厭氧處理對(duì)不同類型茶葉的氨基酸組成及生物活性的影響

楊高中，彭群華，張悅，施江，林智*，呂海鵬*

厭氧處理對(duì)不同類型茶葉的氨基酸組成及生物活性的影響

楊高中1,2，彭群華1，張悅1，施江1，林智1*，呂海鵬1*

1. 農(nóng)業(yè)部茶樹(shù)生物學(xué)與資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院，北京 100081

采用經(jīng)厭氧處理7?h后的同一批茶鮮葉原料，根據(jù)不同加工工藝分別制備成綠茶、白茶、烏龍茶、紅茶和黑毛茶，分析其氨基酸組成和含量變化、以及其對(duì)血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）抑制活性和抗氧化活性（包括細(xì)胞抗氧化能力以及1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基清除能力、2,2'-聯(lián)氮-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）陽(yáng)離子自由基清除能力、超氧陰離子自由基吸收能力和鐵離子還原能力等體外抗氧化活性）。結(jié)果表明，鮮葉經(jīng)厭氧處理后加工而成的不同類型茶葉中的游離氨基酸組成和含量發(fā)生了明顯變化，-氨基丁酸（-Aminobutyric acid，GABA）含量顯著提高，其中綠茶中的GABA含量最高（2.21?mg·g-1），烏龍茶次之（2.19?mg·g-1），紅茶最低（0.86?mg·g-1）；綠茶和黑毛茶對(duì)ACE的抑制率最強(qiáng)，分別為35.7%和37.2%，而紅茶對(duì)ACE的抑制活性最弱，抑制率為23.8%；此外，研究發(fā)現(xiàn)，相同茶鮮葉原料經(jīng)厭氧處理后加工而成的不同類型茶葉中，綠茶的抗氧化活性最強(qiáng)。

茶；-氨基丁酸；加工工藝；血管緊張素轉(zhuǎn)化酶；抗氧化活性

據(jù)報(bào)道，2018年我國(guó)心血管患病率及死亡率仍持續(xù)攀升，占據(jù)城鄉(xiāng)居民疾病死亡構(gòu)成比例中的首位，推算現(xiàn)高血壓疾病患者人數(shù)有2.45億，占心血管病患3.30億人的74.2%[1]。科學(xué)研究表明，血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（Angiotensin converting enzyme，ACE）在調(diào)節(jié)血壓中起重要作用[2]，抑制ACE活性是治療高血壓的一種重要手段[3]。在腎素血管緊張素系統(tǒng)中，ACE從C-末端裂解血管緊張素Ⅰ的二肽（組氨酸、亮氨酸）部分，產(chǎn)生具有強(qiáng)升壓活性的血管緊張素Ⅱ。血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)醛固酮的釋放，使腎臟中鈉離子濃度升高，促進(jìn)血管收縮和血壓升高。在激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)中，ACE促使具有舒壓活性的緩激肽轉(zhuǎn)化為無(wú)舒壓活性的失落片段，因而導(dǎo)致血壓升高。因此，通過(guò)抑制ACE活性可以起到抗高血壓作用[4]。目前有大量文獻(xiàn)報(bào)道了-氨基丁酸（-Aminobutyric acid，GABA）在動(dòng)物和人體的大腦、精神疾病、免疫系統(tǒng)、心血管疾病、防癌抗癌等方面的生理功能[5]，尤其在血壓調(diào)節(jié)方面效果顯著[6]，其降血壓功能主要是通過(guò)抑制ACE活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的[7]?，F(xiàn)已證實(shí)富含GABA食品能顯著降低血壓[8-9]，因此，開(kāi)發(fā)具有安全無(wú)副作用的降血壓功能成分的食品受到廣泛關(guān)注。

