兒童急性淋巴細(xì)胞白血病中RAS基因突變的檢測及其臨床意義

姚燕玲 王西閣 趙雪蓮 李帥全 周玉潔 徐一卓

（鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院血液科，河南鄭州 450052）

RAS信號通路控制著細(xì)胞增殖、分化與凋亡，當(dāng)RAS基因突變時，細(xì)胞非依賴性增殖，轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘?xì)胞［1-2］。RAS基因編碼RAS蛋白，RAS蛋白分別與二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）、三磷酸鳥苷（guanosine triohosphate，GTP）結(jié)合，將促進(jìn)生長的信號從細(xì)胞膜傳遞到細(xì)胞核，起到細(xì)胞“開關(guān)”的作用。生理情況下，鳥嘌呤核苷酸交換因子促進(jìn)GDP向GTP轉(zhuǎn)換，激活下游通路，使細(xì)胞增殖。GTP酶激活蛋白（GTPase-activating protein，GAP）可提高RAS蛋白的內(nèi)在GTP酶活性，促進(jìn)GTP水解為GDP。通過GAP引起的RAS活性失活是RAS等位基因致癌突變中最常見的體細(xì)胞突變靶點。RAS基因位點G61的致癌突變降低了RAS蛋白的內(nèi)在GTP酶活性，而位點G12、G13通過空間位阻阻礙RAS與GAP之間形成范德華鍵，從而降低GTP水解水平［3-5］。近年來，隨著基因測序技術(shù)日益精進(jìn)，RAS基因得到越來越多的關(guān)注，如RAS基因突變常作為亞克隆發(fā)生在骨髓增生異常綜合征疾病晚期；骨髓纖維化疾病中，RAS基因突變常與外周血單核細(xì)胞水平升高、血小板計數(shù)減低、骨髓原始細(xì)胞比例升高等有關(guān)，影響該病的總生存（overall survival，OS）率［6-7］。既往研究表明，在急性淋巴細(xì)胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）患兒中，RAS基因突變與藥物反應(yīng)差、低無病生存率、高復(fù)發(fā)風(fēng)險有關(guān)［8-9］。本研究使用二代測序方法，分析了ALL中RAS基因突變患兒的臨床特征和實驗室檢查，及其對OS率的影響。

1 資料與方法

1.1 研究對象

回顧性收集2015年1月至2020年1月就診于鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院并完成二代測序的初治ALL患兒120例的臨床資料，其中男性65例（54.2%），女性55例（45.8%）。急性B淋巴細(xì)胞白血?。╝cute B lymphoblastic leukemia，B-ALL）105例，急性T淋巴細(xì)胞白血?。╝cute T lymphoblastic leukemia，T-ALL）15例。根據(jù)是否存在RAS基因突變分為RAS基因突變組和RAS基因陰性組。

1.2 RAS基因突變的檢測

采集初治ALL患兒2 mL骨髓標(biāo)本，用二代測序法檢測RAS基因全外顯子序列的單核苷酸變異、小片段插入/缺失，平均測序深度為2 000×，測序后原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析，篩選致病性基因突變位點。

1.3 免疫學(xué)分型

將患兒2 mL骨髓樣本放入流式細(xì)胞儀中，設(shè)門分析異常細(xì)胞，應(yīng)用單克隆抗體對白血病細(xì)胞表面抗原進(jìn)行標(biāo)記，根據(jù)免疫學(xué)標(biāo)志進(jìn)行分型。

1.4 染色體核型分析

取患兒2 mL骨髓標(biāo)本放入肝素抗凝管中，進(jìn)行植物血凝素短期培養(yǎng)后立即制片，收集有絲分裂的骨髓中期細(xì)胞，行吉姆薩染色并顯帶分析，放入染色體分析儀中，分析并描述染色體核型。

1.5 融合基因檢測

取患兒2 mL骨髓標(biāo)本，放入EDTA-K2抗凝管中，TRIzol法提取有核細(xì)胞RNA，使用基因擴(kuò)增儀（杭州博日Life Pro擴(kuò)增儀）、科研用ALL融合基因檢測試劑盒（美國OMEGA公司生產(chǎn)），在多重巢式RT-PCR技術(shù)下，檢測常見的15種融合基因，包括：MLL/AF4、SIL/TAL1、ETV6/RUNX1、dupMLL、MLL/ENT、E2A/PBX1、SET/CAN、BCR/ABL、TLS/ERG、E2A/HLF、CALM/AF10、HOX11L2、HOX11、MLL/AF10、NPM/ALK。

