高效液相色譜法同時測定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中7 種抑菌劑

陳再潔，陳艷芝，吳小梅，薛昆鵬，任興發(fā)，屠炳芳

（月旭科技<上海>股份有限公司，上海 201600）

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液主要成分為硫酸新霉素、地塞米松磷酸鈉、玻璃酸鈉，其中硫酸新霉素為氨基苷類廣譜抗菌藥物，對革蘭陰性菌、革蘭陽性菌、抗酸桿菌和放線桿菌屬都有抑菌效果，對葡萄球菌的作用比鏈球菌強(qiáng)，生物體液中的膿液、滲出液、胃腸分泌液、細(xì)菌生長產(chǎn)物和酶均不影響其抗菌作用；地塞米松磷酸鈉為人工合成的糖皮質(zhì)激素，具有較強(qiáng)的抗炎和抗過敏作用；玻璃酸鈉是眼用制劑的載體，具有保濕、增稠、增強(qiáng)藥物利用度、減少藥物刺激等作用。其適應(yīng)證為急、慢性結(jié)膜炎，鞏膜炎，急性鞏膜炎，角膜炎，葡萄膜炎，青光眼，白內(nèi)障，角膜移植術(shù)后及眼部受傷后的處理。多劑量包裝的滴眼液中通常加入了適宜的抑菌劑，以防止使用過程中被微生物污染。復(fù)方硫酸新霉素滴眼液被收載于《國家藥品標(biāo)準(zhǔn)·化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國家標(biāo)準(zhǔn)（第三冊）》［WS - 10001 -（HD - 0261）-2002］，注明“本品中可加適量的抑菌劑”，但對抑菌劑的具體種類和加入量未作規(guī)定，并非所有生產(chǎn)企業(yè)均使用相同的抑菌劑，部分生產(chǎn)企業(yè)也未在藥品說明書中明確標(biāo)示抑菌劑的含量。相關(guān)數(shù)據(jù)顯示，收載的多個滴眼液品種僅部分列入抑菌劑含量測定［1］。目前尚未建立統(tǒng)一、規(guī)范的滴眼液常用抑菌劑的檢測方法，不利于有效監(jiān)管。為了更好地控制滴眼液的質(zhì)量，本研究中建立了同時測定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中7 種抑菌劑含量的高效液相色譜（HPLC）法?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Wisys 5000 型高效液相色譜儀（月旭科技<上海>股份有限公司），配有四元泵、自動進(jìn)樣器、柱溫箱、紫外- 可見分光光度檢測器、色譜工作站；AUW120D 型電子分析天平（日本島津公司，精度為十萬分之一）；DHG-9123A型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；KQ-400E 型臺式超聲波清洗機(jī)（昆山市超聲儀器有限公司，功率為400 W，頻率為40 kHz）。

1.2 試藥

復(fù)方硫酸新霉素滴眼液（武漢五景藥業(yè)有限公司，批號分別為20050203，20050204，20060102，20060103，20060104，20060105）；羥苯甲酯標(biāo)準(zhǔn)品（批號為100444-201804，純度為99.6%），苯甲酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品（批號為100433-201702，純度為99.7%），羥苯乙酯標(biāo)準(zhǔn)品（批號為100847 - 201604，純度為99.9%），羥苯丙酯標(biāo)準(zhǔn)品（批號為100444-202005，純度為99.9%），苯扎溴銨標(biāo)準(zhǔn)品（批號為135051-202002，純度為99.8%），均購自中國食品藥品檢定研究院；硫柳汞鈉標(biāo)準(zhǔn)品（批號為12627 - 2001，純度為99.5%），苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)品（批號為12625-2001，純度為99.5%），均購自上海赤芍生物科技有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：月旭Ultimate?XB-C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇（A）- 磷酸水溶液（磷酸調(diào)pH 為3.5，B），梯度洗脫（0～8 min 時 40%B，8～19 min 時40%B → 90%B，19～27 min 時 90%B，27～28 min 時90%B → 40%B，28～35 min時40%B）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：214 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2 溶液制備

單標(biāo)溶液：取羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中，加水定容，超聲（功率為400 W，頻率為40 kHz）使溶解，得各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為7.24，11.27，9.54，4.83，10.49，55.29，51.02 μg/mL的單標(biāo)溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液：取羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨標(biāo)準(zhǔn)品各適量，精密稱定，置50 mL容量瓶中，加水定容，超聲（功率為400 W，頻率為40 kHz）使溶解，得各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為62.5，101.5，108.0，53.5，121.0，535.0，496.5 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液；精密量取上述混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液1 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，混勻，即得各標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)量濃度分別為6.25，10.15，10.80，5.35，12.10，53.50，49.65 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

供試品溶液Ⅰ：取樣品 5 支，混勻，0.45 μm 微孔濾膜濾過，即得硫酸新霉素和地塞米松磷酸鈉質(zhì)量濃度分別為3.5，1.0 mg/mL 的供試品溶液Ⅰ。樣品說明書中若標(biāo)注了抑菌劑，根據(jù)標(biāo)示量用水適當(dāng)稀釋，將其質(zhì)量濃度稀釋至線性范圍內(nèi)。本研究中的樣品均未標(biāo)注抑菌劑信息。

