骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)膝關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷及KDM6A/SOX9信號(hào)通路的影響

季健坤 李克文 趙宏濤 張斌斌 馮唱 扎西達(dá)娃 吳磊 劉朝政

青海大學(xué)附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)外科，青海 西寧 810000

骨關(guān)節(jié)炎(OA)是一種嚴(yán)重的關(guān)節(jié)退行性疾病，是關(guān)節(jié)疼痛和殘疾的常見原因，特別是在老年人中[1]。目前，全球有15 %的人口患有OA，其特征是由于細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)的喪失、廣泛的纖維化和裂隙的形成而導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨退變，最終導(dǎo)致軟骨表面的完全喪失[2]。雖然一些藥物如非甾體抗炎藥和細(xì)胞外基質(zhì)成分透明質(zhì)酸可以通過改變軟骨下骨和滑膜來緩解OA的癥狀，但由于OA的復(fù)雜病理和慢性性質(zhì)，目前尚無有效的治療方法，且許多OA患者在疾病后期需要關(guān)節(jié)置換治療，但假體壽命有限[3]。因此尋找積極的OA治療方法非常必要。間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)在同種異體移植過程中可以迅速擴(kuò)增而不會(huì)引起免疫學(xué)問題，在治療各種人類疾病的過程中增加了許多移植干預(yù)措施的成功率[4-5]。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一種來源于骨髓的MSCs，作為具有多向分化潛能的干細(xì)胞，BMSCs可以分化為不同類型的組織，包括脂肪、軟骨和骨骼，此外，BMSCs還可以進(jìn)行自我更新并產(chǎn)生免疫調(diào)節(jié)反應(yīng)[6-7]。因此，BMSCs在軟骨損傷和關(guān)節(jié)疾病的治療中得到了積極的應(yīng)用。盡管BMSCs已經(jīng)用于治療OA，但BMSCs治療骨性關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制尚不清楚，但有研究者懷疑BMSCs通過分泌一系列免疫因子和細(xì)胞因子發(fā)揮作用，進(jìn)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用[8]。研究[9]報(bào)道在低氧環(huán)境下培養(yǎng)MSCs期間，細(xì)胞表現(xiàn)出一套獨(dú)特的分化、增殖和衰老特性。缺氧暴露可以激活賴氨酸特異性去甲基化酶6A(KDM6A)的表達(dá)，從而使SOX9啟動(dòng)子去甲基化，SOX9的下調(diào)參與了OA的發(fā)病[10]。因此，本研究通過建立膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)動(dòng)物模型，將BMSCs在缺氧條件下共培養(yǎng)，研究BMSCs預(yù)處理對(duì)KOA的治療作用并初步探討其機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)SD大鼠40只，體質(zhì)量(160～180)g，購自四川大學(xué)華西醫(yī)院，使用許可證號(hào)：SYXK(川)2018-119，飼養(yǎng)于恒溫(20～25)℃、恒濕(50 %±5 %)環(huán)境中，自然采光，自由飲水。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后隨機(jī)分為3組：正常對(duì)照組(Control)、膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎組(KOA)、骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組(BMSCs)，每組10只，剩余10只大鼠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離。

1.2 主要試劑及儀器

L-DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco；木瓜蛋白酶(S10011；CAS：9001-73-4)購自上海源葉科技；蘇木素染液(批號(hào)：ZH193907)購自武漢塞維爾生物；伊紅染液(批號(hào)：C200403)購自珠海貝索生物；白細(xì)胞介素-6(IL-6，貨號(hào)：ZC-36404)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，貨號(hào)：ZC-37624)、基質(zhì)金屬蛋白酶-3(MMP-3，貨號(hào)：ZC-36752)、基質(zhì)金屬蛋白酶-13(MMP-13，貨號(hào)：ZC-36747)購自上海茁彩生物；RNA Trizol Reagent(批號(hào)：vs18061730)購自合肥博美生物；TB Green TM Premix Ex TaqTM Ⅱ(Tli RNaseH Plus)(貨號(hào)：RR820A)購自寶日醫(yī)生物；抗Col II(貨號(hào)：ab188570)、IL-6(貨號(hào)：ab233706)、MMP-3(貨號(hào)：ab52915)、MMP-13(貨號(hào)：ab219620)、KDM6A(貨號(hào)：ab36938)、SOX9(貨號(hào)：ab185966)、Aggrecan(貨號(hào)：ab3778)抗體購自Abcam；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：P0009)購自Beyotime；BMJ-A型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子儀器廠)；BA210Digital數(shù)碼三目攝像顯微鏡(麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán))；SpectraMAX Plus384酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)；PIKORed 96實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(美國ThermoFisher儀器有限公司)。

