養(yǎng)陰?kù)顫窕龇綄?duì)高尿酸性腎病大鼠腎功能的影響*

胡苗青，周珂，梁恩軍，歐陽(yáng)美萍

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410005； 2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長(zhǎng)沙 410208

高尿酸血癥是由于人體內(nèi)嘌呤代謝異常，引起血尿酸生成過(guò)多或排泄減少所致。血中尿酸鹽呈過(guò)度飽和狀態(tài)時(shí)可沉積于腎臟，使腎臟產(chǎn)生一系列的炎癥反應(yīng)，引起腎間質(zhì)損害，形成高尿酸性腎病[1]。近些年，高尿酸血癥的發(fā)病率逐年上升，且日趨年輕化，是目前居于糖尿病之后的代謝性疾病。本研究擬通過(guò)觀察不同劑量養(yǎng)陰?kù)顫窕龇綄?duì)高尿酸性腎病大鼠腎功能及腎臟病理形態(tài)學(xué)影響，為中藥治療高尿酸性腎病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)SD雄性大鼠54只，體質(zhì)量220～250 g，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，動(dòng)物質(zhì)量合格證編號(hào)：ZS-202006160011，飼養(yǎng)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物屏障環(huán)境內(nèi)。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查，倫理審批號(hào)：LLBH-202006140003。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物養(yǎng)陰?kù)顫窕龇?，藥物組成：墨旱蓮15 g，山茱萸15 g，土茯苓30 g，蠶砂10 g，白術(shù) 15 g，薏苡仁30 g，丹參15 g，當(dāng)歸10 g，大黃5 g，地龍10 g，川牛膝15 g，黃芪30 g。購(gòu)于湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。別嘌醇片(合肥久聯(lián)制藥有限公司，批號(hào)：H34021248，每片100 mg)；腺嘌呤(批號(hào)：A108805)，氧嗪酸鉀(批號(hào)：P137112)，羥甲基纖維素鈉(批號(hào)：C104985)，均購(gòu)于阿拉丁試劑有限公司。

1.3 儀器與試劑尿蛋白檢測(cè)試劑盒、尿酸檢測(cè)試劑盒、肌酐檢測(cè)試劑盒、尿素檢測(cè)試劑均購(gòu)自于寧波瑞源生物科技有限公司；蘇木素-伊紅染液購(gòu)自于武漢谷歌生物科技有限公司；無(wú)水乙醇、二甲苯、氨水、中性樹膠購(gòu)自于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

離心機(jī)(湖南邁克爾實(shí)驗(yàn)儀器有限公司，型號(hào)：KC-600B)，血生化檢測(cè)儀(東芝醫(yī)療系統(tǒng)株式會(huì)社，型號(hào)：TBA-FX8)，病理切片機(jī)(上海徠卡儀器有限公司，型號(hào)：RM2016)，組織攤片(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司，型號(hào)：KD-P)，光學(xué)顯微鏡(日本尼康，型號(hào)：Nikon Eclipse E100)，脫水機(jī)、包埋機(jī)、凍臺(tái)均購(gòu)于武漢俊杰電子有限公司。

1.4 造模與分組將54只SD大鼠隨機(jī)選取11只為空白組，其余43只為造模組，大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始造模。所有大鼠均給予標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，造模組大鼠予以腺嘌呤100 mg·kg-1聯(lián)合氧嗪酸鉀 1 500 mg·kg-1(溶于1.25%羧甲基纖維素鈉懸浮液中)灌胃造模，每天1次，空白組予以等量1.25%羧甲基纖維素鈉懸浮液灌胃[2]。連續(xù)灌胃2周，隨機(jī)在空白組與造模組各選取3只，收集24 h尿液，并在最后1次造模灌胃后2 h稱體質(zhì)量后麻醉，下腔靜脈采血檢測(cè)腎功能，造模組大鼠尿蛋白定量與腎功能指標(biāo)高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表示模型成功。隨后將造模成功的40只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M、別嘌醇組，每組各8只。

