低糖缺氧大鼠H9C2細(xì)胞中長(zhǎng)鏈非編碼RNA NR_027324和miR-103-3p的表達(dá)及靶向調(diào)節(jié)關(guān)系驗(yàn)證

孟慶坤 譚 昊 顧 卉 駱佳瑩 孫志軍*

長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）為一類(lèi)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度＞200 nt，且不具備編碼蛋白質(zhì)能力的非編碼RNA[1]。lncRNA參與心肌梗死的病理生理過(guò)程[2-6]。其調(diào)控功能主要取決于各種表觀遺傳學(xué)調(diào)控機(jī)制，包括轉(zhuǎn)錄調(diào)控，轉(zhuǎn)錄后基因調(diào)控，競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源性RNA，蛋白質(zhì)翻譯后基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及核區(qū)室化[7]。微小RNA（miRNA）是一類(lèi)轉(zhuǎn)錄長(zhǎng)度為20～25 nt的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)互補(bǔ)配對(duì)至靶基因mRNA的3'UTR區(qū)域，形成RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物，進(jìn)而降解靶基因mRNA或抑制靶基因mRNA翻譯[8]。競(jìng)爭(zhēng)性?xún)?nèi)源RNA（ceRNA）學(xué)說(shuō)認(rèn)為，lncRNA可以作為miRNA的靶點(diǎn)，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA的方式，減弱miRNA對(duì)其靶基因mRNA的抑制作用。研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA在大鼠心肌梗死邊緣區(qū)有大量差異表達(dá)[9]。在既往芯片數(shù)據(jù)中選取差異表達(dá)的NR_027324作為研究對(duì)象，重注釋分析發(fā)現(xiàn)NR_027324為H19基因的一段，通過(guò)生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)NR_027324調(diào)節(jié)miR-103-3p表達(dá)。已有研究表明miR-103-3p能夠調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡[10]，因此推測(cè)NR_027324有可能通過(guò)調(diào)節(jié)miR-103-3p影響心肌細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)低糖缺氧處理大鼠H9C2細(xì)胞模擬心肌缺血，對(duì)上述NR_027324靶向調(diào)節(jié)miR-103-3p表達(dá)的假設(shè)進(jìn)行驗(yàn)證。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

大鼠H9C2心肌細(xì)胞及293T細(xì)胞：萬(wàn)類(lèi)生物技術(shù)有限公司，沈陽(yáng)，中國(guó)。lncRNA及miRNA載體：Dharmacon，美國(guó)。轉(zhuǎn)染試劑：QIAGEN，美國(guó)。KGAF040熒光素酶檢測(cè)試劑盒：凱基生物，中國(guó)。DMEM培養(yǎng)基：Hyclone，美國(guó)。胎牛血清：Invitrogen，美國(guó)。RNeasy Mini Kit：Qiagen，德國(guó)。Trizol agent和LipofectamineTM2000：Invitrogen，美國(guó)。PrimeScript?RT reagent Kit with gDNAEraser（PerfectRealTime）：寶生物工程（大連）有限公司，大連，中國(guó)。SYBR?Premix ExTaq? Ⅱ（TliRNaseHPlus）：寶生物工程（大連）有限公司，大連，中國(guó)。特異性PCR引物：生工生物工程（上海）股份有限公司，上海，中國(guó)。全蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ATG5抗體、β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗、ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒：萬(wàn)類(lèi)生物技術(shù)有限公司，沈陽(yáng)，中國(guó)。

1.2 方法

1.2.1 H9C2細(xì)胞培養(yǎng)和低糖缺氧模型構(gòu)建 正常培養(yǎng)：于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞。低糖缺氧培養(yǎng)：將H9C2心肌細(xì)胞置于37 ℃、缺氧（1% O2）、94% N2、5% CO2濃度與低糖（1.0 g/L葡萄糖）的培養(yǎng)箱培養(yǎng)6 h。

1.2.2 H9C2細(xì)胞NR_027324與rno-miR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè) 檢索網(wǎng)站https://www.ncbi.nlm.nih.gov/給出的rno-lncRNA-NR_027324序列信息。檢索生物信息學(xué)網(wǎng)站：https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid/在線(xiàn)分析rno-lncRNA-NR_027324與rnomiR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)。

