四黃栓制備工藝和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究*

吳安超，林詠梅，施婭妮，張 靜，陳軍亮

（云南省中醫(yī)醫(yī)院，云南 昆明 650100）

四黃軟膏由大黃、黃芩、黃連、黃柏、冰片5味中藥材組方，主要用于濕熱下注所致痔瘡、肛裂、肛漏、肛周腫痛或瘙癢、大便帶血，肛管炎見上述證候者。方中，大黃、黃連、黃柏、黃芩清熱解毒，散腫，化瘀止痛；冰片辛香走竄，散熱結(jié)，消腫痛，燥濕熱，具有去惡生新功效［1］。原方為云南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院肛腸科鐘傳珍教授的經(jīng)驗(yàn)方，臨床應(yīng)用療效明顯。但原制備工藝過于簡單，有效成分未經(jīng)提取純化，載藥量低，穩(wěn)定性較差，質(zhì)量難以控制。軟膏劑不易準(zhǔn)確定量，使用過程中易造成二次交叉污染，且換藥過程中極易造成傷口疼痛，藥物殘?jiān)鼫粲诟亻T，不利于痔瘡康復(fù)［2-3］。為此，本研究中將四黃軟膏的劑型改成栓劑，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化了處方藥材的醇提工藝，并建立了控制栓劑的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

BSA224S 型電子分析天平（德國Sartorius 公司，精度為0.1 mg）；R-300HL 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（瑞士步琦有限公司）；DLSB- /510型低溫冷卻液循環(huán)泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；DHG-9140A 型電熱鼓風(fēng)干燥箱（廣東泰宏君科學(xué)儀器股份有限公司）；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RBY-A型融變時(shí)限試驗(yàn)儀（上海黃海藥檢儀器有限公司）；島津LC-20AD型高效液相色譜儀（日本島津公司），配有LCsolution工作站，可變波長掃描紫外檢測器；硅膠H薄層板、硅膠G板、聚酰胺薄膜（青島海洋化工廠）。

1.2 試藥

鹽酸小檗堿對(duì)照品（批號(hào)為110713-201814，純度為86.8%），大黃對(duì)照藥材（批號(hào)為120984-201202），黃連對(duì)照藥材（批號(hào)為121752 - 201801），黃芩對(duì)照藥材（批號(hào)為120955 - 201810），黃柏對(duì)照藥材（批號(hào)為121510 - 201807），均購于中國食品藥品檢定研究院；大黃酸對(duì)照品（批號(hào)為DST20081909，純度為86.8%），黃芩苷對(duì)照品（批號(hào)為DST200601，純度不低于98%），均購于成都德思特生物技術(shù)有限公司；甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 提取浸膏中鹽酸小檗堿含量測定

2.1.1 色譜條件［1］

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（每100 mL中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，加磷酸調(diào)pH至4.0）-乙腈（50∶50，V/V）；流速：0.8 mL/ min；檢測波長：345 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 浸膏粉制備

以75%乙醇為提取溶劑，于75 ℃水浴加熱，回流提取，濾液置旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，回收乙醇，蒸至流浸膏狀，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，置105 ℃恒溫箱中烤干，得浸膏粉。

2.1.3 溶液制備

取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V），超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）20 min至完全溶解，得質(zhì)量濃度為0.19 mg/mL的對(duì)照品溶液。取浸膏粉，研成細(xì)粉，混勻，取0.1 g，精密稱定，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，搖勻，60 ℃水浴加熱15 min 使溶解，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）30 min，放至室溫，擦干錐形瓶外壁的水，稱定質(zhì)量，用甲醇- 鹽酸溶液（100∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取濾液，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋5倍，搖勻，以0.45 μm微孔濾膜濾過［1］，即得供試品溶液。

2.1.4 含量測定

分別取2.1.3 項(xiàng)下供試品溶液和對(duì)照品溶液，按2.1.1 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，用外標(biāo)法計(jì)算樣品中鹽酸小檗堿的含量。