供試品溶液Ⅱ：取樣品5 支，混勻，取5 mL，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液2 mL，置10 mL容量瓶中，用水定容，羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨的質(zhì)量濃度分別為12.50，20.30，21.60，10.70，24.20，107.00，99.30 μg/ mL，以及硫酸新霉素質(zhì)量濃度為0.70 mg/mL、地塞米松磷酸鈉質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的溶液，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

陰性對照品溶液：按處方工藝分別制備不含羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨的陰性樣品，按供試品溶液Ⅰ方法制備陰性對照品溶液。

2.3 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取2.2 項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液、供試品溶液和陰性對照品溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖見圖1。本樣品中未標(biāo)注抑菌劑，通過單標(biāo)溶液的定位，供試品溶液色譜中羥苯乙酯同位置出峰，實(shí)際樣品中含有羥苯乙酯。

圖1 高效液相色譜圖1.Methylparaben 2.Sodium benzoate 3.Ethylparaben 4.Propylparabe 5.Thiomersal 6.Benzalkonium bromide 7.Benzalkonium chlorideA.Mixed standard solution B.Test solution Ⅰ C.Test solution Ⅱ D.Negative control solutionFig.1 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察、檢測限與定量限確定：精密量取2.2 項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品貯備液 0.1，0.2，0.5，1.0，2.0，6.0，10.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加水定容，即得系列線性標(biāo)準(zhǔn)品混標(biāo)溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表1。將各標(biāo)準(zhǔn)品溶液逐級稀釋，以10 倍信噪比（S/N）對應(yīng)的質(zhì)量濃度為各成分的定量限，以3 倍S/N對應(yīng)的質(zhì)量濃度為各成分的檢測限。結(jié)果見表1。

表1 線性關(guān)系考察、定量限與檢測限確定結(jié)果Tab.1 Results of linear relationship test，LOQ and LOD

精密度試驗(yàn)：精密吸取混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液10 μL，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨峰面積的RSD分別為0.32%，0.52%，0.45%，0.39%，0.25%，0.40%，0.38%（n= 6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.2 項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，分別于0，1，2，3，6，8，12 h 時按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨含量的RSD分別為 0.25%，0.35%，0.19%，0.22%，0.37%，0.43%，0.41%（n= 7），表明混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：分別取樣品 5 支，共 6 份，按 2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液Ⅰ，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，其中含有的羥苯乙酯的RSD為1.32%（n=6）；分別取樣品5支，共6份，按2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液Ⅱ，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨峰面積的RSD分別為0.95%，1.02%，0.89%，1.11%，1.15%，0.97%，1.09%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液Ⅱ9 份，分為 3 組，分別加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.8，1.0，1.2 mL，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，以外標(biāo)法計(jì)算含量，并計(jì)算回收率和RSD。結(jié)果羥苯甲酯、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、羥苯丙酯、硫柳汞、苯扎溴銨、苯扎氯銨的加樣回收率分別為97.24%，98.55%，98.67%，99.85%，97.99%，97.55%，98.72%，RSD分別為0.93%，0.87%，1.02%，0.97%，0.67%，0.88%，0.85%（n=9）。

耐用性試驗(yàn)：取2.2項(xiàng)下單標(biāo)溶液各適量，按2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，分別考察3 個批次月旭Ultimate?XB - C18柱，按磷酸水的pH ± 0.5，梯度每個時間點(diǎn)±1 min，柱溫 ± 2 ℃，流速 ± 0.1 mL/min 進(jìn)行調(diào)整，分離度均能大于1.5，符合定量測定相關(guān)要求。

2.4 樣品含量測定

取 6 批（批 號 分 別 為 20050203，20050204，20060102，20060103，20060104，20060105）樣品，依法制備供試品溶液，按2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定6 次，記錄峰面積，并計(jì)算含量。結(jié)果羥苯乙酯的含量分別為325.29，330.86，336.61，341.25，334.57，335.26 μg/mL，其余抑菌劑未檢出。

3 討論

3.1 色譜條件選擇

曾考察不同有機(jī)相（甲醇［2］、乙腈［3］、甲醇 - 乙腈混合溶液）；曾考察不同水相［1%三乙胺（磷酸調(diào)pH 為3.5）［4］、20 mmol 磷酸二氫鉀和20 mmol 磷酸氫二鉀（磷酸調(diào) pH 為3.0）、20 mmol 磷酸二氫鈉［5］、1%冰醋酸［6］、磷酸水溶液（磷酸調(diào)pH 為3.5）［7-8］］；色譜柱曾考察不同鍵合相C8柱、C18柱，以及不同鍵合工藝具有不同選擇性的C18柱［9-10］；曾考察不同梯度洗脫條件［11］及不同比例等度洗脫條件［12-15］。最終，選擇月旭Ultimate?XB - C18柱（150 mm × 4.6 mm，5 μm），甲醇（A）- 磷酸水溶液（磷酸調(diào)pH為3.5，B）進(jìn)行梯度洗脫。

3.2 方法評價(jià)

本方法操作簡便，結(jié)果準(zhǔn)確，穩(wěn)定性好，可用于同時測定復(fù)方硫酸新霉素滴眼液中7種抑菌劑的含量。