1.5 給藥方法各給藥組根據(jù)人與大鼠體表面積等效劑量換算法算出相應(yīng)劑量[3]，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M分別予以養(yǎng)陰?kù)顫窕龇?7.2 g·kg-1·d-1，18.6 g·kg-1·d-1，9.3 g·kg-1·d-1灌胃，別嘌醇組予以別嘌醇片9.3 mg·kg-1·d-1灌胃，空白組及模型組予以等量生理鹽水灌胃，每天1次，每次2 mL，連續(xù)灌胃3周。

1.6 觀察指標(biāo)給藥最后1次灌胃結(jié)束2 h后稱體質(zhì)量，用體積分?jǐn)?shù)10%水合氯醛溶液3.5 mL·kg-1對(duì)大鼠進(jìn)行腹腔麻醉，待其疼痛反射消失后，固定大鼠，打開腹腔，從下腔靜脈收集血液，每只大鼠采集血4 mL，用離心機(jī)1 500 r·min-1，離心半徑 13.5 cm，離心5 min，取上清液即血清，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)腎功能[尿酸(uric acid，UA)、血尿素氮(blood urea nitrogen，BUN)、肌酐(creatinine，Cr)]水平。各組大鼠采血后，立即取出大鼠腎臟，予 9 ng·L-1氯化鈉溶液漂洗，濾紙吸干，稱重后將其放置于裝有 40 ng·L-1多聚甲醛50 mL離心管中固定，24 h后依次將切片逐級(jí)酒精脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，切成4 μm的薄片，以HE染色腎組織病理片檢查。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠一般情況空白組大鼠一般情況可，反應(yīng)靈敏，精神佳，皮毛濃密，毛色有光澤，攝食飲水正常，大小便正常。模型組大鼠精神萎靡，活動(dòng)減少，大鼠皮毛干枯無(wú)光澤，豎毛，尿量明顯增多，大便稀軟，抓持抵抗力減弱。經(jīng)過(guò)藥物干預(yù)后，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M及別嘌醇組大鼠整體一般情況較模型組有所改善。養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M在實(shí)驗(yàn)結(jié)束前1 d死亡1只，未采集標(biāo)本。

2.2 各組大鼠腎功能變化情況比較模型組大鼠UA、Cr、BUN水平高于空白組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各給藥組UA水平低于模型組，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M及別嘌醇組Cr水平低于模型組，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M及別嘌醇組BUN水平低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；別嘌醇組UA水平低于中藥各劑量組，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷MUA水平低于養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷MCr水平低于養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷MBUN水平低于養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 各組大鼠腎功能變化情況比較

2.3 各組大鼠腎臟外觀情況通過(guò)觀察腎臟外觀發(fā)現(xiàn)，空白組大鼠形態(tài)呈紅褐色的蠶豆?fàn)?，大小正常，表面光滑，未見明顯異常。模型組較空白組大鼠腎臟外觀稍有增大，表面有散在分布的白色小點(diǎn)，切開后可見腎皮質(zhì)變薄，腎髓質(zhì)及椎體有少許放射狀白線。與模型組比較，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M及別嘌醇組表面散在分布的白色小點(diǎn)減少，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M從外觀上看與空白組最接近，而養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M與模型組最相似，見圖1。

注：A：正常組；B：模型組；C：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M；D：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M；E：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M；F：別嘌醇組

2.4 各組大鼠腎臟組織病理變化情況通過(guò)HE染色觀察各組大鼠腎臟組織病理學(xué)變化可見，空白組大鼠腎臟組織形態(tài)結(jié)構(gòu)正常，無(wú)尿酸鹽結(jié)晶，腎小管上皮細(xì)胞排列緊密，未見明顯炎癥。模型組大鼠腎臟組織中可見大量腎小管萎縮，管腔擴(kuò)張，腎小管內(nèi)可見尿酸鹽晶體沉積，部分管腔內(nèi)可見壞死組織碎片；間質(zhì)中可見結(jié)締組織增生，伴有較多炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，局部形成肉芽腫，可見多核巨細(xì)胞。與模型組比較，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M及別嘌醇組在腎小管損傷、尿酸鹽晶體沉積、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等方面均有不同程度減輕，而養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M改善不明顯。結(jié)果表明，高尿酸性腎病大鼠主要表現(xiàn)為腎小管損傷，養(yǎng)陰?kù)顫窕龇娇梢燥@著改善腎小管損傷，尤以養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M、高劑量組改善最為明顯，見圖2。

