蓯蓉舒痙顆粒對帕金森病模型大鼠中腦線粒體氧化應激及自噬相關(guān)SIRT1/FoxO通路的影響

李茜羽，姚淑紅，陳小倩，陳詩雅，王 林，袁明洲，蔡 晶*

（1.福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院，福建 福州 350108；2.福建中醫(yī)藥大學中西醫(yī)結(jié)合學院，福建 福州 350122）

帕金森?。≒arkinson's disease，PD）是一種與衰老相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾?。?］。PD發(fā)病機制復雜，涉及α-突觸核蛋白積聚、神經(jīng)炎癥、氧化應激、線粒體功能障礙等多方面［1］。研究顯示，線粒體結(jié)構(gòu)與功能障礙是PD各致病因素分子機制的交匯點，過度氧化應激導致受損線粒體蓄積，而線粒體自噬異常無法將其清除，導致線粒體穩(wěn)態(tài)破壞，神經(jīng)元細胞受損，為近年研究熱點［2］。沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulator 1，SIRT1）為NAD+依賴性去乙酰化酶，通過調(diào)節(jié)叉頭蛋白O（forkhead box protein O，F(xiàn)oxO）調(diào)節(jié)氧化應激及自噬等病理、生理過程，在包括PD在內(nèi)的神經(jīng)退行性疾病中起到神經(jīng)保護作用［3-5］。課題組前期研究證實，蓯蓉舒痙顆粒對PD大鼠具有神經(jīng)保護作用［6-7］，但其保護機制是否與改善氧化應激、調(diào)節(jié)線粒體自噬相關(guān)，尚待研究。本實驗擬觀察蓯蓉舒痙顆粒對PD模型大鼠中腦線粒體氧化應激與自噬相關(guān)SIRT1/FoxO通路及相關(guān)指標的影響，為蓯蓉舒痙顆粒進一步研究提供實驗依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 27只SPF級健康雄性SD大鼠，7～8周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（浙）2019-0002，實驗動物使用許可證：SYXK（閩）2019-0007。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學實驗動物中心，溫度20～26℃（日溫差＜3℃），相對濕度40%～70%，光照/黑暗周期為12 h，飲水攝食自由。

1.2 實驗藥物 蓯蓉舒痙顆粒藥物組成：肉蓯蓉、制黃精、丹參、赤芍、牡丹皮，由福建中醫(yī)藥大學附屬第三人民醫(yī)院提供。蒸餾水溶化后濾過，制備溶液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 實驗試劑 魚藤酮、葵花油乳化液（美國Sigma公司，批號：R8875、S5007）；水合氯醛（天津市大茂化學試劑廠，批號：3710）；免疫組化試劑盒、DAB顯色試劑盒（福建邁新技術(shù)有限公司，批號：KIT-5220、KIT-9720）；ECL化學發(fā)光檢測試劑盒、BCA試劑盒、GAPDH抗體、HRP標記的山羊抗兔IgG（武漢塞維爾生物科技有限公司，批號：G2014、G2026、G12002、GB23303）；SIRT1抗體（美國Affinity公司，批號：DF6033）；FoxO1抗體、FoxO3a抗體（美國Immunoway公司，批號：YT1758、YT1763）；微管相關(guān)蛋白輕鏈3-Ⅰ（LC3-Ⅰ）、LC3-Ⅱ抗體（美國Proteintech公司，批號：18722-1-AP、18725-1-AP）；βactin抗體、TH抗體（武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，批號：10230-1-AP、25859-1-AP）。

1.4 實驗儀器 TS100倒置顯微鏡（日本尼康公司）；MDL光學顯微鏡、RM2235石蠟切片機（德國Leica公司）；BT-2電泳儀（武漢塞維爾生物科技有限公司）；PowerPac Basic轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad公司）；6300化學發(fā)光儀（CLINX公司）；RT-6100酶標儀（雷杜生命科學股份有限公司）；CytoFLEX流式細胞儀（美國Beckman Coulter公司）。

2 實驗方法

2.1 分組與造模 采用SPSS 24.0軟件隨機數(shù)字法將27只健康SD大鼠分為正常組9只、造模組18只。造模組大鼠按1.5 mg/（kg·d）予魚藤酮葵花油乳化液進行頸背部皮下注射，連續(xù)注射14 d建立PD模型；正常組大鼠未予干預。參照文獻［8］中行為學評分標準，得分2～8分即為造模成功。將造模成功SD大鼠隨機分為模型組和治療組，每組各9只。