GABA是一種四碳非蛋白質(zhì)氨基酸，廣泛存在于微生物、植物、動(dòng)物中[10]。富含GABA的茶葉最早由日本學(xué)者報(bào)道，研究人員發(fā)現(xiàn)茶樹(shù)鮮葉經(jīng)過(guò)厭氧處理后能夠顯著提高茶葉中GABA的含量，并將干茶中GABA含量高于1.5?mg·g-1的茶葉稱為GABA茶，亦稱“Gabaron tea”[11]。GABA茶的制做方法主要可通過(guò)適制品種的選育[12]，以及加工過(guò)程中厭氧處理[13-14]、厭氧好氧交替處理[15-16]、葉面噴施氨基酸[17]等方式實(shí)現(xiàn)，其中以厭氧處理效果最佳，在盡可能減少對(duì)干茶風(fēng)味影響的同時(shí)顯著提高了成品茶葉中GABA的含量。

采用傳統(tǒng)工藝制成的不同茶類中GABA含量（0.016~0.45?mg·g-1）存在一定差異，但均顯著低于富含GABA茶[18]。Wang等[19]以綠茶為對(duì)照，比較了臺(tái)灣當(dāng)?shù)夭煌贩N、季節(jié)及產(chǎn)地的富含GABA茶中生物活性成分，發(fā)現(xiàn)主要差異為GABA、谷氨酸、總兒茶素含量等方面。然而，目前厭氧處理對(duì)不同類型茶葉的血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制活性和抗氧化活性的影響尚無(wú)系統(tǒng)報(bào)道，不利于人們對(duì)GABA茶保健功效的深入認(rèn)知。因此，本研究采用同一批次茶鮮葉原料，經(jīng)厭氧處理后采用不同加工工藝分別制成不同類型茶葉，分析其氨基酸組成及含量變化規(guī)律，并測(cè)定其體外ACE抑制活性和抗氧化活性，以期查明加工工藝對(duì)不同類型茶葉的氨基酸組成及含量、ACE抑制活性和抗氧化活性的影響，為GABA茶的研發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品制備方法

（1）莖梗和不同葉位茶葉樣品制備。中茶108茶樹(shù)鮮葉，按照一芽五葉采摘標(biāo)準(zhǔn)，放置于真空密封袋中，采用抽真空封口機(jī)抽真空密封；厭氧處理7?h后，分別按照莖梗、單芽、第一葉、第二葉、第三葉、第四葉以及第五葉的分離標(biāo)準(zhǔn)，制備、收集樣品，微波固樣后備用。

（2）不同類型茶葉樣品制備。中茶108茶樹(shù)鮮葉，按照一芽五葉采摘標(biāo)準(zhǔn)，放置于真空密封袋中，采用抽真空封口機(jī)抽真空密封；厭氧處理7?h后，按照不同加工工藝分別制成綠茶、黑毛茶、紅茶、烏龍茶和白茶等樣品備用；其中，黑毛茶的加工工藝為鮮葉經(jīng)殺青和揉捻后，再渥堆10?h，然后進(jìn)行日光曬干。

1.1.2 主要試劑

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、硼酸、-谷氨酸、2,2'-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑-6-磺酸)[2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS]、2,4,6-三(2-吡啶基)三嗪（Tripyridy-triazine，TPTZ）、2,2'-偶氮二(2-脒基丙烷)二鹽酸鹽、羥基乙酯呱嗪乙烷硫酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；甲巰丙脯氨酸（Captopril）購(gòu)自北京華威銳科化工有限公司；血管緊張素轉(zhuǎn)換酶試劑盒（FAPGG，比色法連續(xù)測(cè)定）購(gòu)自南京建成生物工程研究所；-氨基丁酸購(gòu)自Alfa Aesar公司；磷酸鹽緩沖液（pH 7.4）、Hank's平衡鹽溶液、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；青霉素-鏈霉素溶液購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；2',7'-二氯熒光黃雙乙酸鹽（DCFH-DA）、人肝癌細(xì)胞系Hep G2購(gòu)自北京嘉美生物技術(shù)有限公司；甲硫氨酸、核黃素、乙二胺四乙酸二鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；硫酸亞鐵、三氯化鐵、過(guò)硫酸鉀、無(wú)水乙醇均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