注：A：空白組；B：模型組；C：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇礁邉┝拷M；D：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇街袆┝拷M；E：養(yǎng)陰?kù)顫窕龇降蛣┝拷M；F：別嘌醇組

3 討論

高尿酸性腎病是由于血尿酸生成過(guò)多或排泄減少，使血液中尿酸鹽呈過(guò)飽和狀態(tài)，尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎臟而引起腎臟損傷類疾病，嚴(yán)重時(shí)可發(fā)展為腎功能衰竭。高尿酸性腎病的具體發(fā)病機(jī)制尚未明確，一般認(rèn)為與尿酸鹽阻塞腎小管密切相關(guān)。尿酸鹽晶體可通過(guò)阻塞遠(yuǎn)端腎小管、腎間質(zhì)和髓質(zhì)，引起腎間質(zhì)炎癥及腎臟小血管的損傷，同時(shí)腎臟局部產(chǎn)生的氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等，可通過(guò)損傷血管內(nèi)皮功能，使腎臟纖維化加重，甚至走向終末期腎病[4-5]。目前，西醫(yī)治療高尿酸性腎病主要通過(guò)抑制肝臟黃嘌呤氧化酶的活性以減少尿酸生成，或通過(guò)調(diào)控腎臟尿酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)體增加尿酸排泄。別嘌呤醇、非布司他、丙磺舒、苯溴馬隆等藥物是西醫(yī)治療高尿酸性腎病的常用藥物，前兩種藥物雖降尿酸作用較強(qiáng)，但長(zhǎng)期服用有加重腎臟負(fù)擔(dān)的風(fēng)險(xiǎn)，可導(dǎo)致腎功能不全，而使患者使用受限，同時(shí)使用別嘌醇時(shí)易發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)[6]。

高尿酸性腎病屬中醫(yī)學(xué)“痛風(fēng)”“歷節(jié)”“痹證”“虛勞”等范疇，病因?yàn)橄忍旆A賦薄弱，腎元不充，導(dǎo)致蒸化無(wú)權(quán)；或因飲食不節(jié)，嗜食肥甘厚味；或因喜飲酒而少動(dòng)，使脾胃運(yùn)化失常，氣機(jī)不能伸展，濕熱內(nèi)蘊(yùn)；或因勞倦過(guò)度、情志內(nèi)傷，使肝失疏泄，全身氣機(jī)不利，影響脾的升清和胃的降濁，導(dǎo)致體內(nèi)濕濁內(nèi)生。若遷延日久，使氣血津液運(yùn)行受阻，痰瘀互結(jié)，痹阻于腎臟、關(guān)節(jié)與筋肉，瘀、濁停留日久，郁而化熱，進(jìn)一步耗竭真陰，而產(chǎn)生多種變證[7-8]。程曉霞教授認(rèn)為，本病常因痰濁、濕熱、瘀血等痹阻關(guān)節(jié)，出現(xiàn)關(guān)節(jié)紅腫熱痛的表現(xiàn)[9]。久病損傷腎絡(luò)，腎氣失于氣化，濕熱下注，化火傷陰，煎熬尿液而出現(xiàn)瘀滯之證；濕熱、痰濕日久痹阻腎絡(luò)，致腎氣封藏失職，精微物質(zhì)下泄而出現(xiàn)蛋白尿、血尿。高彥彬教授認(rèn)為，濕熱瘀毒，損傷關(guān)節(jié)、筋肉之絡(luò)脈，可出現(xiàn)關(guān)節(jié)畸形、腫脹；瘀結(jié)腎絡(luò)，積久致腎勞，失于封藏，精氣下泄，而出現(xiàn)尿濁多泡沫；肝腎同源，腎不藏精，肝陰不足，虛風(fēng)上擾，可出現(xiàn)頭目眩暈等；腎開闔失司，小便不利，水濕泛溢，出現(xiàn)水腫[10]。祛濕化瘀養(yǎng)陰方為本院常用經(jīng)驗(yàn)方，可祛濕化瘀、兼顧滋養(yǎng)肝腎，由土茯苓、薏苡仁、黃芪、白術(shù)、蠶砂、丹參、地龍、川牛膝、當(dāng)歸、墨旱蓮、山茱萸、大黃等藥物組成。方中重用土茯苓、薏苡仁為君藥，兩藥相合能增強(qiáng)祛濕泄?jié)?、除痹之功。臣以黃芪補(bǔ)脾益氣，白術(shù)健脾、燥濕利水，既補(bǔ)脾氣之不足，又祛脾臟之濕邪，蠶砂和胃化濕，三者合用以助君藥?kù)顫裥節(jié)?，使?jié)裥办疃粋?；鑒于“血行則濕不易留、濁不易滯”理論，方中加丹參、地龍、川牛膝化瘀通絡(luò)；濕熱之邪日久易傷陰，故配合當(dāng)歸、山茱萸、墨旱蓮養(yǎng)陰潤(rùn)燥、滋補(bǔ)肝腎；佐以大黃增強(qiáng)化瘀泄?jié)嶂Γ沟脻嵝暗们?，腎絡(luò)得通。全方合用，標(biāo)本兼顧，使祛邪而不傷正。