2.2 干預與取材 蓯蓉舒痙顆粒中劑量人用量為13.07 g/（60 kg·d），按人-大鼠體質(zhì)量換算［9］，治療組按1.36 g/（kg·d）予蓯蓉舒痙顆粒溶液灌胃，正常組、模型組予等量生理鹽水灌胃，連續(xù)干預14 d。灌胃14 d后，每組各取3只大鼠進行灌注取腦；剩余大鼠全麻后快速斷頭，于冰面上迅速取出腦組織并分離中腦，保存于-80℃冰箱中備用。

2.3 觀察指標及方法

2.3.1 行為學檢測 分別于灌胃第1、7、14天對各組大鼠進行爬桿實驗：手持鼠尾，令其倒立于50 cm長的木桿頂端，木桿外纏有醫(yī)用膠布以增強摩擦，對小鼠下滑行為進行評分。具體評分標準：四肢并用，一次順利從桿上爬下計0分；一步一步螺旋向下爬，兼后肢滑行計0.5分；上桿后間歇停頓數(shù)次后爬下，但可抱緊金屬桿計1分；滑行后掉落計1.5分；不能抓桿，直接掉落計2分［10］。測3次取平均值，每次間隔5 min。若大鼠中途停止或反向爬行此次實驗無效，重新進行。

2.3.2 免疫組化法檢測大鼠中腦TH陽性細胞數(shù)

灌胃14 d后，各組取3只大鼠，用10%水合氯醛以3 mL/kg進行腹腔注射麻醉，麻醉后打開胸腔，灌注針插入左心室，剪開右心耳，灌注生理鹽水（4℃）沖洗血液，以肝臟變白為灌注成功，至右心房流出的液體變清亮時，再灌注4%多聚甲醛溶液，灌注完成后仔細分離取出中腦組織，置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，流水沖洗2 h，依次進行70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水、二甲苯透明、浸蠟、包埋切片。按試劑盒說明書對石蠟切片進行免疫組化染色，高倍鏡下觀察，以棕黃色或淡黃色顆粒染色為陽性表達，讀取TH陽性反應細胞數(shù)。

2.3.3 ELISA法檢測大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a水平 稱取保存于-80℃冰箱中各組大鼠中腦組織50 mg，按1∶9比例加入9倍體積生理鹽水，冰水浴條件下，機器勻漿，制備成10%勻漿液，2 500～3 000 r/min離心10 min，分別按照按SIRT1、FoxO1、FoxO3a試劑盒說明書進行操作。

2.3.4 Western blot法檢測大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a、LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達 取-80℃冰箱中各組大鼠中腦組織50 mg，BCA法測定蛋白水平。SDS-PAGE凝膠電泳，PVDF轉(zhuǎn)膜，脫脂奶粉室溫封閉，加入GAPDH（1∶1 000）、SIRT1（1∶500）、FoxO1（1∶500）、FoxO3a（1∶500）、β-actin（1∶1 000）、LC3-Ⅰ（1∶500）、LC3-Ⅱ（1∶500）一抗，4℃孵育過夜。經(jīng)PBS清洗后置于相應二抗（1∶3 000）室溫孵育1 h，ECL試劑盒顯影并成像，用Alpha軟件處理系統(tǒng)分析蛋白條帶灰度值，內(nèi)參為GAPDH、β-actin，相對表達水平為目標蛋白條帶灰度值/GAPDH或β-actin。

2.3.5 中腦活性氧（ROS）水平檢測 取-80℃冰箱中各組大鼠中腦組織50 mg，PBS清洗后儲存于預冷PBS（95%PBS＋5%FBS）中。在培養(yǎng)皿中將中腦組織切成若干小塊，用載玻片輕輕按壓組織，PBS反復沖洗；將培養(yǎng)皿中的組織液用70目篩網(wǎng)過濾，收集過濾液離心（1 000 r/min），后用5 mL PBS清洗，再離心（1 000 r/min），將所得沉淀重懸，制備中腦黑質(zhì)紋狀體單細胞懸液。將所得單細胞懸液分為陽性對照管、陰性對照管和樣品管。陽性對照管加1 mL DCFH-DA混合液＋1μL活性氧供氫體；陰性對照管加1 mL PBS；樣品管加1 mL DCFH-DA混合液，37℃避光孵育1 h，孵育完畢，離心（1 000 r/min）后棄上清，加400μL PBS重懸后，上機檢測。所得結(jié)果用flowjo-V10流式分析軟件進行ROS數(shù)據(jù)分析。