2.2 制備工藝研究

2.2.1 提取工藝優(yōu)化

正交試驗(yàn)：采用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，以提取時(shí)間（因素A）、加溶劑量（因素B）、提取次數(shù)（因素C）為考察因素，每個(gè)因素設(shè)計(jì)3 個(gè)水平，因素與水平設(shè)計(jì)見表1。按處方量稱取大黃、黃連、黃柏和黃芩4味藥材9份，正交試驗(yàn)測定出膏率和浸膏中鹽酸小檗堿的含量，以二者為綜合指標(biāo)優(yōu)選最佳提取工藝。出膏率和浸膏中鹽酸小檗堿含量所占權(quán)重分別為0.4 和0.6，綜合評(píng)分=出膏率得分+鹽酸小檗堿含量得分［4］。正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。方差分析結(jié)果見表3。

表1 因素與水平Tab.1 Factors and levels of L9（33） orthogonal test

表2 L9（33）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果（n=9）Tab.2 Design and results of L9（33）orthogonal test（n=9）

表3 正交試驗(yàn)方差分析結(jié)果Tab.3 ANOVA results of orthogonal test

結(jié)果分析：由表2 可知，各因素對(duì)指標(biāo)影響程度由大至小依次為C > A > B，各因素對(duì)提取工藝的影響次序?yàn)锳1>A2>A3，B1>B3>B2，C3>C2>C1。由方差分析結(jié)果可知，提取次數(shù)對(duì)提取結(jié)果有顯著影響，提取時(shí)間在F0.1水平對(duì)提取結(jié)果有顯著影響，加溶劑量對(duì)提取結(jié)果無顯著影響。最終確定處方藥材最佳提取工藝為A1B1C3，即加8倍量處方藥材溶劑，回流提取3次，每次1 h。

最佳提取工藝驗(yàn)證：按10 倍處方量稱取藥材2 份，按最佳提取工藝進(jìn)行平行驗(yàn)證試驗(yàn)，計(jì)算得平均出膏率為23.38%，提取浸膏中鹽酸小檗堿含量為89.49 mg/g，說明優(yōu)選的提取工藝合理、穩(wěn)定、可行。

2.2.2 成型工藝研究

基質(zhì)選擇：根據(jù)處方藥物的性質(zhì)、常用基質(zhì)的特點(diǎn)，本研究中選擇評(píng)價(jià)以含藥栓外觀形狀、硬度、融變時(shí)限為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以36型、38型、36型 +38型（1∶1，m/m）混合脂肪酸甘油酯為栓劑基質(zhì)進(jìn)行考察，根據(jù)所得栓劑的外觀形狀是否光滑圓整、硬度是否適中、融變時(shí)限是否符合規(guī)定，選擇合適的基質(zhì)。由表4可知，36型+38型混合脂肪酸甘油酯按1∶1（m/m）混合時(shí)所得的栓劑外觀均勻，軟硬適中，融變時(shí)限符合2020 年版《中國藥典（四部）》規(guī)定。故選擇基質(zhì)為36型+38型混合脂肪酸甘油酯（1∶1，m/m）。

表4 基質(zhì)篩選Tab.4 Screening of the matrix

置換價(jià)測定：取36 型、38 型混合脂肪酸甘油酯各10 g，70 ℃加熱熔融后制成不含藥粉的空白栓10 粒，稱定質(zhì)量。取36型、38型混合脂肪酸甘油酯各7 g，加熱熔融，根據(jù)處方量稱取浸膏粉4.25 g，少量多次加入，不斷攪勻，于40 ℃注模，-5 ℃冷卻20 min，脫模取出，制成含藥粉栓劑10粒，稱定質(zhì)量。按公式計(jì)算本處方的置換價(jià)（DV），DV=W/［G-（M-W）］。其中，G為空白栓的平均質(zhì)量；M為含藥栓的平均質(zhì)量；W為每枚栓劑的平均含藥質(zhì)量。按G為 1.696 3 g，M為 1.814 9 g，W為0.425 0 g，計(jì)算得DV為1.39。按公式X=（G-W/DV）×n（n為預(yù)制栓劑枚數(shù)）計(jì)算制備含藥栓所需基質(zhì)的質(zhì)量。若制備100 枚四黃栓劑，需加入理論基質(zhì)質(zhì)量為140 g，即36型、38型混合脂肪酸甘油酯各70 g。實(shí)際操作中可能會(huì)有損失，故基質(zhì)使用量暫定為150 g，即36型、38型混合脂肪酸甘油酯各加入75 g。

