1H NMR對(duì)煙草甲蟲(chóng)蛀蝕款冬花前后化學(xué)成分的變化研究?

徐 博， 宋平平， 吳 翠， 李卓俊， 巢志茂△

(1.中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所， 北京 100700；2.國(guó)家中藥材產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系貯藏與包裝崗位， 北京 100700)

中藥款冬花為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，性辛、溫，味微苦，歸肺經(jīng)，具有潤(rùn)肺下氣、止咳化痰的功效，常用于治療新久咳嗽、喘咳痰多等癥[1]。與紫菀組成藥對(duì)治療咳嗽氣喘、肺纖維化[2-4]，與其他中藥組成咳喘寧膠囊提高機(jī)體抗氧化損傷的能力[5]；與射干等組成射干麻黃湯治療兒童哮喘發(fā)作[6]，在秋梨膏、百花丸中也有款冬花[7]。目前，在款冬花中已發(fā)現(xiàn)的成分有黃酮類(lèi)、倍半萜類(lèi)、三萜類(lèi)、生物堿類(lèi)、甾醇類(lèi)及揮發(fā)油等[8，9]，具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎、抗血小板活化因子等活性[10，11]。款冬花應(yīng)用歷史悠久，分布廣泛，主產(chǎn)區(qū)有河北晉州、山西長(zhǎng)治[12]、陜西銅仁等地，以河北產(chǎn)款冬花質(zhì)量最佳[13]。

藥材中夾雜活蟲(chóng)或蟲(chóng)卵，在適宜的溫濕度下，極易發(fā)生蟲(chóng)蛀現(xiàn)象[14，15]?？疃ㄊ侨菀自馐芟x(chóng)害的中藥材之一，通常發(fā)生在每年的5～10月份[16]。一旦遭受蟲(chóng)蛀，輕者表面出現(xiàn)蟲(chóng)洞，嚴(yán)重者變?yōu)榉勰?，并出現(xiàn)大量的害蟲(chóng)排泄物、殘?bào)w及藥末粉渣等。蟲(chóng)蛀后款冬酮的含量是否發(fā)生變化，蟲(chóng)蛀對(duì)款冬花其他化學(xué)成分的影響，如何鑒定款冬花是否蟲(chóng)蛀等，目前均未見(jiàn)報(bào)道。

近年來(lái)，1H NMR在中藥質(zhì)量分析領(lǐng)域有了廣泛的應(yīng)用[17，18]，與高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)、氣相色譜法(gas chromatography，GC)等相比，不需要復(fù)雜的前期色譜分離或衍生化，將之與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合已逐漸用于中藥材的真?zhèn)?、產(chǎn)地、品種鑒別等研究[19]。本研究將1H NMR與多元統(tǒng)計(jì)相結(jié)合，對(duì)款冬花蟲(chóng)蛀后的化學(xué)成分變化進(jìn)行了研究和討論，為鑒定蟲(chóng)蛀款冬花建立了判別方法，并為研究蟲(chóng)蛀對(duì)中藥材質(zhì)量的影響提供了思路。

1 材料

AVANCE Ⅱ 400 MHz型核磁共振儀(德國(guó)布魯克公司)，DFT-50A型手提式高速粉碎機(jī)(溫嶺市林大機(jī)械有限公司)，Ohaus CP224C型電子天平(奧豪斯(上海)儀器有限公司)，KQ-100E型超聲波清洗器(100 W，40 kHz，昆山市超聲儀器有限公司)，DK-98-Ⅱ型電熱恒溫水浴鍋(天津市泰斯特儀器有限公司)，分析級(jí)甲醇(北京化工廠)，D2O、CD3OD(SIGMA)，CD3OD含0.03%三甲基硅基(trimethylsilyl，TMS)。

款冬花由陜西榆林清陽(yáng)中藥材種植基地李永亮提供。部分款冬花樣品經(jīng)煙草甲蟲(chóng)蛀蝕后，出現(xiàn)了明顯的蟲(chóng)蛀現(xiàn)象。中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所巢志茂研究員鑒定樣品為菊科植物款冬TussilagofarfaraL.的干燥花蕾，蛀蟲(chóng)為鞘翅目煙草甲蟲(chóng)Lasiodermaserricorne(Fabricius)。

2 方法

2.1 樣品制備

本實(shí)驗(yàn)的研究對(duì)象分為三種：第一種是質(zhì)量合格、未被蟲(chóng)蛀的款冬花，粉碎過(guò)5號(hào)篩，稱(chēng)為未蟲(chóng)蛀款冬花；第二種是被煙草甲蟲(chóng)蛀蝕后的款冬花，粉碎過(guò)5號(hào)篩，稱(chēng)為蟲(chóng)蛀款冬花；第三種是款冬花被煙草甲蟲(chóng)蛀蝕后剔除蛀蟲(chóng)，過(guò)5號(hào)篩獲得的煙草甲蟲(chóng)排泄物，稱(chēng)為排泄物。