1.3 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離和鑒定

取剩余10只大鼠，1 %戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉，75 %乙醇全身浸泡消毒10 min，在無菌條件下分離股骨和脛骨，用添加青/鏈霉素的L-DMEM培養(yǎng)基沖出骨髓，然后制成單細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min后棄去上清液，重懸以1×109/L的細(xì)胞濃度接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置37 ℃、CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每3天更換1次新鮮培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度長至70 %～80 %融合時(shí)，用0.25 %胰酶消化，1∶2的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)，1 % O2濃度條件低氧培養(yǎng)。培養(yǎng)后采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化及生長狀況并拍照。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)記(CD29、CD34、CD105、CD45)鑒定MSCs，具體步驟：收集培養(yǎng)后的細(xì)胞于1 000 r/min，4 ℃離心5 min，各管依次加入單克隆抗體CD29、CD34、CD105、CD45，避光冰上孵育45 min，用500 μL PBS(含1 %BSA)重懸細(xì)胞，流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.4 膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型構(gòu)建

除Control組外，其余兩組均采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔注射建立KOA大鼠模型。用0.9 %NaCl溶液配4 %(w/v)木瓜蛋白酶溶液，用1 %戊巴比妥鈉(35 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，然后雙膝關(guān)節(jié)備皮、消毒、屈曲約45 °，從髕骨下緣前內(nèi)側(cè)的膝眼向髁間窩方向進(jìn)針，明顯有落空感后，針尖抵達(dá)股骨內(nèi)側(cè)髁再回撤2 mm，并注射木瓜蛋白酶，分別向雙側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注入4 %木瓜蛋白酶0.2 mL。每隔3 d注射1次，連續(xù)注射3次(即第1天、第4天、第7天注射)。注射后1周，觀察各組大鼠膝關(guān)節(jié)外觀，并在各組各取1只大鼠處死后，取關(guān)節(jié)軟骨行組織病理切片，驗(yàn)證造模是否成功。

1.5 治療方法

造模成功后第2天，Control組和KOA組大鼠膝關(guān)節(jié)腔注射生理鹽水0.3 mL，每周1次，共4次；BMSCs組大鼠膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)一次性注射骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞0.3 mL (細(xì)胞濃度為1×108/L)，同時(shí)每周1次膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射生理鹽水0.3 mL，共4次。治療結(jié)束后，進(jìn)行大鼠關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評(píng)分[11]：0為無腫脹或紅斑、1為輕度腫脹或紅斑、2為中度腫脹、3為重度腫脹、4為關(guān)節(jié)僵硬或畸形，評(píng)分之和作為最終的AI評(píng)分。然后處死大鼠，采集軟骨和血清樣本進(jìn)行進(jìn)一步分析。

1.6 指標(biāo)檢測(cè)

1.6.1軟骨組織病理學(xué)變化：分離膝關(guān)節(jié)軟骨組織，經(jīng)10 %多聚甲醛固定，將固定的軟骨組織，經(jīng)脫鈣、水合、透明、石蠟包埋后切片，切片厚度5 μm，采用HE染色，梯度酒精脫水，中性樹膠封固，鏡檢觀察膝關(guān)節(jié)軟骨組織病理學(xué)變化。