2.2.3 四黃栓制備［5］

取浸膏粉、冰片，研細(xì)，過100 目篩，按處方量稱取浸膏粉42.5 g，冰片12.5 g，備用。取36 型、38 型混合脂肪酸甘油酯各75 g，置燒杯中，于70 ℃水浴加熱融化，少量多次加入浸膏粉，不斷攪勻，待溫度降至45 ℃時(shí)加入冰片，攪勻，于40 ℃條件下注模，-5 ℃冷卻20 min，取出，刮去溢出?？诓糠郑撃?，即得四黃栓（批號(hào)分別為2021022101，2021022102，2021022103）。

2.3 四黃栓質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

2.3.1 薄層色譜鑒別

大黃：取同一批（批號(hào)為2021022103）樣品10枚，將樣品切成小塊，混勻，取1.8 g（相當(dāng)于1 枚栓劑的量），置錐形瓶中，加入甲醇100 mL，超聲處理（功率為80 W，頻率為50 kHz）45 min，濾過，吸取5 mL 濾液，水浴加熱蒸干，殘?jiān)?0 mL 純化水，攪拌溶解，加入1 mL 鹽酸，水浴加熱回流45 min，取出，冷卻至室溫，轉(zhuǎn)移至分液漏斗，加20 mL 乙醚，振搖萃取，重復(fù)2 次，合并乙醚液，水浴蒸干，加入1 mL 三氯甲烷使溶解，濾過，即得供試品溶液［6］。取大黃對(duì)照藥材2 g，按供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。取大黃酸對(duì)照品適量，加甲醇溶解，制成質(zhì)量濃度為10 mg/mL 的對(duì)照品溶液［1］。按處方制備缺大黃的陰性對(duì)照藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液。按2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，將上述4 種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠H 板（黏合劑為羧甲基纖維素鈉）上，點(diǎn)樣量為5 μL，展開劑為石油醚（37 ℃）-乙酸乙酯-甲酸（15∶5∶1，V/V/V）的上層液，展開，烘干，用3%三氯化鋁顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。供試品溶液、對(duì)照品溶液、對(duì)照藥材溶液色譜在相應(yīng)位置顯相同的粉紅色熒光斑點(diǎn)，且缺大黃的陰性對(duì)照品溶液色譜無此斑點(diǎn)。詳見圖1 A。

黃連、黃柏［1］：取同一批（批號(hào)為2021022103）樣品10枚，切成小塊，混勻，取1.8 g（相當(dāng)于1枚栓劑的量），置錐形瓶中，加100 mL 75%乙醇溶液，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，放入 - 5 ℃冰箱冷凍4 h，搖勻，濾過，取續(xù)濾液2 mL，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋，定容于10 mL 容量瓶中，制得供試品溶液。取黃連、黃柏對(duì)照藥材粉末（過20目篩）各0.5 g，精密稱定，置三角瓶中，加100 mL 75%乙醇溶液，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，靜置，濾過，取濾液20 mL，水浴蒸干，加2 mL 甲醇- 鹽酸溶液（100∶1，V/V）使溶解，即得對(duì)照藥材溶液。取鹽酸小檗堿對(duì)照品，精密稱定，加甲醇 -鹽酸溶液（100∶1，V/V），搖勻，完全溶解，即得質(zhì)量濃度為0.19 mg/mL 的鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液。按處方制備缺黃連、黃柏的陰性對(duì)照藥材，按供試品溶液制備方法制備缺黃連、黃柏的陰性對(duì)照品溶液。照2020 年版《中國藥典（四部）》通則0502 薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，吸取上述5 種溶液各適量，點(diǎn)于同一硅膠G 板上，點(diǎn)樣量為5 μL，先用濃氨試液預(yù)飽和10 min，展開劑為氨水-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇（12.5∶6∶3∶2∶1.5，V/V/V/V/V），展開，取出，烘干，置紫外光燈（365 nm）下檢視［1］。供試品溶液與鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液、黃連對(duì)照藥材溶液、黃柏對(duì)照藥材溶液、缺黃連陰性對(duì)照品溶液和缺黃柏陰性對(duì)照品溶液色譜在對(duì)應(yīng)位置顯相同的熒光綠色斑點(diǎn)；黃連對(duì)照藥材和缺黃柏陰性對(duì)照品溶液色譜中還有2 個(gè)亮黃色的斑點(diǎn)，黃柏對(duì)照藥材和缺黃連的陰性對(duì)照品溶液色譜中無亮黃色斑點(diǎn)，陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 B。