2.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 24.0軟件進行分析。對各組數(shù)據(jù)進行正態(tài)檢驗，用（±s）表示符合正態(tài)分布的計量資料，多組間比較進行單因素方差分析，行為學數(shù)據(jù)采用多變量方差分析；組間兩兩比較，方差齊采用LSD法，方差不齊則采用Game's Howell法。檢驗水準α＝0.05。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠爬桿實驗評分比較 與正常組比較，模型組大鼠灌胃第1、7、14天爬桿實驗評分顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，治療組大鼠灌胃第14天爬桿實驗評分顯著降低（P＜0.01）。見表1。

表1 3組大鼠爬桿實驗評分比較（±s） 分

表1 3組大鼠爬桿實驗評分比較（±s） 分

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常組模型組治療組n999灌胃第1天0.00±0.00 1.33±0.261）1.17±0.451）灌胃第7天0.00±0.00 1.72±0.431）1.22±0.691）灌胃第14天0.00±0.00 2.00±0.001）0.61±0.562）

3.2 3組大鼠中腦TH陽性細胞數(shù)比較 顯微鏡下觀察，模型組TH陽性細胞數(shù)較正常組減少，治療組TH陽性細胞數(shù)較模型組增多，見圖1。與正常組比較，模型組中腦TH陽性細胞數(shù)顯著降低（P＜0.01）；與模型組比較，治療組中腦TH陽性細胞數(shù)明顯增多（P＜0.05），見表2。

表2 3組大鼠中腦TH陽性細胞數(shù)比較（±s） 個

表2 3組大鼠中腦TH陽性細胞數(shù)比較（±s） 個

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常組模型組治療組n333 TH陽性細胞數(shù)60.00±11.12 22.67±3.061）45.00±8.542）

圖1 3組大鼠中腦TH免疫組化圖（×400）

3.3 3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a表達比較 ELISA及W estern blot檢測結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a含量顯著降低（P＜0.01）。與模型組比較，治療組中腦SIRT1、FoxO3a、FoxO1表達升高（P＜0.05，P＜0.01）。見表3～4及圖2。

表3 ELISA法檢測3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a表達比較（n=3，±s）

表3 ELISA法檢測3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a表達比較（n=3，±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

組別正常組模型組治療組SIRT1 0.69±0.04 0.43±0.041）0.56±0.053）FoxO1 0.75±0.02 0.36±0.031）0.53±0.042）FoxO3a 0.90±0.07 0.41±0.021）0.64±0.103）

表4 W estern blot法檢測3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白表達比較（±s）

表4 W estern blot法檢測3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01，3）P＜0.05。

組別正常組模型組治療組SIRT1 1.23±0.12 0.61±0.071）0.92±0.143）FoxO1 1.16±0.07 0.23±0.031）0.82±0.082）FoxO3a 1.73±0.13 0.45±0.031）0.75±0.043）

圖2 3組大鼠中腦SIRT1、FoxO1、FoxO3a蛋白電泳圖

3.4 3組大鼠中腦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達比較 與正常組比較，模型組中腦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達均減少（P＜0.05，P＜0.01）；與模型組比較，治療組中腦LC3-Ⅱ蛋白表達均升高（P＜0.05），見圖3及表5。

圖3 3組大鼠中腦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白電泳圖

表5 3組大鼠中腦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達比較（±s）

表5 3組大鼠中腦LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ蛋白表達比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01，2）P＜0.05；與模型組比較，3）P＜0.05。

組別正常組模型組治療組LC3-Ⅰ0.79±0.08 0.58±0.012）0.70±0.10 LC3-Ⅱ0.82±0.01 0.53±0.071）0.67±0.033）LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ1.04±0.13 0.91±0.10 0.97±0.12

3.5 3組大鼠中腦ROS水平比較 與正常組比較，模型組的細胞ROS水平顯著增加（P＜0.01）；與模型組比較，治療組的細胞ROS水平顯著降低（P＜0.01）。結(jié)果表明，蓯蓉舒痙顆?？山档蚉D大鼠氧化應激水平，見表6及圖4。