1.6.2免疫組織化學(xué)染色：軟骨組織切片進(jìn)行Col II、IL-6、MMP-3、MMP-13免疫組織化學(xué)染色。將5 μm厚的切片經(jīng)3 %甲醇雙氧水室溫10 min，PBS洗3次，后浸入0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液，加熱至沸騰，冷卻后，滴加山羊血清封閉液室溫20 min，滴加抗Col II、IL-6、MMP-3、MMP-13抗體在4 ℃孵育過夜，滴加生物素化二抗37 ℃ 30 min，DAB顯色，蘇木素輕度復(fù)染、脫水、透明，中性樹膠封片，鏡檢觀察。

1.6.3酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測(cè)：ELISA法檢測(cè)血清IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13含量。根據(jù)ELISA試劑盒說明步驟嚴(yán)格操作。

1.6.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測(cè)：qRT-PCR檢測(cè)軟骨組織Col II、Col I、TNF-α、IL-6、MMP-13、KDM6A、SOX9、Aggrecan 的基因表達(dá)。采用RNA提取試劑盒提取軟骨組織總RNA，將總RNA加入反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系(10 μL)，根據(jù)制造商說明書用特異性RT引物反轉(zhuǎn)錄為cDNA。RT-qPCR在BioRad實(shí)時(shí)PCR儀器上進(jìn)行，以GAPDH為內(nèi)參，引物序列如表1所示。qRT-PCR反應(yīng)條件：95 ℃初始變性10 min，隨后95 ℃變性10 s，60 ℃退火10 s，72 ℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)，記錄CT值，采用2-ΔΔCT分析相對(duì)表達(dá)水平。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.6.5蛋白印跡法(Western blot)檢測(cè)：取軟骨組織，RIPA裂解緩沖液提取總蛋白，BCA蛋白定量試劑盒測(cè)定蛋白濃度，樣品煮沸變性后于-20 ℃保存?zhèn)溆?。使用等量蛋白質(zhì)上樣，經(jīng)10 % SDS-PAGE分離后，置于聚偏氟乙烯膜上，在5 %脫脂牛奶中封閉1 h后，與KDM6A、SOX9、Aggrecan一抗結(jié)合，于4 ℃孵育過夜，然后選擇合適的二抗在室溫孵育1 h，ECL暗室顯色。以β-actin表達(dá)作為內(nèi)參，用Image-Pro Plus6.0軟件分析各條帶的光密度值，并用樣品光密度值與β-actin光密度值的比值進(jìn)行分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

細(xì)胞形態(tài)觀察顯示細(xì)胞排列緊密，逐漸融合成片，且細(xì)胞形態(tài)均一，呈梭形生長，生長旺盛(圖1A)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)檢測(cè)結(jié)果顯示，培養(yǎng)后的BMSCs均表達(dá)CD29、CD34、CD105、CD45(圖1B)。表明BMSCs具有較強(qiáng)的分裂增殖能力。

注：A：細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察；B：CD29、CD34、CD105、CD45流式分析結(jié)果。圖1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)(100×)Fig.1 Morphology and surface markers expression of bone marrow mesenchymal stem cells(100×)

2.2 軟骨組織病理學(xué)

Control組：關(guān)節(jié)軟骨結(jié)構(gòu)完整，表面被覆薄層透明軟骨，關(guān)節(jié)面光滑，關(guān)節(jié)軟骨分為表層、移行層、放射層和鈣化層，結(jié)構(gòu)較為清晰，潮線以上放射層以下為鈣化層，未見明顯潮線，軟骨細(xì)胞分布均勻，軟骨內(nèi)無血管和神經(jīng)，未見明顯軟骨缺損、軟骨細(xì)胞壞死及纖維增生等病理改變。KOA組：關(guān)節(jié)軟骨侵蝕，見軟骨面不平整，表層缺失，軟骨基質(zhì)著色變淡，表面纖維組織增生，并有炎性細(xì)胞浸潤和新生毛細(xì)血管形成，炎性細(xì)胞以淋巴細(xì)胞為主，部分軟骨局部形成裂隙，軟骨細(xì)胞成簇，排列不規(guī)律，軟骨細(xì)胞壞死，嗜酸性增強(qiáng)。BMSCs組：關(guān)節(jié)軟骨損傷，見軟骨面不平整，部分軟骨基質(zhì)著色變淡，軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，排列紊亂，軟骨細(xì)胞成簇，部分軟骨細(xì)胞變性壞死，嗜酸性增強(qiáng)。(圖2)。關(guān)節(jié)指數(shù)(AI)評(píng)分顯示，與Control比較，KOA組AI評(píng)分明顯增加，與KOA組比較，BMSCs組AI評(píng)分明顯降低(圖2)。

