng)后雌激素水平的下降是PMOP脂骨代謝紊亂的主要因素，且本文通過(guò)二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，ESR1的Degree值為79，是二陳湯活性成分作用的主要靶點(diǎn)之一，且在GO、KEGG富集分析結(jié)果顯示，顯著性較高的生物進(jìn)程與信號(hào)通路中，細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌二醇的反應(yīng)以及雌激素信號(hào)通路中均含有ESR1。雌激素與ESR1結(jié)合后，可促進(jìn)成骨細(xì)胞與免疫細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1，并上調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGFβ）的表達(dá)，從而抑制破骨細(xì)胞骨吸收活性，維持骨密度［22］，ESR1還可通過(guò)脂肪甘油三酯脂肪酶和圍脂滴蛋白調(diào)節(jié)脂滴大小從而調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝［23］。PPARG與PTGS2不僅是二陳湯調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的主要靶點(diǎn)，同時(shí)還是PPI網(wǎng)絡(luò)中的核心靶點(diǎn)，PPARγ是BMSCs成脂分化關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［24］，PPARγ表達(dá)增加及活性增強(qiáng)均可促進(jìn)BMSCs向成脂肪細(xì)胞分化，并抑制其向成骨細(xì)胞分化［25］。COX2（PTGS2）是前列腺素生物合成中的關(guān)鍵酶。COX2及其介導(dǎo)的前列腺素能夠促進(jìn)白色脂肪和米色脂肪褐變，以增加能量消耗，減少脂質(zhì)蓄積，改善脂代謝［26］。同時(shí)，感覺(jué)神經(jīng)或骨細(xì)胞中皆含有COX2介導(dǎo)的前列腺素E2（PGE2），PGE2可通過(guò)激活前列腺素受體4（EP4）抑制中樞神經(jīng)系統(tǒng)的交感活動(dòng)，從而促進(jìn)骨生成［27］。由此推測(cè)，ESR1、PPARG與PTGS2可能是二陳湯調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的關(guān)鍵核心靶點(diǎn)，分子對(duì)接結(jié)果亦顯示ESR1、PPARG、PTGS2與二陳湯主要活性成分具有較強(qiáng)的結(jié)合活性。

GO和KEGG富集分析結(jié)果提示二陳湯可通過(guò)多種與內(nèi)分泌、代謝以及免疫相關(guān)的生物進(jìn)程和信號(hào)通路對(duì)PMOP脂骨代謝紊亂起到調(diào)節(jié)作用，生物進(jìn)程主要包括細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)的反應(yīng)、類(lèi)固醇代謝過(guò)程、對(duì)雌二醇的反應(yīng)、活性氧代謝過(guò)程，信號(hào)通路主要包括AGE-RAGE信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路和卵巢類(lèi)固醇生成。RAGE是晚期糖基化終產(chǎn)物（AGEs）的受體，AGEs與RAGE相互作用后，可激活Caspase-3信號(hào)通路，誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生，抑制MAPK、ALP活性，促進(jìn)骨吸收［28］，AGEs還可抑制BMSCs增值，并通過(guò)Wnt/β-catenin信號(hào)通路抑制其向成骨分化［29］。ERα不僅可刺激骨細(xì)胞產(chǎn)生NO和PGE2，影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞的形成［30］，還可與雌二醇結(jié)合減小脂肪細(xì)胞的體積，迅速降低骨髓脂肪量［31］。IL-17A與TNF-α協(xié)同作用，可抑制Wnt信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs向成骨細(xì)胞分化以及成骨細(xì)胞礦化，亦可激活PEG2，從而抑制PPARγ、脂聯(lián)素等的表達(dá)以減少BMSCs向脂肪細(xì)胞分化［32-33］，故推測(cè)二陳湯可通過(guò)抑制AGE-RAGE信號(hào)通路或促進(jìn)IL-17信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路的表達(dá)，抑制BMSCs的成脂分化，從而促進(jìn)其成骨分化，達(dá)到調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，二陳湯含有的主要活性成分以及作用的多個(gè)核心靶點(diǎn)與通路可對(duì)BMSCs增殖分化產(chǎn)生影響，女性絕經(jīng)后BMSCs傾向于分化為脂肪細(xì)胞，其成骨分化以及骨形成受到明顯抑制，當(dāng)大量BMSCs分化為脂肪細(xì)胞時(shí)，成骨細(xì)胞的數(shù)量會(huì)相應(yīng)減少，導(dǎo)致PMOP的發(fā)生［34-35］。故推測(cè)二陳湯對(duì)BMSCs成脂分化具有抑制作用，從而在一定程度上提升成骨分化能力，恢復(fù)脂骨代謝平衡。

綜上所述，本文基于PMOM與肥胖癥相關(guān)的共同靶點(diǎn)基因，揭示了二陳湯通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路調(diào)節(jié)PMOP脂骨代謝紊亂的藥效機(jī)制，其作用機(jī)制可能是通過(guò)抑制BMSCs的成脂分化、減少脂質(zhì)的積累進(jìn)而緩解脂代謝紊亂對(duì)骨代謝產(chǎn)生的影響，從而延緩PMOP疾病發(fā)展進(jìn)程、改善PMOP臨床癥狀。但因本實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基于生物信息學(xué)方法，僅通過(guò)大量數(shù)據(jù)計(jì)算推測(cè)所得，有一定的局限性，故后續(xù)仍需通過(guò)動(dòng)物、細(xì)胞實(shí)驗(yàn)進(jìn)行進(jìn)一步探索與驗(yàn)證。