1.2.3 使用293T細(xì)胞進(jìn)行雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)NR_027324與rno-miR-103-3p靶向結(jié)合 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)293T細(xì)胞。將NR_027324連入pmirGLO雙熒光素酶報(bào)告載體（wt），并對(duì)NR_027324可能的靶點(diǎn)突變（mut），將突變的NR_027324設(shè)置為對(duì)照。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明，將合成的miR-103-3p類(lèi)似物（miR-103-3p-mimic）、miR-103-3p類(lèi)似物陰性對(duì)照（mimic-NC），與上述重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞。將上述報(bào)告載體和類(lèi)似物按以下組合方式共轉(zhuǎn)染：pGL-lncRNA-NR_027324 wt+mimic-NC；pGLlncRNA-NR_027324wt+miR-103-3p-mimic；pGLlncRNA-NR_027324mut+mimic-NC；pGL-lncRNANR_027324mut+miR-103-3p-mimic。每組設(shè)置3個(gè)平行孔，并重復(fù)3次。在轉(zhuǎn)染48 h后，按照KGAF040熒光素酶檢測(cè)試劑盒的操作步驟，進(jìn)行雙熒光素酶實(shí)驗(yàn)，測(cè)定熒光素酶活性后，計(jì)算比值并比較各組差異。

1.2.4 對(duì)H9C2細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和干擾NR_027324的表達(dá) 于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，依照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒的操作步驟，將合成的NR_027324過(guò)表達(dá)質(zhì)粒（Lncm）、空質(zhì)粒對(duì)照（Epc）、si-NR_027324干擾重組質(zhì)粒（si-Lnc）、si-NR_027324-NC干擾陰性對(duì)照（si-Lnc-NC）分別轉(zhuǎn)染H9C2細(xì)胞，設(shè)置正常對(duì)照。分組如下：Con，正常對(duì)照組；Epc，空質(zhì)粒組；Lncm，lncRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組；si-Lnc-NC，干擾lncRNA對(duì)照組；si-Lnc，干擾lncRNA組。轉(zhuǎn)染24 h后進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.5 H9C2細(xì)胞總RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè) 收集生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞，參照說(shuō)明書(shū)步驟使用Trizol agent試劑盒提取總RNA。分別使用mRNA和miRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑，從總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA模板。其中rno-miR-103-3p以5S為內(nèi)參基因，rno-lncRNA-NR_027324、ATG5以β-actin為內(nèi)參基因。按操作說(shuō)明進(jìn)行qRT-PCR，采用2-△△Ct法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，特異PCR反應(yīng)引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR反應(yīng)引物序列

1.2.6 H9C2細(xì)胞使用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)蛋白表達(dá) 收集各組細(xì)胞，按照全蛋白提取試劑盒的操作步驟，裂解得到總蛋白。使用BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，按照說(shuō)明測(cè)量蛋白質(zhì)的濃度和純度。每泳道40 μg的蛋白質(zhì)樣品在SDS-PAGE凝膠（10%）上分離，然后轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下，在5%脫脂牛奶中將膜封閉2 h，然后與一抗孵育，在4 ℃下過(guò)夜。然后用TBST將膜洗滌3次，在37 ℃下與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗孵育45 min，然后進(jìn)一步用TBST洗滌6次。最后，使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒檢測(cè)印跡，掃描膠片，使用凝膠圖像處理系統(tǒng)（Gel-Pro-Analyzer軟件）對(duì)目標(biāo)條帶的光密度值進(jìn)行分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，所有符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析和事后比較-最小顯著性差異法t檢驗(yàn)（post-hoc LSD-t檢驗(yàn)）進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 低糖缺氧H9C2心肌細(xì)胞中NR_027324、miR-103-3p、ATG5（mRNA）的表達(dá)量變化

結(jié)果顯示，與正常培養(yǎng)H9C2細(xì)胞中NR_027324的mRNA相對(duì)表達(dá)量1.00±0.04相比，低糖缺氧培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞中NR_027324的mRNA相對(duì)表達(dá)量為2.03±0.15，明顯上調(diào)（P＜0.001）。正常培養(yǎng)H9C2細(xì)胞miR-103-3p的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.02，低糖缺氧培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞為0.44±0.06，miR-103-3p的相對(duì)表達(dá)量明顯下降（P＜0.001）。正常培養(yǎng)H9C2細(xì)胞中ATG5的相對(duì)表達(dá)量為1.00±0.06，低糖缺氧培養(yǎng)的H9C2中ATG5的相對(duì)表達(dá)量為2.15±0.04，表達(dá)量明顯上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見(jiàn)圖1。