AB107-S電子天平（瑞士Mettler Toledo公司），UV-2550紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（日本Shimadzu公司），S-433D氨基酸分析儀（德國(guó)SYKAM公司），Varioskan Flash酶標(biāo)儀、Hepa Class 100二氧化碳培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo公司）。

1.3 方法

1.3.1 氨基酸檢測(cè)分析

氨基酸檢測(cè)分析委托農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全監(jiān)督檢測(cè)中心開(kāi)展。

1.3.2 ACE抑制活性分析

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（ACE）來(lái)源于新鮮豬肺[20]（市場(chǎng)購(gòu)買），20?g切碎的豬肺加入到0.1?mol·L-1硼酸緩沖液（pH為8.3，含0.3?mol·L-1NaCl）100?mL，勻漿機(jī)勻漿15?min，8?000?r·min-1離心20?min。上清液用緩沖溶液稀釋至ACE酶活為66.7?U·L-1，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

酶活性測(cè)定：400?μL的ACE溶液與100?μL水混合，然后取125?μL混合液，加入到1?mL血管緊張素轉(zhuǎn)換酶試劑盒（FAPGG）反應(yīng)液中，37℃下水浴30?min，然后用0.5?cm比色皿，以蒸餾水為空白，340?nm下測(cè)定水浴前后吸光度的變化。

按照試劑盒和文獻(xiàn)[21-22]公式計(jì)算酶活性：

式中，反應(yīng)液為1.125?mL；酶液為0.125?mL；為比色皿光程：0.5?cm；Δ：340?nm下1?mmol·L-1的FAPGG水解成FAP和GG吸光值的變化，本試驗(yàn)為0.989；Δ測(cè)定為30?min內(nèi)待測(cè)樣品水浴前后吸光度的變化平均值；Δ空白為30?min內(nèi)空白樣品水浴前后吸光度的變化平均值。

酶活性抑制率測(cè)定：參照文獻(xiàn)[21,23]并對(duì)該方法進(jìn)行改進(jìn)，測(cè)定不同類型茶葉樣品對(duì)ACE的抑制能力。100?mg茶粉加入5?mL沸水沖泡5?min，茶湯過(guò)0.22?μm膜得到濾液。100?μL濾液分別與400?μL ACE溶液和100?μL水混合，然后根據(jù)上述操作進(jìn)行試驗(yàn)。酶活抑制率按照如下公式計(jì)算：

式中，剩余ACE活性為ACE抑制劑存在時(shí)的ACE活性，總ACE活性為未添加濾液的ACE活性。

>1.3.3 體外抗氧化活性分析

（1）細(xì)胞抗氧化活性（Cellular antioxidant activity，CAA）測(cè)定參照Wolfe等[24]方法。茶浸提液EC50值以1?mL茶浸提液中所含干物質(zhì)含量表示，mg·mL-1；茶浸提液的CAA值以每100?mg茶葉干物質(zhì)相當(dāng)于1?μmol槲皮素（QE）表示，μmol·(100?mg)-1。

（2）清除DPPH自由基活性：參照楊冬梅等[25]的方法，以無(wú)水乙醇溶液代替樣品溶液作對(duì)照，按如下公式計(jì)算茶湯對(duì)DPPH自由基的清除率。

式中：1為空白對(duì)照的吸光度，2為樣品吸光度。

（3）清除ABTS自由基活性：參照李楠等[26]的方法，以超純水代替樣品作為空白對(duì)照。按如下公式計(jì)算茶湯對(duì)ABTS自由基的清除率。

式中：A為空白對(duì)照的吸光度，A為樣品吸光度。

（4）清除超氧陰離子（O2-）自由基活性：參照蔡萌等[27]的方法，按如下公式計(jì)算茶湯對(duì)O2-自由基清除率。

式中：0為避光30?min后反應(yīng)體系的本底吸光度，1為反應(yīng)體系光照后30?min后的吸光度，2為以水代替測(cè)定液反應(yīng)體系光照后30?min后的吸光度。