圖4 3組大鼠中腦ROS流式細胞圖

表6 3組大鼠中腦ROS水平比較（±s）

表6 3組大鼠中腦ROS水平比較（±s）

注：與正常組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01。

組別正常組模型組治療組n333 ROS 75 935.33±1 367.74 195 866.33±7 381.451）170 912.67±3 036.592）

4 討論

氧化應激致使胞內(nèi)高水平活性氧產(chǎn)生，直接損害線粒體DNA（mitoc-hondrial DNA，mtDNA），導致線粒體受損及功能障礙。線粒體自噬障礙導致?lián)p傷的線粒體堆積，線粒體質(zhì)量下降、線粒體穩(wěn)態(tài)失衡，亦可導致ROS增加，發(fā)生惡性循環(huán)，與PD發(fā)病相關(guān)［11-15］。

中藥可以通過促進線粒體自噬、改善氧化應激水平起到神經(jīng)保護作用，在預防PD方面有較好的應用前景［16-17］。中醫(yī)理論認為，PD發(fā)病屬本虛標實，肝腎虧損為本，風、火、痰、瘀為標。腎精虧虛，不能上充于腦，腦髓失養(yǎng)；肝腎不足，虛風內(nèi)動；PD病久，瘀血阻絡(luò)。故而，腎虛血瘀是PD最根本的病理基礎(chǔ)，應以補腎活血為其治療法則［18-20］。本研究干預手段為補腎活血中藥蓯蓉舒痙顆粒，方中君藥肉蓯蓉，具有補腎陽、益精血的作用；臣藥制黃精滋陰補腎，與肉蓯蓉配伍具陰陽雙補之功；丹參、赤芍、牡丹皮清熱涼血、活血散瘀。諸藥配伍共奏補腎填精、益髓健腦、活血涼肝之功效。結(jié)果顯示其改善PD大鼠行為學障礙、提高中腦TH陽性細胞數(shù)量，提示出蓯蓉舒痙顆粒對中腦神經(jīng)元細胞具有一定的保護作用。

ROS累積與氧化應激損傷相關(guān)［21］；LC3是自噬中重要標記蛋白，LC3-Ⅱ是由LC3-Ⅰ通過泛素樣反應后與磷脂酰乙醇胺耦聯(lián)而生成，其表達的高低與自噬水平正相關(guān)［22］。本研究實驗結(jié)果顯示，在PD大鼠模型中存在ROS水平升高，LC3-Ⅱ及LC3-Ⅰ表達降低，經(jīng)干預后ROS水平降低、LC3-Ⅱ表達升高，證實氧化應激、線粒體自噬障礙參與了PD的發(fā)病，蓯蓉舒痙顆?？赏ㄟ^改善PD大鼠氧化應激、增加線粒體自噬起到神經(jīng)元保護作用。

SIRT1/FoxO1、SIRT1/FoxO3a通路在PD氧化應激及自噬調(diào)節(jié)中具有重要作用［4］。中國的一個橫斷面研究顯示，PD患者血清SIRT1水平降低［23］。基礎(chǔ)研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1激活劑顯著降低線粒體氧化應激和mtDNA損傷，其通過去乙?；せ頕oxO1、FoxO3a參與線粒體氧化應激和mtDNA損傷修復，同時SIRT1過表達糾正了自噬缺陷［4-5］，減少α-突觸核蛋白的形成，在帕金森病中起到神經(jīng)保護作用［24］。本研究中，模型組SIRT1、FoxO1、FoxO3a水平降低，治療組模型組SIRT1、FoxO1、FoxO3a水平升高，說明蓯蓉舒痙顆粒改善PD大鼠氧化應激、增加線粒體自噬的作用可能與SIRT1/FoxO通路相關(guān)。

綜上，蓯蓉舒痙顆粒神經(jīng)保護作用可能是通過促進SIRT1/FoxO1、SIRT1/FoxO3a、LC3-Ⅱ、LC3-Ⅰ表達，降低ROS水平，抑制氧化應激與激活自噬來實現(xiàn)的。本研究缺乏不同劑量蓯蓉舒痙顆粒的選擇驗證，未將治療效果與劑量關(guān)系展現(xiàn)出來。今后將進一步探討蓯蓉舒痙顆粒調(diào)控線粒體氧化應激與自噬的具體機制，以期為蓯蓉舒痙顆粒的臨床應用提供更多實驗參考。