1.6 隨訪

隨訪截止時間為2021年4月30日，通過住院病歷、門診病歷和電話獲得患兒情況。OS期指自診斷日期至死亡或隨訪截止日期。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 26.0軟件完成統(tǒng)計學(xué)分析。非正態(tài)分布計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）［M（P25，P75）］表示，組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；計數(shù)資料采用例數(shù)和百分率（%）表示，率的比較采用卡方檢驗或Fisher確切概率法。生存分析用Kaplan-Meier法，采用log-rank法進(jìn)行單因素分析，將單因素分析中P＜0.1的影響因素納入Cox風(fēng)險比例回歸模型進(jìn)行多因素分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAS基因突變情況

120例ALL患兒中，RAS基因突變35例（29.2%），其中僅KRAS基因突變30例（25.0%），NRAS基因突變伴KRAS基因突變5例（4.2%）。RAS基因突變在B-ALL患兒中檢出率為33.3%（35/105），未在T-ALL患兒中檢出。全部（5/5）NRAS基因突變和57%（20/35）KRAS基因突變均發(fā)生于第12號密碼子上，14%（5/35）KRAS基因突變發(fā)生于第13號密碼子上，29%（10/35）KRAS基因突變發(fā)生于其他密碼子上，未發(fā)現(xiàn)第61號密碼子突變。

2.2 RAS基因突變組和RAS基因陰性組臨床特征比較

RAS基因突變組與RAS基因陰性組在性別、診斷年齡、危險度分型、髓外浸潤等方面差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。RAS基因突變組B-ALL比例、染色體核型異常比例高于RAS基因陰性組，初診白細(xì)胞數(shù)計數(shù)低于RAS基因陰性組（P＜0.05）。見表1。

表1 RAS基因突變組和RAS基因陰性組臨床特征比較

2.3 伴RAS基因突變ALL患兒預(yù)后的影響因素分析

中位隨訪時間為18（9，35）個月，失訪11例（9.2%）。隨訪109例ALL患兒中，死亡16例（14.7%）；5例（4.6%）患兒有中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)，其中伴RAS基因突變1例。RAS基因突變患兒2年OS率為54%±13%，低于RAS基因陰性患兒（89%±4%，χ2=5.422，P=0.020）（圖1）。35例RAS基因突變患兒中位隨訪時間17.5（7.5，24.8）個月，失訪9例。隨訪26例患兒中，死亡7例（27%），1例（4%）出現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)復(fù)發(fā)。單因素分析顯示，WT1基因過表達(dá)、初診白細(xì)胞計數(shù)可影響伴RAS基因突變ALL患兒的預(yù)后（P＜0.05），見表2。

表2 影響伴RAS基因突變ALL患兒預(yù)后的單因素分析

將單因素分析中P＜0.1的影響因素納入Cox風(fēng)險比例回歸模型進(jìn)行多因素分析顯示，WT1基因過表達(dá)、初診白細(xì)胞計數(shù)＞50×109/L為伴RAS基因突 變ALL患兒預(yù)后不良的影響因素（P＜0.05），見表3。

表3 影響伴RAS基因突變ALL患兒預(yù)后因素的Cox風(fēng)險比例回歸模型分析

3 討論

RAS基因可分為3種：NRAS、KRAS、HRAS基因。Wiemels等［10］的研究中，RAS基因在191例ALL患兒中的檢出率為20%。有報道稱NRAS基因突變較常見，發(fā)生率為6%［8］。RAS基因點突變多見于第12、13、61號密碼子［8，11］。本研究中僅KRAS基因突變檢出率25.0%（30/120），NRAS基因突變檢出率4.2%（5/120），多于第12、13號密碼子發(fā)生點突變，與上述研究基本相符。