（5）鐵離子還原能力（Ferric ion reducing antioxidant power，F(xiàn)RAP)：參照張華等[28]的方法。以1.0?mmol·L-1FeSO4為標(biāo)準(zhǔn)，樣品總抗氧化能力（FRAP值）以達(dá)到同樣吸光度所需的FeSO4的毫摩爾數(shù)表示。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0數(shù)據(jù)處理軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，并采用GraphPad prism 9繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 厭氧處理前后原料中氨基酸組成及含量分析

厭氧處理前后一芽五葉鮮葉不同的葉位及莖梗中氨基酸組成及含量分析如表1所示。可見(jiàn)，經(jīng)厭氧處理后不同葉位鮮葉中的GABA含量均有所增加，其中增幅較大的為第一葉（由0.40?mg·g-1增加至2.47?mg·g-1）和第二葉（由0.42?mg·g-1增加至2.23?mg·g-1），增幅接近6倍；而第三、四、五葉增幅較小，厭氧處理后GABA含量分別為0.71、1.21、0.96?mg·g-1。GABA是植物中響應(yīng)逆境脅迫的重要調(diào)節(jié)物質(zhì)[29]，逆境條件下，茶樹(shù)鮮葉中GABA的合成途徑包括GABA旁路（GABA shunt）和多胺降解支路（Polyamine degradation pathways），在GABA旁路中，谷氨酸經(jīng)谷氨酸脫羧酶（Glutamate decarboxylase，GAD）催化脫羧形成GABA是主要的合成途徑。在多胺降解支路中，腐胺和亞精胺分別在二胺氧化酶、多胺氧化酶的催化下形成GABA[30]。以往研究表明，厭氧處理導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)pH值下降，激活了GAD的活性，催化谷氨酸脫羧形成GABA[31]。不同葉位厭氧處理后GABA含量呈現(xiàn)較大差異可能是由于GABA合成前體物質(zhì)谷氨酸含量和GAD活性的差異所導(dǎo)致。

此外，研究發(fā)現(xiàn)莖梗經(jīng)厭氧處理后其GABA含量顯著提升（1.52?mg·g-1），增幅達(dá)3倍，說(shuō)明莖梗對(duì)GABA茶的制做有重要價(jià)值。莖梗中存在高含量GABA的可能原因是，莖梗中茶氨酸、谷氨酸等前體物質(zhì)在茶氨酸水解酶和GAD的催化作用下部分轉(zhuǎn)化為GABA[32]。本研究中，厭氧處理后莖梗中茶氨酸含量由23.44?mg·g-1減少至15.60?mg·g-1，谷氨酸含量由0.42?mg·g-1減少至0.22?mg·g-1，說(shuō)明厭氧處理過(guò)程中可能存在這種轉(zhuǎn)化。值得注意的是，厭氧處理后第三、四、五葉中的GABA含量均低于1.5?mg·g-1，但以一芽五葉為原料加工成的綠茶、烏龍茶和黑毛茶中GABA含量均超過(guò)1.5?mg·g-1（表2），說(shuō)明可以選用成熟度更高的茶鮮葉為原料（例如采摘標(biāo)準(zhǔn)為一芽五葉的茶鮮葉）加工成高GABA茶，從而提高茶樹(shù)資源的利用率。

經(jīng)厭氧處理后，茶鮮葉中的氨基酸總量總體呈下降趨勢(shì)（其中第一、二葉含量增加），其他氨基酸如天冬氨酸、茶氨酸、谷氨酸經(jīng)厭氧處理后含量均呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，而亮氨酸、酪氨酸含量增加，這與以往的研究結(jié)果相符[33]。