圖1 低糖缺氧H9C2心肌細(xì)胞中NR_027324、miR-103-3p、ATG5（mRNA）的表達(dá)量變化

2.2 H9C2細(xì)胞rno-lncRNA-NR_027324與rno-miR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)預(yù)測(cè)和基于293T細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告結(jié)果

檢索生物信息學(xué)網(wǎng)在線(xiàn)分析H9C2細(xì)胞中rno-lncRNA-NR_027324與rno-miR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)序列為AUGCUG見(jiàn)圖2，并據(jù)此設(shè)計(jì)合成突變型載體的序列為UACGAC。使用基于293T細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。共轉(zhuǎn)染pmirGLO-NR_027324wt 3'UTR + miR-103-3p-mimic相對(duì)熒光素酶活性（0.55±0.06），與共轉(zhuǎn)染pmirGLO-NR_027324wt 3'UTR+mimic-NC相對(duì)熒光素酶活性（1.00±0.11）比較，活性顯著下降（P＜0.05）。共轉(zhuǎn)染克隆有結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變pmirGLONR_027324mut 3'UTR質(zhì)粒+miR-103-3p-mimic的相對(duì)熒光素酶活性（0.96±0.10），與共轉(zhuǎn)染pmirGLONR_027324mut 3'UTR+mimic-NC（0.98±0.11）、pmirGLO-NR_027324wt 3'UTR+ mimic-NC（1.00±0.11）比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖2 利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)H9C2細(xì)胞rno-lncRNA-NR_027324與rno-miR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)及實(shí)驗(yàn)突變型載體位點(diǎn)

圖3 基于293T細(xì)胞的雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)中，共轉(zhuǎn)染載體和類(lèi)似物后相對(duì)熒光素酶活性的變化

2.3 對(duì)H9C2細(xì)胞進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過(guò)表達(dá)和干擾NR_027324的表達(dá)對(duì)miR-103-3p、ATG5表達(dá)的影響

NR_027324、miR-103-3p、ATG5的mRNA相對(duì)表達(dá)量在空質(zhì)粒組較正常對(duì)照組均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。NR_027324的相對(duì)表達(dá)量在lncRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組（4.31±0.40）與空質(zhì)粒組（1.02±0.05）比較顯著升高（P＜0.001）。miR-103-3p的相對(duì)表達(dá)量，在lncRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組（0.33±0.03）較空質(zhì)粒組（1.05±0.06）明顯降低（P＜0.001）。ATG5的相對(duì)表達(dá)量，在lncRNA過(guò)表達(dá)質(zhì)粒組（3.38±0.19）較空質(zhì)粒組（1.07±0.01）明顯升高（P＜0.001）。見(jiàn)圖4。

圖4 過(guò)表達(dá)NR_027324對(duì)miR-103-3p、ATG5的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

NR_027324、miR-103-3p、ATG5的mRNA相對(duì)表達(dá)量在干擾lncRNA對(duì)照組較空白對(duì)照組均無(wú)明顯變化（P＞0.05）。而NR_027324的相對(duì)表達(dá)量在干擾lncRNA組（0.22±0.02）比干擾lncRNA對(duì)照組（0.97±0.08）顯著下降（P＜0.001）。miR-103-3p的相對(duì)表達(dá)量在干擾lncRNA組（3.01±0.15）較干擾lncRNA對(duì)照組（0.98±0.08）明顯升高（P＜0.001）。ATG5的相對(duì)表達(dá)量在干擾lncRNA組（0.38±0.02）較干擾lncRNA對(duì)照組（1.02±0.06）明顯降低（P＜0.001）。見(jiàn)圖5。蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)ATG5蛋白相對(duì)表達(dá)量與ATG5的mRNA表達(dá)變化趨向一致。見(jiàn)圖6。

圖5 干擾NR_027324表達(dá)對(duì)miR-103-3p、ATG5的mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