本研究中B-ALL患兒RAS基因突變率高于T-ALL患兒，和Wiemels等［12］研究基本一致，但另一項研究表明RAS基因突變率在B-ALL和T-ALL中無差異［10］。也有研究證實RAS基因突變在早期前體T-ALL中達(dá)到三分之二以上，而在非早期前體T-ALL中只有19%［13］。本研究并未在T-ALL中檢出RAS基因突變。結(jié)果不一致的原因可能有：（1）患兒構(gòu)成有差異；（2）樣本量限制；（3）檢測方法不同。既往研究表明，RAS基因突變患兒高危分型比例高于RAS基因未突變患兒［14］，本研究中未得出有差異的結(jié)果。英國一項小規(guī)模研究納入86例ALL患兒，結(jié)果顯示，RAS基因突變與初診白細(xì)胞計數(shù)較高等相關(guān)［15］。本研究中RAS基因突變患兒初診白細(xì)胞數(shù)未明顯升高，可能與患兒構(gòu)成差異造成數(shù)據(jù)結(jié)果偏倚有關(guān)。我們分析初診白細(xì)胞計數(shù)升高原因可能為：與其他正常兒童細(xì)胞相比，RAS基因在外周血白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞和骨髓細(xì)胞中相對活化［16］。在超二倍體亞組中，RAS基因突變組的初診白細(xì)胞計數(shù)高于RAS基因陰性組；在非超二倍體亞組中，RAS基因突變與初診白細(xì)胞計數(shù)無關(guān)，這表明RAS基因和高超二倍體之間有極其強(qiáng)烈的關(guān)聯(lián)［12］。Holmfeldt等［17］研究表明，ALL患者中，三分之二以上的單倍體患兒存在RAS基因突變，低亞二倍體和近二倍體患兒則較少發(fā)生RAS基因突變。本研究中，RAS基因突變患兒染色體核型多正常。造成結(jié)果不同的原因可能是不同隊列的患兒構(gòu)成比不同。

迄今所報道的RAS基因?qū)︻A(yù)后的影響，尚存爭議。美國一項納入870例ALL患者的研究顯示，RAS基因突變對無事件生存率、無病生存率或OS率無影響［11］。Zhang等［18］和Irving等［19］研究指出RAS基因突變常與ALL復(fù)發(fā)有關(guān)。但Case等［15］研究表明，兒童ALL診斷和復(fù)發(fā)時RAS基因突變率相似，意味著RAS基因突變不是ALL復(fù)發(fā)的危險因素。本研究得出，RAS基因突變可影響ALL患兒的OS率。伴RAS基因突變ALL患兒合并WT1基因過表達(dá)、初診白細(xì)胞數(shù)計數(shù)＞50×109/L時，預(yù)后更差。我們分析RAS基因突變影響預(yù)后的原因可能有：（1）RAS基因突變多與預(yù)后不良基因變異（IKZF1基因缺失、TP53基因突變、FLT3基因突變等）同時發(fā)生；（2）RAS基因突變在復(fù)發(fā)時常見；（3）RAS基因突變患兒對化療藥物耐藥。既往研究已證實，伴RAS基因突變的患兒在體外對糖皮質(zhì)激素的抵抗力更強(qiáng)［20］。在存活率更低的KRAS基因突變細(xì)胞中，對長春新堿治療的敏感性可重復(fù)增加，相反，KRAS基因突變細(xì)胞對甲氨蝶呤有抗藥性，且雙KRAS基因密碼子點突變的表達(dá)比單一KRAS基因密碼子點突變的表達(dá)誘導(dǎo)了更高水平的MAPK磷酸化和更強(qiáng)的甲氨蝶呤抗藥性，所以，MEK抑制劑等相關(guān)藥物得到了越來越多的關(guān)注［21］。

綜上所述，本研究表明RAS基因突變患兒多是B-ALL，初診白細(xì)胞計數(shù)無明顯升高，對化療藥物可能出現(xiàn)耐藥性，預(yù)后不良。在患兒初治時即完善相關(guān)基因突變檢查，明確有無RAS基因突變，對是否服用相關(guān)激酶抑制劑藥物有一定指導(dǎo)意義。但本研究結(jié)果仍需要大樣本多中心研究進(jìn)一步證實。