2.2 厭氧處理后茶葉中氨基酸組成及含量分析

根據(jù)加工工藝的不同，茶葉一般可以分為綠茶、白茶、黃茶、烏龍茶、紅茶、黑茶六類。不同的加工工藝對(duì)茶葉中的化學(xué)成分具有重要影響。鮮葉經(jīng)厭氧處理后加工而成的不同類型茶葉中氨基酸組成及含量如表2所示。由表2可知，經(jīng)厭氧處理后，茶葉中的GABA含量明顯上升，其中采用綠茶、烏龍茶工藝制成的茶葉中GABA含量最高（分別為2.21?mg·g-1和2.19?mg·g-1），其次為黑毛茶（1.79?mg·g-1），而白茶和紅茶中GABA含量最低（分別為1.08?mg·g-1和0.86?mg·g-1）。作為對(duì)照處理的綠茶中GABA含量?jī)H為0.17?mg·g-1，可見(jiàn)經(jīng)厭氧處理后的鮮葉采用綠茶或?yàn)觚埐璧募庸すに嚳墒蛊銰ABA含量大幅提升。厭氧處理后的茶鮮葉制備成不同類型茶葉中GABA含量差異較大，其中白茶和紅茶中GABA含量較低。GABA的降解途徑主要為在GABA轉(zhuǎn)氨酶的催化下可逆轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，隨后琥珀酸半醛脫氫轉(zhuǎn)化為琥珀酸進(jìn)入三羧酸循環(huán)[30]。在缺氧處理?xiàng)l件下，三羧酸循環(huán)受到抑制，琥珀酸和琥珀酸半醛含量增加，GABA轉(zhuǎn)氨酶在產(chǎn)物負(fù)反饋調(diào)節(jié)下受到抑制，同時(shí)GABA旁路中谷氨酸在GAD催化下轉(zhuǎn)化為GABA，進(jìn)而導(dǎo)致了GABA的大量積累[34]。在白茶的萎凋和紅茶的揉捻發(fā)酵過(guò)程中，葉片處于有氧環(huán)境下，三羧酸循環(huán)加強(qiáng)可能導(dǎo)致琥珀酸被消耗，因而GABA在轉(zhuǎn)氨酶的作用下轉(zhuǎn)化為琥珀酸半醛，再脫氫后進(jìn)入三羧酸循環(huán)進(jìn)一步降解，所以GABA含量較低。而綠茶、烏龍茶、黑毛茶的加工工藝中都有殺青步驟，高溫條件下能使葉片大部分酶失活，因此，GABA能得到較好的保留。

表1 茶鮮葉厭氧處理前后氨基酸組成及含量分析

注：“/”表明化合物未檢測(cè)到，下同

Note: “/” indicates that the compound was not detected, and the same below

表2 不同類型茶葉中氨基酸組成及含量分析

由表2可知，不同類型茶葉中氨基酸組成及含量差異較大，其中天冬氨酸、谷氨酸和GABA含量存在較大差異。厭氧處理后不同加工工藝制備的茶葉中，綠茶和黑毛茶的氨基酸總量最高分別為27.60?mg·g-1和25.16?mg·g-1，紅茶最低為16.77?mg·g-1。研究表明，在紅茶發(fā)酵工序中，發(fā)酵葉中各類氨基酸在酶的催化作用下發(fā)生轉(zhuǎn)化，且氨基酸總量呈下降趨勢(shì)[35]。此外，以紅茶和白茶工藝制成的茶葉中茶氨酸含量分別為7.82?mg·g-1、7.46?mg·g-1，遠(yuǎn)低于綠茶、烏龍茶和黑毛茶，表明在發(fā)酵和持續(xù)萎凋過(guò)程中茶氨酸有可能被水解轉(zhuǎn)化為其他氨基酸。