2.3 軟骨表型和炎癥

免疫組化結(jié)果顯示，與Control組比較，KOA組Col II蛋白表達(dá)明顯降低，IL-6、MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與KOA組比較，BMSCs組Col II蛋白表達(dá)明顯升高，IL-6蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)，MMP-3、MMP-13蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3A～B)。qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，KOA組Col II、Col I mRNA表達(dá)明顯降低，TNF-α、IL-6、MMP-13 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01)，與KOA組比較，BMSCs組Col I mRNA表達(dá)明顯升高，IL-6 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，Col II、TNF-α、MMP-13 mRNA表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(圖3C)。ELISA結(jié)果顯示，與Control組比較，KOA組血清中IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13水平均明顯升高(P<0.01)，與KOA組比較，BMSCs組血清中IL-6、TNF-α、MMP-3、MMP-13水平均明顯降低(P<0.05)(圖3D)。

圖2 各組大鼠軟骨組織病理學(xué)(HE)Fig.2 Chondrohistopathology of rats in each group (HE)

2.4 KDM6A/SOX9信號(hào)通路因子變化

qRT-PCR和Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示，與Control組比較，KOA組KDM6A、Aggrecan、SOX9 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯降低(P<0.05)；與KOA組比較，BMSCs組KDM6A、Aggrecan mRNA明顯升高(P<0.05)，KDM6A、Aggrecan、SOX9蛋白表達(dá)均明顯升高(P<0.05)(圖4A～C)。

注：A：免疫組化染色結(jié)果；B：免疫組化染色定量分析；C：qRT-PCR檢測(cè)各基因的相對(duì)表達(dá)；D：TNF-α、IL-6、MMP-3、MMP-13含量。與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01。 圖3 各組大鼠軟骨表型和炎癥結(jié)果Fig.3 Cartilage phenotype and inflammation results of rats in each group

注：A：WB檢測(cè)各種蛋白的相對(duì)表達(dá)；B：qRT-PCR檢測(cè)各基因的相對(duì)表達(dá)；C：KDM6A、Aggrecan、SOX9定量分析。與Control組比較，*P<0.05，**P<0.01；與KOA組比較，#P<0.05，##P<0.01。圖4 KDM6A/SOX9信號(hào)通路相關(guān)因子變化Fig.4 Changes of related factors in the KDM6a /SOX9 signaling pathway

3 討論

BMSCs是公認(rèn)的免疫調(diào)節(jié)劑，可以限制炎癥反應(yīng)，研究表明BMSCs可分化為軟骨并表現(xiàn)出免疫抑制活性，可能為治療骨性關(guān)節(jié)炎提供一種新的途徑[12]。然而BMSCs治療骨性關(guān)節(jié)炎的具體機(jī)制尚仍有待進(jìn)一步研究。因此，本研究擬建立KOA動(dòng)物模型，將BMSCs在缺氧條件下共培養(yǎng)，研究BMSCs預(yù)處理對(duì)KOA的治療作用并初步探討其機(jī)制。