圖1 薄層色譜圖（365 nm）1.Reference solution 2.Test solution 3.Negative reference solution 4，4′.Phellodendri Chinensis Cortex and Coptidis Rhizoma reference medicinal materials solution 5，5′.Negative reference solution lacking Phellodendri Chinensis Cortex and Coptidis RhizomaA.Rhei Radix et Rhizoma B.Coptidis Rhizoma and Phellodendri Chinensis Cortex C.Scutellariae RadixFig.1 TLC chromatograms（365 nm）

黃芩：取同一批（批號(hào)為2021022103）樣品10枚，計(jì)算平均裝量，將樣品切成小塊，混勻，取1.8 g（相當(dāng)于1 枚栓劑的量），置錐形瓶中，加75%乙醇100 mL，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，溶解，濾過，濾液水浴蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，濾過，即得供試品溶液［1］。稱取黃芩對(duì)照藥材1 g，參照供試品溶液制備方法制備對(duì)照藥材溶液。取黃芩苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇溶液，搖勻，使完全溶解，制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL 的黃芩苷對(duì)照品溶液。按處方制備不含黃芩的對(duì)照陰性藥材，按供試品溶液制備方法制備陰性對(duì)照品溶液［1，7］。參照2020年版《中國藥典（四部）》通則0502薄層色譜法進(jìn)行試驗(yàn)，將上述4種溶液分別點(diǎn)于同一硅膠H板（65 ℃烤箱烘烤30 min）上，點(diǎn)樣量為3 μL，先預(yù)飽和15 min，以正丁醇 - 冰醋酸 - 水（7∶1∶2，V/V/V）為展開劑，展開，烘干，噴顯色劑三氯化鐵，顯色，置紫外光燈（365 nm）下檢視［8］。供試品溶液與對(duì)照藥材溶液、對(duì)照品溶液色譜對(duì)應(yīng)位置上顯相同的橘黃色斑點(diǎn)，且陰性對(duì)照無干擾。詳見圖1 C。

2.3.2 鹽酸小檗堿含量測定

1）色譜條件［1］

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm × 4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（每100 mL中加0.4 g 十二烷基硫酸鈉，加磷酸調(diào)pH 至4.0）- 乙腈（50∶50，V/V）；流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；檢測波長：345 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2）溶液制備

取鹽酸小檗堿對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V）超聲（功率為120 W，頻率為65 kHz）20 min 至完全溶解，配制成質(zhì)量濃度為200.97 μg/mL的對(duì)照品溶液。取樣品10 枚，切碎混勻，取0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加甲醇 -鹽酸溶液（100∶1，V/V）100 mL，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率為120 W，頻率為65 kHz）45 min，放至室溫，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）補(bǔ)足減失的質(zhì)量，放入-5 ℃冰箱內(nèi)冷凍4 h，待基質(zhì)全部析出，取出，搖勻，迅速濾過，濾液放至室溫，用甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）稀釋5 倍，即得供試品溶液［9］。按處方工藝稱取缺黃連、黃柏的其余藥材，按四黃栓制備方法制備空白栓劑，按供試品溶液制備方法制備缺黃連、黃柏的陰性對(duì)照品溶液。

3）方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)：分別取對(duì)照品溶液和供試品溶液各適量，按2.3.2項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果鹽酸小檗堿峰的理論板數(shù)不低于3 000，陰性對(duì)照品溶液中無干擾峰出現(xiàn)，對(duì)照品溶液與供試品溶液中，鹽酸小檗堿峰的保留時(shí)間一致，鹽酸小檗堿峰周圍無干擾峰，分離度好，方法專屬性良好。色譜圖見圖2。