2.3 不同類型茶葉對(duì)ACE的抑制活性分析

厭氧處理后不同類型茶葉樣品對(duì)ACE的抑制活性如圖1所示。從圖1可見(jiàn)，綠茶和黑毛茶對(duì)ACE的抑制率較高（分別為35.7%和37.2%），與對(duì)照組10.38?nmol·L-1卡托普利（Captopril）相比無(wú)顯著差異，白茶次之（31.9%），紅茶的抑制活性最弱（23.8%）。統(tǒng)計(jì)分析表明，綠茶和黑毛茶對(duì)ACE的抑制活性顯著強(qiáng)于烏龍茶和紅茶（<0.05），而綠茶和黑毛茶之間無(wú)顯著性差異；此外，紅茶的抑制活性顯著低于其他4種茶葉樣品。由此可知，鮮葉經(jīng)厭氧處理后，采用綠茶或黑毛茶的加工工藝制成的茶葉對(duì)ACE的抑制活性較強(qiáng)，因而推斷綠茶和黑毛茶可能具有較好的降血壓功效。以往的研究表明，茶葉中的GABA成分具有ACE抑制活性[7]，然而，本研究中的烏龍茶中GABA含量比黑毛茶更高（分別為2.19?mg·g-1和1.79?mg·g-1），但烏龍茶的ACE抑制活性卻顯著低于黑毛茶，表明茶葉中還存在其他活性成分能抑制ACE的活性。Dong等[36]證實(shí)了綠茶多酚提取液能直接鈍化ACE活性，并研究了不同品種、產(chǎn)地、季節(jié)的鮮葉原料制成的5種茶類對(duì)體外ACE活性抑制強(qiáng)度順序?yàn)椋壕G茶>烏龍茶>白茶>紅茶>黑茶，這與本研究結(jié)果相類似。不同類型茶提取物中的茶多酚含量差異顯著，茶葉加工過(guò)程中的殺青工藝能鈍化過(guò)氧化氫酶、多酚氧化酶、過(guò)氧化氫酶等酶活性，阻止了鮮葉中多酚類化合物氧化聚合，因而綠茶、黑毛茶、烏龍茶中保留較高含量?jī)翰杷?、黃酮醇類等多酚類化合物[37-38]。本研究中紅茶對(duì)ACE的抑制活性最低，可能與紅茶加工過(guò)程中多酚類成分氧化聚合有關(guān)，例如茶多酚類氧化聚合形成茶黃素和茶紅素等。

注：字母不同表示差異性顯著（P<0.05）

2.4 不同類型茶葉的體外抗氧化活性分析

采用CAA法測(cè)定不同類型茶葉的細(xì)胞抗氧化活性，結(jié)果如表3所示。EC50值是指該物質(zhì)抗Hep G2細(xì)胞增殖的半數(shù)有效濃度，EC50值越小，表明該物質(zhì)的抗增殖活性越強(qiáng)。CAA值反映了該物質(zhì)的細(xì)胞抗氧化活性強(qiáng)弱，CAA值越大，細(xì)胞抗氧化活性越強(qiáng)[39]?？梢?jiàn)，在本研究中不同樣品CAA法測(cè)定的抗氧化活性強(qiáng)弱順序?yàn)椋壕G茶>黑毛茶>紅茶>白茶>烏龍茶。統(tǒng)計(jì)分析表明，不同茶類之間均存在顯著性差異。綠茶的EC50值最低，為14.09?mg·mL-1，CAA值最高，達(dá)34.06?μmol·(100?mg)-1，表明與其他樣品相比，綠茶具有最強(qiáng)的抗增殖活性和細(xì)胞抗氧化活性。此外，研究發(fā)現(xiàn)烏龍茶的EC50值最高，達(dá)24.25?mg·mL-1，CAA值最低，為21.07?μmol·(100?mg)-1，即抗增殖活性和細(xì)胞抗氧化活性最弱。CAA法以人體肝癌細(xì)胞Hep G2為試驗(yàn)?zāi)Ｐ?，觀察抗氧化物質(zhì)在細(xì)胞中的反應(yīng)情況，如抗氧化成分在細(xì)胞內(nèi)的生物利用率、吸收和代謝情況，較傳統(tǒng)的化學(xué)抗氧化活性測(cè)定法更具有生物相關(guān)性[24,39]。在以往研究中，陳挺強(qiáng)等[40]采用CAA法對(duì)綠茶和紅茶水浸提液的細(xì)胞抗氧化能力進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)綠茶和紅茶的CAA值分別為26.23?μmol·(100?mg)-1和16.41?μmol·(100?mg)-1，說(shuō)明相比于紅茶，綠茶具有更強(qiáng)的細(xì)胞抗氧化活性，這與本研究結(jié)果類似。眾所周知，一般輕發(fā)酵的烏龍茶中茶多酚含量要高于全發(fā)酵的紅茶，然而本研究中的烏龍茶浸提液的細(xì)胞抗氧化活性最弱，推測(cè)茶葉中的細(xì)胞抗氧化活性可能還受到除茶多酚以外的其他成分的影響。