圖6 蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)ATG5蛋白表達(dá)量

3 討論

lncRNA以前被認(rèn)為沒(méi)有生物學(xué)功能，是轉(zhuǎn)錄的“噪音”。但近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)lncRNA在心血管疾病中，尤其是心肌梗死中通過(guò)各種方式扮演重要角色[4,11-12]。在之前的芯片研究基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)[9]，lncRNA在大鼠心肌梗死邊緣區(qū)的表達(dá)譜與其他研究心肌梗死區(qū)的表達(dá)譜并不相同[3-4]。結(jié)果顯示在心肌梗死邊緣區(qū)可能發(fā)生了復(fù)雜的生物學(xué)過(guò)程。GO分析和pathway等生物信息學(xué)分析均提示lncRNA可能參與凋亡信號(hào)通路。進(jìn)一步生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)NR_027324作為H19基因的一段，預(yù)測(cè)miR-103-3p可能為其結(jié)合靶點(diǎn)。

miRNA是一類(lèi)近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的小RNA，一些miRNAs參與心血管疾病的病理生理過(guò)程[13-15]，也可能是治療的新靶點(diǎn)。目前已有研究表明，miR-25通過(guò)抑制線(xiàn)粒體凋亡途徑，防止心肌細(xì)胞氧化損傷[16]。miR-1和miR-133能調(diào)控心肌梗死后的心肌細(xì)胞凋亡，miR-1有促進(jìn)凋亡發(fā)生的作用，而miR-133則能夠以caspase-9為靶基因，抑制心肌細(xì)胞凋亡[17]。Zhang等[10]的研究提示miR-103-3p通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因ATG5，參與調(diào)節(jié)大鼠心肌細(xì)胞的凋亡。

lncRNA與miRNA可能通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA的方式互相調(diào)節(jié)[18]。lncRNA上可能存在miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，類(lèi)似海綿吸附的方式與mRNA競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合miRNA，從而形成調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，參與疾病的發(fā)生發(fā)展。通過(guò)前期的研究基礎(chǔ)和生物信息學(xué)分析，得到推論NR_027324作為H19基因的一段，可能通過(guò)ceRNA的方式，與ATG5競(jìng)爭(zhēng)性靶向結(jié)合miR-103-3p。在低糖缺氧的H9C2細(xì)胞模型中，NR_027324的表達(dá)明顯上調(diào)，與芯片結(jié)果一致；miR-103-3p表達(dá)量明顯下降，ATG5表達(dá)量明顯上調(diào)，與Zhang等[10]的研究結(jié)果一致。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)，結(jié)果顯示pmirGLO-NR_027324wt 3'UTR質(zhì)粒與miR-103-3p結(jié)合能夠抑制雙熒光素酶活性，而結(jié)合位點(diǎn)定點(diǎn)突變后的pmirGLO-NR_027324mut 3'UTR質(zhì)粒不能與miR-103-3p結(jié)合，即NR_027324 3'UTR與miR-103-3p的結(jié)合位點(diǎn)突變完全后，雙熒光素酶活性的變化不受影響。確認(rèn)了NR_027324與miR-103-3p能夠靶向結(jié)合的推論。通過(guò)分別過(guò)表達(dá)和干擾NR_027324的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-103-3p表達(dá)與NR_027324表達(dá)趨勢(shì)相反，ATG5的mRNA和蛋白變化與NR_027324的表達(dá)趨向一致。進(jìn)而大膽推論，NR_027324可能通過(guò)調(diào)控靶基因miR-103-3p，以ceRNA的方式參與ATG5相關(guān)的凋亡過(guò)程。

綜上所述，在低糖缺氧的H9C2細(xì)胞中，NR_027324表達(dá)量明顯升高，而miR-103-3p表達(dá)量明顯下降，兩者呈靶向結(jié)合關(guān)系。我們推測(cè)，NR_027324有可能通過(guò)調(diào)控miR-103-3p的靶基因ATG5，參與調(diào)節(jié)心肌梗死心肌細(xì)胞凋亡過(guò)程。lncRNA NR_027324為減少心肌細(xì)胞凋亡、挽救心梗邊緣區(qū)一個(gè)可能的治療靶點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)中采用了H9C2細(xì)胞作為模型細(xì)胞進(jìn)行研究，下一步研究還需要對(duì)lncRNA NR_027324與下游靶基因ATG5的關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。此外，lncRNA能夠結(jié)合多個(gè)miRNA，miRNA也能同時(shí)與多個(gè)lncRNA和mRNA結(jié)合，lncRNA和miRNA還參與多種其他途徑的病理生理過(guò)程。本研究只是其中的一小部分，需要更多更深入的研究，為心肌梗死的病理生理學(xué)研究及治療、預(yù)后，提供更加有力的基礎(chǔ)依據(jù)。