圖2 高效液相色譜圖1.Berberine hydrochlorideA.Reference solution B.Test solution C.Negative reference solution lacking Coptidis Rhizoma and Phellodendri Chinensis CortexFig.2 HPLC chromatograms

線性關(guān)系考察：取溶液制備項(xiàng)下對(duì)照品溶液，加甲醇 - 鹽酸溶液（100∶1，V/V）分別稀釋至質(zhì)量濃度為10.049，20.097，40.194，60.291，80.388，100.485 μg/mL的系列溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣測定。以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=43 307X+17 865（R2=1.000 0，n=6）。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿質(zhì)量濃度在10.049～100.485 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。

日內(nèi)、日間精密度試驗(yàn)：分別取線性關(guān)系考察項(xiàng)下鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液（質(zhì)量濃度為60.291，10.049 μg/mL），按擬訂色譜條件1 d 內(nèi)連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6 次；連續(xù)3 d，每天進(jìn)樣測定2次。結(jié)果鹽酸小檗堿峰面積的平均值分別為 2 637 859 和 444 360，RSD分別為 0.06% 和 0.16%（n=6），表明儀器日內(nèi)、日間精密度良好。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批（批號(hào)為2021022103）樣品10 枚，切碎，取6 份，每份 0.5 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果鹽酸小檗堿含量的平均值為18.78 mg/ g，RSD為0.41%（n=6），表明方法重復(fù)性良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取重復(fù)性試驗(yàn)項(xiàng)下供試品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件分別于4，8，12，16，20，24 h 時(shí)進(jìn)樣測定。結(jié)果峰面積的平均值為834 180，RSD為0.19%（n=6），表明供試品溶液在室溫下24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

加樣回收試驗(yàn)：取鹽酸小檗堿含量為18.82 mg/g的樣品（批號(hào)為20210212103）6份，精密稱定，根據(jù)栓劑樣品中鹽酸小檗堿含量，按1∶1（m/m）加入對(duì)照品溶液，依法制得供試品溶液，按2.3.2 項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果見表5。

表5 鹽酸小檗堿加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n=6）Tab.5 Results of recovery test of berberine hydrochloride（n=6）

4）樣品含量測定

取3 批樣品，各10 枚，切碎，依法制備供試品溶液，擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，并計(jì)算含量。結(jié)果見表6。以本品中含黃連、黃柏以鹽酸小檗堿計(jì)，暫訂本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)確定的含量限度，不得少于18.58 mg/g。

表6 樣品含量測定結(jié)果Tab.6 Results of content determination of samples

3 討論

3.1 含量測定指標(biāo)性成分選擇

中藥復(fù)方制劑成分復(fù)雜，通常只對(duì)主要有效成分進(jìn)行定性、定量鑒別［10］。四黃栓由大黃、黃芩、黃連、黃柏等中藥組方，具有清熱利濕、活血化瘀、消腫止痛功效，用于治療痔瘡及肛門各種炎癥。黃連、黃柏中主要抑菌成分為小檗堿，選取小檗堿為主要代表成分進(jìn)行含量測定以保證藥栓的藥效，同時(shí)參照2020年版《中國藥典（一部）》黃連羊肝丸、黃連上清片、清胃黃連丸（水丸）等復(fù)方中成藥的含量測定方法［7］。故選擇鹽酸小檗堿作為含量測定的指標(biāo)性成分。

3.2 正交試驗(yàn)考察指標(biāo)選擇

藥材的提取出膏率是衡量中藥材提取是否完全和有效成分是否完全轉(zhuǎn)移的重要指標(biāo)，也是提取工藝優(yōu)化的重要考察指標(biāo)。中藥復(fù)方制劑成分較復(fù)雜，單一指標(biāo)往往不能衡量工藝的好壞，有效成分含量常作為提取浸膏考察指標(biāo)。故選擇出膏率和主要活性成分鹽酸小檗堿的含量作為提取工藝正交試驗(yàn)的綜合評(píng)價(jià)指標(biāo)。