不同類型茶葉的體外抗氧化活性分析結(jié)果見(jiàn)表4所示。半抑制濃度（IC50）指清除一半自由基時(shí)抗氧化劑的濃度，IC50數(shù)值越小，表明樣品的抗氧化活性越強(qiáng)。從表4可以看出，綠茶清除DPPH、ABTS、O2-3種自由基的IC50值均小于其他樣品，分別為0.129、0.228、0.119?mg·mL-1，表明本研究中綠茶的體外抗氧化活性最強(qiáng)。然而，統(tǒng)計(jì)分析表明，綠茶、黑毛茶、烏龍茶及白茶這四類茶葉對(duì)上述3種自由基的清除能力并無(wú)顯著性差異。另外，紅茶的3種體外抗氧化活性的IC50值均為最大，分別為0.384、0.779、0.495?mg·mL-1，表明本研究中紅茶的抗氧化活性最弱，且與綠茶、黑毛茶之間均存在顯著差異，但與白茶之間無(wú)顯著差異。此外，F(xiàn)RAP法通過(guò)測(cè)定樣品對(duì)鐵離子的還原能力來(lái)間接體現(xiàn)其抗氧化活性，F(xiàn)RAP值越大，表明樣品的還原能力越強(qiáng)，即具有更強(qiáng)的抗氧化活性。本研究中綠茶和黑毛茶的FRAP值較高（分別為52.252?mmol·L-1和49.592?mmol·L-1），兩者之間無(wú)顯著性差異；而白茶和紅茶的FRAP值較低（分別為18.498?mmol·L-1和13.179?mmol·L-1），兩者之間無(wú)顯著性差異，這與前述以3種不同自由基測(cè)定抗氧化活性方法所得結(jié)果一致。有研究報(bào)道指出，同一批鮮葉制備成綠茶、白茶、傳統(tǒng)紅茶和CTC紅茶的抗氧化活性相比，綠茶的抗氧化活性最強(qiáng)，白茶次之，而CTC紅茶的抗氧化活性最弱[41]，這與本研究結(jié)果相類似。究其原因，可能是茶葉浸提液中的茶多酚具有良好的抗氧化活性，由于不發(fā)酵茶或半發(fā)酵茶中茶多酚含量高于發(fā)酵茶，因此表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗氧化活性[37]。由于不同的抗氧化活性評(píng)價(jià)方法的抗氧化機(jī)理及適用范圍不同，需要采用多種評(píng)價(jià)方法以全面考察樣品的抗氧化活性[42]。綜合細(xì)胞抗氧化活性及4種不同體外化學(xué)抗氧化活性評(píng)價(jià)方法，結(jié)果表明，綠茶的體外抗氧化活性最強(qiáng)。

