黃梔祛傷水質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

朱 芹 ，趙 娟 △，謝宏贊 ，王 興 ，羅純清

（1. 湖南省湘潭市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 湘潭 411000； 2. 湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院，湖南 湘潭 411000）

黃梔祛傷水為湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院的醫(yī)院制劑，由黃連、黃柏、大黃、梔子、牡丹皮、紅花、乳香、沒(méi)藥、薄荷、白礬10 味中藥組方，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛功效，主治肢體損傷、腫脹疼痛伴灼熱、紅腫者。方中大黃、黃連、黃柏、梔子清熱燥濕、瀉火解毒，為君藥［1-3］；牡丹皮清熱涼血，乳香、沒(méi)藥活血消腫、化瘀止痛，紅花活血化瘀，共為臣藥［4-5］；薄荷、白礬疏散解表、透疹行氣、燥濕止癢、解毒殺蟲(chóng)，為佐藥［6-7］。該方參考清代吳鞠通的《溫病條辨》擬訂，經(jīng)多年臨床實(shí)踐驗(yàn)證，目前正在申報(bào)醫(yī)院制劑批準(zhǔn)文號(hào)，但尚無(wú)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。為了全面、有效地控制黃梔祛傷水的質(zhì)量，本研究中采用薄層色譜（TLC）法對(duì)方中黃連、黃柏、大黃進(jìn)行定性鑒別，采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定方中鹽酸小檗堿、梔子苷、丹皮酚的含量?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

E2695型高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司），配有2998型二極管陣列檢測(cè)器、2695型自動(dòng)進(jìn)樣器、Empower3色譜工作站；ABS-135S 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司，精度為0.01 mg）；KQ-250DB型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為500 W，頻率為40 kHz）；明澈-D24UV純水/超純水一體化系統(tǒng)（德國(guó)默克密理博公司）；硅膠G薄層板（青島海洋化工有限公司）。

1.2 試藥

黃梔祛傷水（湖南省湘潭市中醫(yī)醫(yī)院制劑室，批號(hào)分別為 20210106，20210211，20210325，規(guī)格為每瓶500 mL）；梔子苷、丹皮酚、鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)分別 為 110749 - 201919，110708 - 201908，110713 -202015，純度分別為97.1%，99.8%，85.9%），黃連、黃柏、大黃對(duì)照藥材（批號(hào)分別為120913 - 201310，121510 - 201807，120902 - 201912），均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 TLC 鑒別

黃連［8］：取樣品 20 mL，加甲醇100 mL，超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為40 kHz）30 min，濾過(guò)，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。另取黃連對(duì)照藥材0.25 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺黃連的陰性樣品，取5 mL，同法制成缺黃連藥材的陰性對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各2 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以環(huán)己烷-乙酸乙酯-異丙醇-甲醇-水-三乙胺（30∶35∶10∶15∶5∶10，V/V/V/V/V/V）為展開(kāi)劑，置濃氨試液預(yù)飽和20 min 的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 A。

黃柏［9］：取樣品30 mL，加1%醋酸甲醇溶液200 mL，于60 ℃溫度條件下超聲提?。üβ蕿?00 W，頻率為40 kHz）40 min，濾過(guò)，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液。另取黃柏對(duì)照藥材0.5 g，加1%醋酸甲醇溶液50 mL，同法制成對(duì)照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺黃柏藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以三氯甲烷 - 甲醇 - 水（30∶15∶4，V/V/V）的下層溶液為展開(kāi)劑，置氨蒸氣飽和的展開(kāi)缸內(nèi)，展開(kāi)，取出，晾干，日光下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同顏色的斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 B。

圖1 薄層色譜圖1.Reference medicinal material solution 2-4.Test solution 5.Negative reference solutionA.Coptidis Rhizoma（365 nm） B.Phellodendri Chinensis Cortex（sunlight） C.Rhei Radix et Rhizoma（365 nm）Fig.1 TLC chromatograms

大黃［10］：取樣品20 mL，加甲醇100 mL，超聲提取（功率為400 W，頻率為40 kHz）40 min，濾過(guò)，取濾液10 mL，蒸干，殘?jiān)铀?0 mL 使溶解，再加鹽酸1 mL，加熱回流30 min，立即冷卻，用乙醚分2 次振搖提取，每次20 mL，合并乙醚液，蒸干，殘?jiān)尤燃淄? mL使溶解，作為供試品溶液。另取大黃對(duì)照藥材1.0 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。按黃梔祛傷水處方工藝制備缺大黃藥材的陰性樣品，同法制備陰性對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國(guó)藥典（四部）》通則0502 TLC 法試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點(diǎn)于同一以羧甲基纖維素鈉為黏合劑的硅膠H 薄層板上，以石油醚（30～60 ℃）- 甲酸乙酯 - 甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層溶液為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈（365 nm）下檢視。供試品溶液色譜中，在與對(duì)照藥材溶液色譜相應(yīng)位置顯相同的橙黃色熒光斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無(wú)干擾。詳見(jiàn)圖1 C。

2.2 含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Waters Xterra C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）-0.25%磷酸溶液（B），梯度洗脫［11-14］（程序見(jiàn)表1）；流速：1.0 mL/ min；檢測(cè)波長(zhǎng)：238 nm（梔子苷）和274 nm（鹽酸小檗堿和丹皮酚）；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。在此色譜條件下的色譜圖見(jiàn)圖2。理論板數(shù)以梔子苷峰計(jì)大于5 000，各待測(cè)成分與前后峰分離度均大于1.5。

