培土清熱解瘀方對(duì)DR 大鼠炎性因子、血管生成及凋亡的影響

姚月蓉，朱蓓菁，錢錦，唐建明

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的一種常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥，也是世界各地勞動(dòng)年齡人群視力障礙和失明的主要原因[1-2]。而糖尿病黃斑水腫（diabetic macular edema，DME）是DR的重要表現(xiàn)，可出現(xiàn)在DR 的任一階段。有研究[3-4]表明，培土清熱解瘀方（PQJ）能顯著增強(qiáng)康柏西普玻璃體注射及激光光凝的治療效果，改善視力，減輕DME，并降低復(fù)發(fā)率。但PQJ 對(duì)DR 是否具有治療作用尚不明確。本研究采用鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）構(gòu)建DR 大鼠模型，并給予不同劑量的PQJ 藥液進(jìn)行灌胃治療，分析PQJ 對(duì)DR 大鼠血清中炎癥細(xì)胞因子、視網(wǎng)膜組織中血管生長(zhǎng)因子和細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性SPF 級(jí)SD 大鼠100 只，體重（200±25）g，購(gòu)于上海市計(jì)劃生育科學(xué)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)營(yíng)部，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（滬）2018-0006。飼養(yǎng)實(shí)驗(yàn)室溫度18℃～25℃，相對(duì)濕度40%～70%。本研究獲得上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：201812-04。

1.2 試劑、儀器與藥品

腫瘤壞死因子-α（tumornecrosisfactor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素-6 （interleukin-6，IL-6） 酶聯(lián)免疫吸附（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA） 試劑盒（上海信裕生物科技有限公司，XY-E30635、XY-E30646），鼠抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 （vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體、鼠抗血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2）抗體、鼠抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9（Caspase-9）抗體（賽默飛世爾科技公司，MA1-16629、PA5-104882、PA5-105271），人抗半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）抗體（美國(guó)Abcam 公司，ab49822），蘇木素、伊紅（珠海貝索生物技術(shù)公司，714094、BA4099）。

石蠟切片機(jī) （徠克醫(yī)療儀器公司，SQ2125），電泳儀 （美國(guó)BIO-RAD 公司，mini protean 3 cell）、電轉(zhuǎn)儀（大連競(jìng)邁科技有限公司公司，PS-9），酶標(biāo)儀（芬蘭雷勃公司，MK3）。

PQJ 水煎劑：PQJ 由黨參15 g、黃芪30 g、生地30 g、白術(shù)10 g、豬苓15 g、茯苓15 g、陳皮10 g、半夏10 g、三七2 g、知母10 g、黃柏10 g、黃芩10 g、黃連5 g、玉米須10 g、甘草5 g 組成。生藥購(gòu)于上海市寶山區(qū)中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院中藥房，由雷允上藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供。取PQJ 生藥，加入10 倍量水浸泡0.5 h，煎煮1.5 h，濾過(guò)，藥渣加入8 倍量水，煎煮1.5 h，合并2 次所得藥液，濃縮（藥液與藥材比例1∶1），無(wú)菌陰干制備成藥物浸膏，使用前加入適量體積水溶解成需要濃度。

1.3 DR 大鼠模型建立

選用100 只SD 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d 后，隨機(jī)挑選10 只設(shè)為正常對(duì)照組（control group，CG），其余大鼠腹腔注射STZ 溶液（60 mg/mL，注射前禁食不禁水16 h），注射后分別于72 h 和每周測(cè)定大鼠空腹血糖，連續(xù)測(cè)量8 周，以血糖值≥16.7 mmol/L 者確定為糖尿病大鼠。根據(jù)文獻(xiàn)方法[5]，繼而用微量進(jìn)樣器抽取0.05 μg 的VEGF，于顳側(cè)角膜緣后2 mm 水平經(jīng)過(guò)睫狀體平坦部進(jìn)入玻璃體腔，緩慢推動(dòng)進(jìn)樣器留針10 s，4 周后對(duì)玻璃體腔注藥的大鼠分批行眼底熒光血管造影 （fundus fluorescein angiography，F(xiàn)FA）檢查，造影出現(xiàn)背景熒光增強(qiáng)、血管迂曲擴(kuò)張、新生血管熒光滲漏等表現(xiàn)者為DR 造模成功。