現(xiàn)代藥理研究表明，土茯苓中的黃酮類能通過(guò)抑制黃嘌呤氧化酶的活性，使尿酸排泄增加；落新婦苷能通過(guò)減少機(jī)體內(nèi)的活性氧含量，使炎癥因子生成減少，從而改善高尿酸性腎病引起的腎損傷[10]。薏苡仁能夠促進(jìn)尿酸排泄，通過(guò)增加腎臟血流量改善腎功能，還能調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)功能，其脂肪油能抗凝、改善糖脂肪代謝及調(diào)節(jié)血壓[11]。黃芪具有抗氧化、抑制免疫及炎癥反應(yīng)、改善腎小球?yàn)V過(guò)等作用[12]。當(dāng)歸能通過(guò)抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，改善腎小球硬化，減輕炎癥反應(yīng)[13]。山茱萸可通過(guò)抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，減輕糖尿病腎病引起的病理?yè)p傷，改善腎組織纖維化，保護(hù)腎臟[14]。丹參能通過(guò)抑制腎臟成纖維細(xì)胞的增殖，減少脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛的產(chǎn)生，從而減少腎間質(zhì)纖維化的形成[15]。地龍能通過(guò)抑制腎小球系膜細(xì)胞增殖，從而抑制細(xì)胞外基質(zhì)的集聚，改善炎癥反應(yīng)，改善腎小球硬化[16]。川牛膝提取物能有效改善腎臟纖維化，而且能通過(guò)使腎素釋放減少，引起腎小球周圍血管擴(kuò)張，使血壓下降[17-18]。大黃能減少尿素氮的合成，促成腸道代謝產(chǎn)物的排出，也可通過(guò)阻礙機(jī)體氮化磷酸化，改善慢性腎功能衰竭導(dǎo)致的低鈣血癥及高磷血癥，從而更好地改善腎功能，且大黃中的大黃酸能抑制細(xì)胞凋亡及降低炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)腎臟[19]。

本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，祛濕化瘀養(yǎng)陰方能改善高尿酸性腎病大鼠的腎功能、降低血尿酸，改善腎臟組織病理?yè)p害，減少尿酸鹽在腎小管中的沉積，對(duì)高尿酸性腎病大鼠腎臟具有明顯的保護(hù)作用。