分別精密稱(chēng)取樣品粉末1.0 g，置于50 mL具塞錐形瓶中，精密加入25 mL甲醇密塞，稱(chēng)定重量，超聲30 min(100 W，40 kHz)，靜置，冷卻至室溫，補(bǔ)足失重，搖勻過(guò)濾，50 ℃減壓濃縮得提取物。提取物以D2O氘代后加入1.0 mL CD3OD，超聲溶解，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取0.8 mL續(xù)濾液置于核磁管中以供測(cè)試。以上樣品分別平行制備3份。

2.2 1H NMR測(cè)定

將2.1項(xiàng)下制得的樣品溶液置于核磁共振波譜儀中進(jìn)行1H NMR圖譜采集。采集頻率400 MHz，傅里葉變換0.122 Hz，脈沖序列zg30，脈沖間隔1.00 s，溫度294.7 K，采樣時(shí)間域66 k，采樣時(shí)間4.09 s，掃描次數(shù)16次，譜寬8012 Hz。TMS為內(nèi)標(biāo)，CD3OD鎖場(chǎng)。

2.3 1H NMR圖譜處理及數(shù)據(jù)分析

將2.2項(xiàng)下采集的數(shù)據(jù)導(dǎo)入MestReNova軟件(Version 9.0.1，Mestrelab Research SL，西班牙)中，相位自動(dòng)修正、基線調(diào)整，以?xún)?nèi)標(biāo)物TMS為基準(zhǔn)校正化學(xué)位移。對(duì)δ8.00～0.00區(qū)間以每0.04 ppm作為積分單元進(jìn)行分段積分，積分中除去CD3OD溶劑峰δ3.31～3.35及水峰δ4.70～5.10。分別將各段的積分面積基于峰面積進(jìn)行歸一化處理，從而得到化學(xué)位移積分段與積分值對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)矩陣。將數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p 13.0軟件(Umetrics，Sweden)中進(jìn)行PCA、PLS-DA及OPLS-DA分析。結(jié)合VIP值，篩選差異顯著的化學(xué)成分，采用GraphPad Prism 7.00軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)(P<0.05)。

2.4 化合物指認(rèn)

根據(jù)款冬花中化學(xué)成分結(jié)構(gòu)式及相應(yīng)的化學(xué)位移、裂分情況和峰面積，對(duì)化學(xué)成分進(jìn)行指認(rèn)歸屬。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 精密度考察 取同一份蟲(chóng)蛀款冬花的樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下的測(cè)試條件連續(xù)測(cè)定6次，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察儀器的精密度。

2.5.2 重復(fù)性考察 按照2.1項(xiàng)下的制備方法平行制備蟲(chóng)蛀款冬花樣品溶液6份，按照2.2項(xiàng)下的條件測(cè)定，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察其重復(fù)性。

2.5.3 穩(wěn)定性考察 取同一份蟲(chóng)蛀款冬花的樣品溶液，按照2.2項(xiàng)下的測(cè)試條件測(cè)定其在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性，按照2.3項(xiàng)下的方法處理圖譜，將數(shù)據(jù)導(dǎo)入Excel中計(jì)算相關(guān)系數(shù)，考察樣品在48 h內(nèi)的穩(wěn)定性。

3 結(jié)果

3.1 方法學(xué)考察

在精密度考察中，6組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明儀器的精密度良好；重復(fù)性考察中，6組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明重復(fù)性較好；穩(wěn)定性考察中，48 h內(nèi)各組數(shù)據(jù)的相關(guān)系數(shù)均在0.99以上，表明樣品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.2 1H NMR圖譜及信號(hào)歸屬

為探究款冬花蟲(chóng)蛀后化學(xué)成分的變化，將款冬花蟲(chóng)蛀前后的1H NMR圖譜進(jìn)行對(duì)比。未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花及排泄物的1H NMR圖譜見(jiàn)圖1。從圖中可以看出，三種樣品具有相似的1H NMR輪廓，且由于各提取物中化學(xué)成分比較復(fù)雜，圖譜中化學(xué)信號(hào)重疊現(xiàn)象嚴(yán)重，僅靠肉眼觀察獲得的信息有限，并不能全面、客觀、準(zhǔn)確地區(qū)別三者之間化學(xué)成分的差異。而多元統(tǒng)計(jì)分析可從大量、復(fù)雜、多維的數(shù)據(jù)中提取有效信息，建立數(shù)學(xué)模型對(duì)樣品進(jìn)行分類(lèi)，并分析對(duì)分類(lèi)具有較大貢獻(xiàn)的差異成分，從而實(shí)現(xiàn)差異性化學(xué)成分的篩選和分析評(píng)價(jià)[20]，故本研究采用多元統(tǒng)計(jì)進(jìn)行進(jìn)一步分析。