表3 不同類型茶葉的細(xì)胞抗氧化活性分析

注：同一列字母不同表示差異性顯著（<0.05）。下同

Note: Different letters in the same column indicate significant differences (<0.05). The same below

表4 不同類型茶葉的體外抗氧化活性分析

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)采用相同茶鮮葉原料，經(jīng)7?h厭氧處理后不同葉位中GABA含量存在較明顯的差異；其中，第一、二葉中的GABA含量最高，因此可選用一芽二葉的采摘標(biāo)準(zhǔn)加工成高GABA茶；然而，本研究中采用一芽五葉采摘標(biāo)準(zhǔn)的茶鮮葉經(jīng)厭氧處理后加工成綠茶、烏龍茶和黑毛茶，其GABA含量也超過(guò)了1.5?mg·g-1，可見(jiàn)為提高茶樹(shù)資源利用率，可以選用成熟度更高的茶樹(shù)鮮葉為原料加工成高GABA茶。此外，莖梗經(jīng)厭氧處理后GABA含量也顯著上升，表明莖梗對(duì)GABA茶的制作可能有一些重要價(jià)值。

研究發(fā)現(xiàn)不同加工工藝也會(huì)對(duì)茶葉中的GABA含量產(chǎn)生重要影響，厭氧處理后的茶鮮葉加工成的綠茶中GABA含量最高，而紅茶含量最低；同時(shí)，厭氧處理后加工而成的綠茶也具有最強(qiáng)的ACE抑制活性和抗氧化活性，表明其相較于其他加工工藝的茶葉可能具有更佳的降血壓功效。

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Effects of Anaerobic Treatment on Amino Acid Composition and Biological Activities of Different Type Teas

YANG Gaozhong1,2, PENG Qunhua1, ZHANG Yue1, SHI Jiang1, LIN Zhi1*, Lü Haipeng1*

1. Key Lab of Tea Biology and Resources Utilization, Ministry of Agriculture, Tea Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou 310008, China；2. Graduate School of Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China

The same batch of fresh tea leaves after 7 hours anaerobic treatmentwas processed into green tea, white tea, oolong tea, black tea, and dark raw tea according to different processing technologies. The amino acid composition and content, angiotensin converting enzyme (ACE) inhibitory activity were determined, and their antioxidant activities were also measured by determining cellular antioxidant activity (CAA), 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH) free radical scavenging capacity, 2,2'-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) cation radical scavenging capacity, superoxide anion radical absorbance capacity, and ferric ion reducing antioxidant power (FRAP). Results show that the composition and content of free amino acids in different types of teas varied significantly which were processed after anaerobic treatment, and especially the content of-aminobutyric acid (GABA) increased significantly. The highest GABA content was found in green tea (2.21?mg·g-1), followed by oolong tea (2.19?mg·g-1), while the lowest in black tea (0.86?mg·g-1). Moreover, green tea and dark raw tea showed the strongest inhibition rate of ACE (35.7% and 37.2%, respectively), while black tea showed the weakest inhibitory activity against ACE (23.8%). Additionally, it was found that green tea had the strongest antioxidant activity among the different types of teas processed from the same fresh tea leaves after anaerobic treatment.

tea,-aminobutyric acid, processing technology, angiotensin converting enzyme, antioxidant activity

S571.1

A

1000-369X(2022)02-222-11

2021-10-09

2022-01-13

財(cái)政部和農(nóng)業(yè)農(nóng)村部：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（CARS-19）、中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目（CAAS-ASTIP-2014-TRICAAS）

楊高中，男，碩士研究生，主要從事茶葉品質(zhì)化學(xué)與營(yíng)養(yǎng)健康方面研究。*通信作者：linz@tricaas.com；lvhaipeng@tricaas.com

（責(zé)任編輯：趙鋒）