3.3 供試品溶液配制溶劑選擇

從基質(zhì)中提取分離有效成分是供試品溶液處理的關(guān)健，同時(shí)還要最大程度地降低基質(zhì)對(duì)儀器測定的干擾［11-12］。本研究中四黃栓使用的基質(zhì)為36型+38型混合脂肪酸甘油酯（1∶1，m/m），溶于甲醇、乙醇，不溶于水。因此，在制備供試品溶液時(shí)，先測定目標(biāo)成分的極性和酸堿性等。提取堿性成分時(shí)，先用酸性試劑提取，再用酸水使其游離，最后用適當(dāng)極性的有機(jī)溶劑反復(fù)萃取，達(dá)到除雜的目的。本研究中采用甲醇、75%乙醇提取栓劑中有效成分，薄層鑒定結(jié)果良好［13-14］。供試品溶液配制過程中，加甲醇-鹽酸溶液（100∶1，V/V）超聲（功率為300 W，頻率為54 kHz，20 ℃）處理1 h，基質(zhì)和鹽酸小檗堿完全溶解，加鹽酸有助于游離鹽酸小檗堿，放入- 0.5 ℃冰箱內(nèi)冷凍4 h，基質(zhì)全部析出，可達(dá)到去除基質(zhì)的目的。

3.4 定性鑒別條件選擇

黃連、黃柏的薄層鑒別時(shí)，鹽酸小檗堿熒光綠色斑點(diǎn)下方存在黃色斑點(diǎn)，曾用不同展開劑分離斑點(diǎn)，但分離效果不理想。最終以氨水-甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇（12.5∶6∶3∶2∶1.5，V/V/V/V/V）為展開劑，因鹽酸小檗堿呈堿性，在展開槽另一邊放置等體積的濃氨試液飽和10 min 后再展開，可明顯改善斑點(diǎn)的形狀，但飽和時(shí)間不能過長，否則其斑點(diǎn)會(huì)呈扁圓形，甚至變?yōu)橐粭l短線［15］。黃芩薄層鑒別時(shí)，因黃芩苷具有一定酸性，故展開劑中需要添加酸性成分，以減少拖尾現(xiàn)象［16］。參照2020 年版《中國藥典（一部）》黃芩薄層鑒別項(xiàng)下方法，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-甲酸（10∶3∶1∶2，V/V/V/V）為展開劑，斑點(diǎn)基本分離，但可能由于展開劑極性太小，黃芩苷的比移值過小，斑點(diǎn)基本處于基線，達(dá)不到分離要求。通過調(diào)整展開劑的酸度、極性等，分離效果、拖尾現(xiàn)象明顯改善，結(jié)合文獻(xiàn)［8］，以正丁醇-冰醋酸 - 水（7∶1∶2，V/V/V）為展開劑，噴以三氯化鐵顯色，進(jìn)行黃芩薄層色譜鑒別。結(jié)果黃芩苷對(duì)照品溶液色譜斑點(diǎn)與供試品溶液色譜中黃芩苷的斑點(diǎn)在一條直線上，顯色結(jié)果明了、直觀，容易判斷。

3.5 含量測定方法選擇

2020 年版《中國藥典（一部）》中黃連、黃柏含量測定項(xiàng)下測定鹽酸小檗堿含量的色譜條件中，流動(dòng)相均采用0.05 mol/L 磷酸二氫鉀溶液（每100 mL 中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，加磷酸調(diào)節(jié)pH至4.0）-乙腈（50∶50，V/V），黃連和黃柏中小檗堿的檢測波長分別為345 nm和265 nm［1］。查閱文獻(xiàn)［17-20］，以保留時(shí)間和分離度為指標(biāo)，反復(fù)調(diào)整流動(dòng)相系統(tǒng)。十二烷基硫酸鈉（每100 mL含0.4 g）在0.05 mol/ L 磷酸二氫鉀溶液中不易溶解，需加熱才能溶解，但冷卻后又析出形成渾濁液。將磷酸二氫鉀換成磷酸二氫鈉，調(diào)整流動(dòng)相比例［0.05 mol/L磷酸二氫鈉 - 乙腈（50∶50，60∶40，55∶45，V/V）］和流速（0.6，0.7，0.8，0.9，1.0 mL/ min），鹽酸小檗堿峰與雜質(zhì)峰分離較好。最終采用本研究中確定的色譜條件。