有研究從款冬花的生品和蜜炙品中報(bào)道了40個(gè)化合物[21]]，并進(jìn)行了生品與蜜炙品[22]、不同性狀[23]、不同來(lái)源[24]、莖和葉化學(xué)成分的比較等[25]?；?H NMR圖譜，本研究根據(jù)化學(xué)位移、峰裂分及峰面積，共指認(rèn)33個(gè)化合物(詳見(jiàn)表1)。根據(jù)化合物的結(jié)構(gòu)式及其質(zhì)子的化學(xué)位移，1H NMR圖譜大致分為三部分即氨基酸及有機(jī)酸區(qū)(δ3.10～0.70)，主要包括異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、檸檬酸、琥珀酸等；碳水化合物區(qū)(δ5.50～3.10)，主要包括蔗糖、葡萄糖等；低場(chǎng)區(qū)(δ8.00～5.50)，主要包括蘆丁、綠原酸、異綠原酸、腺嘌呤等。

表1 款冬花樣品指認(rèn)的化學(xué)成分

3.3 PCA

PCA是一種常用的多變量降維分析方法，可在盡量保留原始數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，把高維數(shù)空間的數(shù)據(jù)信息映射到低維數(shù)的少數(shù)主要成分(principal components，PCs)上。這些主成分能夠反映原始變量的絕大部分信息，從而實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)的簡(jiǎn)化，便于數(shù)據(jù)特征的分析。將2.3項(xiàng)下得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p軟件中進(jìn)行PCA分析(結(jié)果見(jiàn)圖2)。未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花和排泄物分別集中在不同區(qū)域，各自聚為一類(lèi)，其界限清晰，無(wú)互相重疊，表明PCA可將蟲(chóng)蛀款冬花與未蟲(chóng)蛀款冬花進(jìn)行有效判別。在PCA分析中，R2X表示該模型中主成分的累積貢獻(xiàn)率，Q2表示預(yù)測(cè)模型中主成分的累積貢獻(xiàn)率，R2X與Q2的值越接近1.0，模型構(gòu)建越成功。結(jié)果顯示，前4個(gè)主成分的貢獻(xiàn)率分別為PC1：51.4%，PC2：37.5%，PC3∶5.0%和PC4∶3.4%，R2X為97.3%，Q2為88.3%，說(shuō)明模型構(gòu)建成功。

圖2 未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花及排泄物的PCA得分圖

由于PCA是一種無(wú)監(jiān)督的模式分析方法，主要考察樣品在無(wú)監(jiān)督、自然情況下是否可以有效分類(lèi)，僅能把具有相似特征的數(shù)據(jù)歸為一類(lèi)，但不能忽略組內(nèi)誤差、消除與研究目的無(wú)關(guān)的隨機(jī)誤差。為進(jìn)一步探究款冬花蟲(chóng)蛀后化學(xué)成分的變化，本研究進(jìn)一步采用有監(jiān)督的方法PLS-DA及OPLS-DA進(jìn)行分析。

3.4 偏最小二乘法-判別分析(partial least squares discriminant analysis, PLS-DA)

PLS-DA先將待分析樣品按原始屬性類(lèi)別分組，再建立模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，以利于最大化提取不同組別間波譜圖的差異，從而推導(dǎo)出存在差異的化學(xué)成分。將2.3項(xiàng)下得到的數(shù)據(jù)矩陣導(dǎo)入SIMCA-p軟件中(結(jié)果見(jiàn)圖3)。未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花和排泄物集中在不同的區(qū)域各自聚為一類(lèi)，3種樣品之間界限清晰，無(wú)互相重疊。在PLS-DA中，常采用R2Y和Q2評(píng)價(jià)模型的質(zhì)量，R2Y主要反映模型的擬合程度，Q2則主要反映該模型的預(yù)測(cè)程度。R2Y及Q2值越接近1.0，說(shuō)明模型構(gòu)建越成功。前3個(gè)主要成分的R2Y為99.5%，Q2為96.3%，說(shuō)明模型構(gòu)建成功有效，這與3.3中PCA的分析結(jié)果一致，表明未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花和排泄物之間化學(xué)成分存在明顯差異。

圖3 未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花與排泄物的PLS-DA得分圖

為進(jìn)一步尋找出存在差異的化學(xué)成分，通過(guò)VIP>1.0及P<0.05進(jìn)行篩選，并結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，排泄物中異亮氨酸、纈氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸、谷氨酸、醋酸、1-O-乙基-β-D-葡萄糖苷、鼠李糖的含量升高明顯；而琥珀酸、蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖、膽堿、肌酸、卵磷脂、乙醇胺、綠原酸、異綠原酸、咖啡酸、3，4-O-二咖啡?？鼘幩帷⑻J丁、甲酸、腺嘌呤、對(duì)羥苯甲酸、富馬酸、馬來(lái)酸、β-谷甾醇的含量下降顯著。