1.4 分組與給藥

篩選出造模成功的DR 大鼠40 只，隨機(jī)分為PQJ 低、中、高劑量組（LPQJ、MPQJ、HPQJ）和模型組（model group，MG），以及模型建立前所設(shè)立的CG組，共5 組，每組10 只。HPQJ 組每天灌胃中藥液相當(dāng)于12 倍成人劑量（37.44 g/kg），MPQJ 組為6 倍成人劑量（18.72 g/kg），LPQJ 組為3 倍成人劑量（9.36 g/kg）。CG 組與MG 組每天給予蒸餾水灌胃，每組均連續(xù)灌胃3 個(gè)月，每日2 次，1 mL/次。

1.5 HE 染色法評(píng)價(jià)模型和治療效果

取大鼠眼球壁常溫固定24 h，行石蠟包埋切片，常規(guī)脫蠟至水，將已入蒸餾水后的切片放入蘇木素水溶液中染色5 min，流水沖洗15 min，酒精脫水后伊紅染色液染色1～2 min，染色后的切片經(jīng)純酒精脫水。二甲苯透明后中性樹(shù)膠封片，放入65℃烘箱中15 min。通過(guò)顯微鏡拍照，采集分析樣本相關(guān)部位。

1.6 ELISA 法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α 和IL-6 的含量

收集各組大鼠視網(wǎng)膜組織，使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g 離心10 min 將血清和紅細(xì)胞迅速小心分離，先加稀釋液40 μL，然后再加血清樣本10 μL，37℃溫育30 min，加入酶標(biāo)試劑50 μL，溫育30 min，洗滌，37℃避光顯色15 min，加終止液，測(cè)量各孔的吸光度。

1.7 qRT-PCR 檢測(cè)血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的相對(duì)表達(dá)量

采用Trizol 法提取視網(wǎng)膜組織RNA，使用DNaseⅠ消除RNA 中的DNA 后，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒制備cDNA，后使用SYBR Green 試劑在ABI Prism 7300儀器上進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，各基因所用引物序列如表所示（表1）。所得數(shù)據(jù)采用儀器自帶軟件進(jìn)行分析。

表1 引物信息

1.8 Western blot檢測(cè)VEGF、VEGFR2、Caspase-3和Caspase-9 的相對(duì)表達(dá)量

提取視網(wǎng)膜組織蛋白，測(cè)定蛋白濃度并進(jìn)行蛋白定量，經(jīng)凝膠、電泳和轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加入一抗 （VEGF、VEGFR2、Caspase-3、Caspase-9 和GAPDH）室溫孵育2 h，后將膜沖洗之后加入二抗37°C 孵育1 h，最后采用化學(xué)發(fā)光顯影，以GAPDH 為內(nèi)參計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS21.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，符合正態(tài)分布且方差齊的計(jì)量資料，方差分析（ANOVA）進(jìn)行多組變量間的相互比較，兩兩比較，采用LSD-t 檢驗(yàn)，當(dāng)P＜0.05 時(shí)被認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PQJ 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)和血清TNF-α 和IL-6 水平的影響

HE 染色實(shí)驗(yàn)顯示DR 模型成功建立，同時(shí)MPQJ 的視網(wǎng)膜形態(tài)接近CG，說(shuō)明PQJ 可以改善DR（圖1）。ELISA 結(jié)果顯示，5 組間大鼠血清TNF-α和IL-6 水平比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FTNF-α=10.023，F(xiàn)IL-6=8.920，均P=0.000）。兩兩比較，（1）TNF-α 表達(dá)：與CG 比較，MG 血清TNF-α 升高（t=5.514，P=0.000）；與MG 比較，MPQJ 和HPQJ 血清TNF-α 降低（tMPQJ=3.081，P=0.006；tHPQJ=4.624，P=0.000）；與MPQJ 比較，HPQJ血清TNF-α 降低（t=3.070，P=0.007），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）IL-6 表達(dá)：與CG 比較，MG 血清IL-6 升高（t=4.998，P=0.000）；與MG 比較，HPQJ 血清IL-6降低（t=4.219，P=0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。

表2 PQJ 對(duì)DR 大鼠血清炎性因子和視網(wǎng)膜凋亡因子水平的影響（±s，n=10）

表2 PQJ 對(duì)DR 大鼠血清炎性因子和視網(wǎng)膜凋亡因子水平的影響（±s，n=10）

注：* 與CG 相比，P<0.05；# 與MG 相比，P<0.05；PQJ 培土清熱解瘀方；DR 糖尿病視網(wǎng)膜病變；TNF-α 腫瘤壞死因子-α；IL-6 白細(xì)胞介素-6；Caspase-3 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3；Caspase-9 半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9；CG 正常對(duì)照組；MG 模型組；LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清熱解瘀方低、中、高劑量組