圖2 高效液相色譜圖1.Geniposide 2.Berberine hydrochloride 3.PaeonolA.Mixed reference solution B.Test solution C-E.Negative control solution（lacking of Coptidis Rhizoma，Gardeniae Fructus and Moutan Cortex，respectively）Fig.2 HPLC chromatograms

表1 流動(dòng)相梯度洗脫程序（%）Tab.1 Gradient elution program of the mobile phase（%）

2.2.2 溶液制備

取鹽酸小檗堿對(duì)照品24.29 mg、梔子苷對(duì)照品12.65 mg 及丹皮酚對(duì)照品20.07 mg，精密稱定，置同一50 mL 棕色容量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，即得混合對(duì)照品溶液（室溫避光保存，備用）。取裝量差異項(xiàng)下樣品，混勻，精密量取20 mL，置100 mL 棕色容量瓶中，加甲醇適量，超聲處理（功率為400 W，頻率為50 kHz）40 min，放冷，再加甲醇稀釋至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。按處方工藝，分別制備缺黃連、梔子、丹皮的陰性樣品，并按供試品溶液制備方法分別制備陰性對(duì)照品溶液。

2.2.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察、檢測(cè)限與定量限確定：分別精密吸取 2.2.2 項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液 4.0，6.0，8.0，10.0，12.0，15.0 mL，置同一20 mL 棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚質(zhì)量濃度分別為0.485 8，0.253 0，0.401 4 mg/mL的系列對(duì)照品溶液。精密吸取上述系列對(duì)照品溶液，按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖。以質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。將對(duì)照品溶液逐級(jí)稀釋，以信噪比（S/N）為3.0時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的檢測(cè)限，以S/N為10.0 時(shí)的質(zhì)量濃度為各成分的定量限。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 線性關(guān)系考察、檢測(cè)限與定量限確定結(jié)果（n=6）Tab.2 Results of linear relationship test，LOD and LOQ（n=6）

精密度試驗(yàn)：精密吸取2.2.2項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液10 μL，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6 次，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚峰面積的RSD分別為0.55%，0.62%，0.71%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20210106）樣品，按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于常溫下放置0，3，6，9，15，20，24 h 時(shí)按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚峰面積的RSD分別為1.25%，0.94%，1.03%（n=7），表明供試品溶液在常溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為20210106）樣品6份，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，并計(jì)算質(zhì)量濃度。結(jié)果鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的平均質(zhì)量濃度分別為1.187 0，0.674 1，0.820 7 mg/ mL，RSD分別 1.24%，0.96%，0.89%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取已知含量的樣品（批號(hào)為20210106）9 份，分為 3 組，各 3 份，每份精密量取 10 mL，每組按供試品中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚含量的80%，100%，120%精密加入相應(yīng)對(duì)照品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜圖，并計(jì)算加樣回收率。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）Tab.3 Results of recovery test（n=9）

2.2.4 樣品含量測(cè)定

取3 批樣品，按2.2.2 項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，采用外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的含量。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 3批樣品含量測(cè)定結(jié)果（mg/mL，n=3）Tab.4 Results of content determination of ingredients in the three bacthes of samples（mg/mL，n=3）

3 討論

3.1 TLC 條件選擇

對(duì)黃連、黃柏、大黃進(jìn)行定性鑒別時(shí)，分別考察了不同品牌（青島海洋、上海邦凱）的薄層板、不同溫度（室溫、2～10 ℃）、相對(duì)濕度（40%，50%～60%，75%）條件下展開(kāi)的效果，以及不同檢視方式（日光、紫外光燈）的顯色效果，最終確定為2.1項(xiàng)下TLC條件。

3.2 色譜條件選擇

為保證各成分在各自最佳吸收波長(zhǎng)處被檢測(cè)到，并達(dá)到同時(shí)檢測(cè)3種有效成分的目的，采用二極管陣列檢測(cè)器于190～400 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)測(cè)定混合對(duì)照品溶液和供試品溶液，最終確定采用分段變換波長(zhǎng)檢測(cè)，在238 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)梔子苷，在274 nm 波長(zhǎng)處檢測(cè)鹽酸小檗堿及丹皮酚。分別考察了不同洗脫體系（乙腈-水、乙腈- 磷酸溶液、甲醇- 水、甲醇- 磷酸溶液），以及不同梯度、不同比例的洗脫條件，不同柱溫（25，30，35 ℃），不同品牌色譜柱（Waters Xterra C18柱、Agilent Zorbax C18柱、Ultimate XB-C18柱），不同濃度提取溶劑（甲醇、50%甲醇、80%甲醇），不同提取時(shí)間（35，40，45 min）的提取效果，最終確定為2.2.1項(xiàng)下色譜條件。

3.3 指標(biāo)性成分選擇

參照2020 年版《中國(guó)藥典（一部）》［15］中單味中藥的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，黃連和黃柏、梔子、牡丹皮的指標(biāo)性成分分別為鹽酸小檗堿、梔子苷、丹皮酚，故確定采用高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定3種化學(xué)成分，以控制黃梔祛傷水的質(zhì)量。由表4 可知，3 批樣中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的平均含量分別為1.180 7，0.675 6，0.823 2 mg/mL，將其平均值的70%作為含量測(cè)定下限值，初步擬訂黃梔祛傷水中鹽酸小檗堿、梔子苷及丹皮酚的含量限度分別為0.83，0.47，0.58 mg/mL。

3.4 方法評(píng)價(jià)

本研究中建立的方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果準(zhǔn)確，靈敏度高，重復(fù)性好，擬訂的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為控制黃梔祛傷水的質(zhì)量提供了參考。