研究發(fā)現(xiàn)，體內(nèi)移植缺氧預(yù)處理的hBM-MSCs可促進(jìn)無菌小鼠軟骨細(xì)胞的增殖并產(chǎn)生軟骨樣組織[13]。含1 % O2的精氨酸-天冬氨酸-海藻酸鈉水凝膠中培養(yǎng)的細(xì)胞可促進(jìn)成骨和血管生成反應(yīng)，2 %的O2可提高干細(xì)胞的增殖和成骨分化水平，提示低氧預(yù)處理是促進(jìn)骨愈合的有效治療方法[14-15]。本研究結(jié)果顯示BMSCs低氧預(yù)處理可明顯改善KOA軟骨組織病理學(xué)變化，提示BMSCs對(duì)KOA軟骨組織病變具有延緩作用。Lu等[16]研究顯示骨關(guān)節(jié)炎的特征是蛋白多糖丟失、軟骨細(xì)胞數(shù)量減少、軟骨不規(guī)則和纖維組織形成，而BMSCs來源的分化軟骨細(xì)胞可顯著增加軟骨細(xì)胞外基質(zhì)蛋白Col Ⅱ的表達(dá)，減少軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示BMSCs低氧預(yù)處理可明顯升高軟骨組織中Col II表達(dá)，本研究結(jié)果與其報(bào)道一致。研究顯示炎癥反應(yīng)是骨性關(guān)節(jié)炎的重要病理基礎(chǔ)，其抑制軟骨基質(zhì)的合成，抑制軟骨細(xì)胞的增殖[17]。盡管BMSCs在炎癥性疾病中具有包括抗炎活性在內(nèi)的有益作用，但BMSCs治療骨性關(guān)節(jié)炎受到可能的促炎表型的限制[18]。因此，在BMSCs用于骨性關(guān)節(jié)炎治療之前，需要阻斷這些細(xì)胞中的炎癥信號(hào)。本研究結(jié)果顯示BMSCs低氧預(yù)處理明顯降低血清及軟骨組織中IL-6、MMP-3、MMP-13的表達(dá)，提示BMSCs對(duì)KOA具有抗炎作用，表明BMSCs可降低KOA炎癥反應(yīng)，減緩了疾病的進(jìn)展。

低氧條件下KDM6A的表達(dá)明顯增加，這也增加了離子通道蛋白鈉鈣交換體(NCX)的表達(dá)[19]。KDM6A作為組蛋白去甲基化酶的一種，可以通過抑制組蛋白H3賴氨酸27(H3K27)的轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)包括細(xì)胞增殖、腫瘤發(fā)生和胚胎發(fā)育在內(nèi)的各種生物學(xué)過程[20]。KDM6A的激活還可使SOX9啟動(dòng)子去甲基化進(jìn)而促進(jìn)干細(xì)胞分化[10]。SOX9是一種軟骨性轉(zhuǎn)錄因子，主要在間充質(zhì)軟骨的形成過程中表達(dá)，并對(duì)Aggrecan和Col2a1的轉(zhuǎn)錄起重要作用[21]。研究報(bào)道SOX9在骨關(guān)節(jié)炎患者發(fā)病過程中的表達(dá)水平呈顯著降低[22]。此外，低氧可增加參與軟骨形成的SOX9的表達(dá)水平[23]。本研究結(jié)果顯示，BMSCs低氧預(yù)處理可明顯增加KOA大鼠KDM6A、Aggrecan、SOX9的表達(dá)。KDM6家族成員，如KDM6B/JMJD3和KDM6A/UTX可作為基于MSC的干預(yù)新靶點(diǎn)，KDM6A通過間接或直接作用影響SOX9的轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)控BMSCs的軟骨形成[24]。表明BMSCs低氧預(yù)處理可調(diào)控KDM6A/SOX9信號(hào)通路，在關(guān)節(jié)軟骨的維持中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究結(jié)果提示BMSCs低氧預(yù)處理通過激活KDM6A/SOX9信號(hào)通路來減緩膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的進(jìn)展，進(jìn)一步完善低氧預(yù)處理BMSCs的研究可能會(huì)促進(jìn)BMSCs在骨關(guān)節(jié)炎潛在的臨床應(yīng)用。