2.2 PQJ 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜中VEGF 和VEGFR2的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響

5 組間大鼠視網(wǎng)膜中VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（mRNA：FVEGF=13.559，F(xiàn)VEGFR2=12.969，均P=0.000；蛋白：FVEGF=28.597，F(xiàn)VEGFR2=32.244，均P=0.000）。兩兩比較，（1）VEGF表達(dá)：與CG比較，MG大鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA 表達(dá)升高（t=6.598，P=0.000）、VEGF 蛋白表達(dá)升高（t=8.391，P=0.000），與MG 比較，MPQJ和HPQJ 大鼠視網(wǎng)膜VEGF mRNA 表達(dá)降低（tMPQJ=4.414，tHPQJ=5.084，均P=0.000），HPQJ 組VEGF 蛋白表達(dá)降低（t=7.117，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）VEGFR2 表達(dá)：與CG比較，MG大鼠視網(wǎng)膜VEGFR2 mRNA 表達(dá)升高（t=6.378，P=0.000），VEGFR2 蛋白表達(dá)升高（t=10.683，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與MG 比較，MPQJ 和HPQJ 大鼠視網(wǎng)膜VEGFR2 mRNA 表達(dá)降低（tMPQJ=3.625，P=0.002；tHPQJ=4.228，P=0.000），LPQJ、MPQJ 和HPQJ 組VEGFR2蛋白表達(dá)降低（tLPQJ=4.312，tMPQJ=4.656，tHPQJ=7.736，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3、圖2）。

表3 PQJ 對(duì)DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

表3 PQJ 對(duì)DR 大鼠VEGF 和VEGFR2 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響（±s，n=10）

注：* 與CG 相比，P<0.05；# 與MG 相比，P<0.05；PQJ 培土清熱解瘀方；DR 糖尿病視網(wǎng)膜病變；VEGF 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；VEGFR2血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2；CG 正常對(duì)照組；MG 模型組；LPQJ、MPQJ、HPQJ 培土清熱解瘀方低、中、高劑量組

2.3 PQJ 對(duì)DR 大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3 和Caspase-9 表達(dá)的影響

5 組間大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3 和Caspase-9 的蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（FCaspase-3=48.538，F(xiàn)Caspase-9=51.669，均P=0.000）。兩兩比較，（1）Caspase-3 表達(dá)：與CG 比較，MG 大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3 蛋白表達(dá)升高（t=12.332，P=0.000）；與MG 比較，HPQJ 大鼠視網(wǎng)膜Caspase-3 蛋白表達(dá)降低 （t=7.370，P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。（2）Caspase-9 表達(dá)：MG 大鼠視網(wǎng)膜Caspase-9 蛋白表達(dá)升高（t=10.659，P=0.000）；與MG 比較，MPQJ 和HPQJ 大鼠視網(wǎng)膜Caspase-9 蛋白表達(dá)量降低（tMPQJ=7.251，tHPQJ=9.161，均P=0.000），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2、圖3）。

3 討論

DR 是一種以炎癥反應(yīng)和新生血管生成為特征的視網(wǎng)膜微血管病變[6-8]。多種炎癥細(xì)胞因子如TNFα、IL-6、白細(xì)胞介素-8（interleukin-8，IL-8）和腫瘤壞死因子-β（tumor necrosis factor-β，TNF-β）等在糖尿病患者和動(dòng)物模型的視網(wǎng)膜組織中顯著升高，且其濃度隨DR 的發(fā)展而逐漸增加[7,9]。臨床研究[10-11]顯示，糖尿病患者房水中IL-1、IL-6、IL-8、IL-17、TNF-α 等炎癥細(xì)胞因子水平隨新生血管的發(fā)展逐漸升高，且水平越高則出現(xiàn)視網(wǎng)膜并發(fā)癥的時(shí)間就越早，可見(jiàn)炎癥細(xì)胞因子在DR 的發(fā)病機(jī)制中起到一定作用。已有報(bào)道[12-14]顯示，多種中藥能通過(guò)抑制炎癥細(xì)胞因子的水平緩解DR。