3.5 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal patial lenst squares discriminate analysis,OPLS-DA)

OPLS-DA是在PLS-DA的基礎(chǔ)上結(jié)合正交信號(hào)，去除與Y矩陣無(wú)關(guān)的X矩陣變化，使不同組別的分類(lèi)差別達(dá)到最大，從而更有利于尋找不同組之間存在差異的化學(xué)成分。從OPLS-DA得分圖(見(jiàn)圖4)中可以看出，未蟲(chóng)蛀款冬花與蟲(chóng)蛀款冬花均各自聚為一類(lèi)且界限明顯。為驗(yàn)證模型的可靠性，本研究采用200次置換檢驗(yàn)(permutation test)，即將每個(gè)樣本標(biāo)記隨機(jī)打亂，再進(jìn)行建模和預(yù)測(cè)。R2和Q2在Y軸上的截距分別為0.169和-0.664。R2的截距幾乎接近于0，Q2的截距小于0.05，說(shuō)明模型出現(xiàn)過(guò)擬合的可能性較小，模型可靠。

圖4 未蟲(chóng)蛀款冬花與蟲(chóng)蛀款冬花的OPLS-DA主成分得分圖

圖5 OPLS-DA置換檢驗(yàn)結(jié)果(n=200)

為進(jìn)一步尋找出存在差異的化學(xué)成分，通過(guò)VIP>1.0及P<0.05進(jìn)行篩選，并結(jié)合t檢驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果表明，與未蟲(chóng)蛀款冬花中各化學(xué)成分的含量相比，蟲(chóng)蛀款冬花中款冬酮的含量下降明顯。

4 討論

眾所周知，蟲(chóng)蛀對(duì)中藥材的品質(zhì)危害極大。蟲(chóng)蛀后的中藥材普遍存在著有效成分含量下降的現(xiàn)象，但如何進(jìn)行藥材蟲(chóng)蛀前后的鑒別尚未見(jiàn)報(bào)道，對(duì)此本研究采用易遭受蟲(chóng)蛀的款冬花藥材進(jìn)行了初次嘗試。目前，1H NMR技術(shù)結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析已在中藥材的品種比較[26]、真?zhèn)舞b別[27]、不同炮制品質(zhì)量的評(píng)價(jià)[28，29]等方面有了一定的應(yīng)用，采用1H NMR技術(shù)用于蟲(chóng)蛀后研究，而PCA、PLS-DA及OPLS-DA可對(duì)未蟲(chóng)蛀款冬花、蟲(chóng)蛀款冬花進(jìn)行有效區(qū)分并推而廣之。此外，通過(guò)1H NMR特征圖譜峰共指認(rèn)出33個(gè)化合物，結(jié)合VIP值對(duì)蟲(chóng)蛀前后含量變化顯著的成分進(jìn)行篩選。本研究為研究更多的中藥材蟲(chóng)蛀變質(zhì)現(xiàn)象提供了新的思路與方法。

在煙草甲蟲(chóng)蛀蝕款冬花后的排泄物中，綠原酸、異綠原酸等款冬花的次生代謝產(chǎn)物含量下降，說(shuō)明煙草甲蟲(chóng)對(duì)這些次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行了吸收和代謝。在其排泄物中異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸的含量明顯高于未蟲(chóng)蛀款冬花和蟲(chóng)蛀款冬花中的含量，推測(cè)這些成分是煙草甲蟲(chóng)蛀蝕款冬花后通過(guò)代謝產(chǎn)生了更多的氨基酸。由于中藥材的有效物質(zhì)大多為次生代謝產(chǎn)物，其種類(lèi)、含量及各成分之間的相對(duì)比例是決定中藥有效性和質(zhì)量?jī)?yōu)劣的關(guān)鍵[30]，被煙草甲蟲(chóng)蛀蝕后，款冬花的次生代謝產(chǎn)物含量及相對(duì)比例均受到影響，推測(cè)其品質(zhì)和臨床療效也必然會(huì)受到影響。款冬酮作為款冬花的主要有效成分之一，具有明顯的鎮(zhèn)咳平喘作用[31]，是款冬花唯一含量測(cè)定的有效成分[1]，也可作為是否蟲(chóng)蛀的標(biāo)志性指標(biāo)。異亮氨酸、纈氨酸等氨基酸含量的升高，提示在進(jìn)行中成藥或提取物的提取和制備時(shí)，可通過(guò)制定限量值對(duì)款冬花的投料進(jìn)行控制。