中醫(yī)界較一致地認(rèn)為DR 是由于糖尿病發(fā)病日久，陰虛津虧，不能上承目絡(luò)，目竅失養(yǎng)；或肝腎陰虛目甚，陰虛陽(yáng)亢，虛火上炎，灼傷目絡(luò)而致視物模糊，甚則失明[15]。PQJ 是上海市曙光醫(yī)院眼科老中醫(yī)朱煒敏教授多年臨床經(jīng)驗(yàn)方，方以清理三焦內(nèi)熱的基礎(chǔ)上，加益氣養(yǎng)陰，配以消腫、活血、散瘀藥物治療。用黨參、黃芪益氣，生地、知母養(yǎng)陰，黃芩、黃連、黃柏清熱，白術(shù)、茯苓培補(bǔ)脾土，豬苓、茯苓利水消腫，半夏化痰濕，三七活血，甘草調(diào)和諸藥。與已有動(dòng)物研究[13,16-17]相一致，本研究中STZ 誘導(dǎo)的DR 大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 的含量顯著增加。而PQJ 灌胃治療能顯著降低DR 大鼠視網(wǎng)膜組織中炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 的水平，可見(jiàn)PQJ 能減輕DR 大鼠炎癥反應(yīng)，從而降低視網(wǎng)膜組織的損傷。

臨床研究[18]顯示，DR 病人隨著病情的加重，促血管生成因子VEGF 及其受體水平顯著升高。高血糖誘導(dǎo)的糖代謝異常、脂質(zhì)過(guò)氧化、晚期糖基化、谷氨酸毒性和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，繼而增加VEGF 及其受體VEGFR2 的表達(dá)，是糖尿病微血管病變發(fā)生的關(guān)鍵因素[19]。STZ 誘導(dǎo)的DR 大鼠在發(fā)病后視網(wǎng)膜內(nèi)血管數(shù)增加，VEGF 及其受體VEGFR1 和VEGFR2 的表達(dá)增強(qiáng)[13,20-21]。因此，可見(jiàn)VEGF 及其受體參與DR 的發(fā)生過(guò)程。針對(duì)VEGF 或VEGF 受體的治療物，如Decursin，呈劑量依賴地抑制VEGFR2 的表達(dá)，顯著抑制糖尿病視網(wǎng)膜新生血管[22]。在人視網(wǎng)膜微血管細(xì)胞中沉默硫氧還蛋白互作蛋白 （thioredoxin-interactingprotein，TXNIP）基因，可以通過(guò)阻斷VEGFR2 抑制VEGF 誘導(dǎo)的血管生成反應(yīng)[23]。本實(shí)驗(yàn)研究證實(shí)DR 模型大鼠視網(wǎng)膜組織中VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)顯著高于正常對(duì)照組，而PQJ 能明顯抑制VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)，且劑量越高抑制作用越強(qiáng)，說(shuō)明PQJ能抑制VEGF 和VEGFR2 的水平，可能進(jìn)一步通過(guò)抑制新生血管生成達(dá)到改善DR 的目的。

視網(wǎng)膜血管周細(xì)胞凋亡是公認(rèn)的DR 最早的改變。高血壓狀態(tài)的周期性拉伸能誘導(dǎo)Caspase-3 和Caspase-9 的活性升高，誘導(dǎo)視網(wǎng)膜周細(xì)胞凋亡，從而加重早期糖尿病視網(wǎng)膜病變[24]。與正常視網(wǎng)膜相比，糖尿病視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層中活性Caspase-3和Caspase-9 的表達(dá)增強(qiáng)，其上調(diào)與糖尿病視網(wǎng)膜病變的神經(jīng)元變性有關(guān)[25]。本研究中PQJ 能明顯降低STZ 誘導(dǎo)的DR 大鼠視網(wǎng)膜組織中凋亡蛋白Caspase-3 和Caspase-9 的增加。因此，PQJ 能通過(guò)調(diào)控視網(wǎng)膜組織細(xì)胞的凋亡，在DR 的防治中產(chǎn)生作用。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，PQJ 能顯著降低DR 大鼠炎癥細(xì)胞因子TNF-α 和IL-6 的水平，抑制血管生成因子VEGF 和VEGFR2 的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白，從而進(jìn)一步調(diào)控DR 大鼠視網(wǎng)膜血管新生、炎性反應(yīng)和細(xì)胞凋亡，為PQJ 應(yīng)用于臨床治療DR 提供了有效的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。