黑果枸杞組培快繁技術(shù)研究

刁玄章 周玉麗

摘要 [目的]優(yōu)化黑果枸杞組培快繁條件。[方法]以黑果枸杞的種子為材料，在種子無菌萌發(fā)后，取帶腋芽的嫩莖段作外植體，以不同基本培養(yǎng)基與不同種類的植物生長調(diào)節(jié)劑以及不同濃度配比，研究不同種類植物生長調(diào)節(jié)劑對黑果枸杞組培苗增殖和生根的影響。[結(jié)果]以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度的6-BA與IBA、IAA組合處理均能提高組培苗的增值倍數(shù)，其中0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA增殖效果明顯，增殖倍數(shù)達到9.33;5種不同基本培養(yǎng)基中，MS對黑果枸杞組培苗的增殖效果最好，芽多，生長狀況良好;生根培養(yǎng)中，添加生長素可抑制黑果枸杞組培苗生根，不添加任何生長素的WPM培養(yǎng)基的生根效果最好，生根率最高，達到97.5%。 [結(jié)論]該研究可為建立黑果枸杞快繁體系提供科學(xué)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 黑果枸杞;組織培養(yǎng);增殖;生根

中圖分類號 S567.1+9? 文獻標(biāo)識碼 A? 文章編號 0517-6611（2022）07-0099-04

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2022.07.023

開放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識碼（OSID）：

Study on Tissue Culture and Rapid Propagation of Lycium ruthenicum

DIAO Xuan-zhang1，ZHOU Yu-li2

（1.Agriculture and Rural Affairs Bureau of Liuhe District，Nanjing，Jiangsu 211599; 2.College of Agronomy，Anhui University of Science and Technology，F(xiàn)engyang，Anhui 233100）

Abstract [Objective]To optimize the conditions of Lycium ruthenicum seed rapid propagation system.[Method]With Lycium ruthenicum seeds as the material，after the sterile seed germination，take tender stem segment with axillary bud as explant，with different basic culture medium with different kinds of plant growth regulator and concentration ratio，the effects of different kinds of plant growth regulator on Lycium ruthenicum somaclone proliferation and rooting were studied.[Result]With MS as the basic culture medium，adding different concentrations of 6-BA and IBA，IAA combination treatment all can improve the value of the somaclone multiples，6-BA and IAA on proliferation effect was obvious，and proliferation ratio was 9.33;among the five different basic media， MS had the best proliferation effect on the tissue culture seedlings of Lycium ruthenicum， with many buds and good growth; in rooting culture， adding auxin can inhibit the rooting of tissue culture seedlings of Lycium ruthenicum. The rooting effect of WPM medium without auxin was the best， and the rooting rate was the highest， up to 97.5%. [Conclusion]This study can provide a scientific basis for establishing the rapid propagation system of Lycium ruthenicum.

Key words Lycium ruthenicum;Tissue culture;Propagation;Rooting

黑果枸杞（Lycium ruthenicum Murr.）為茄科（Solanceae）枸杞屬（Lycium L.）多年生落葉灌木，主要分布于西北及內(nèi)蒙古等地，在中亞、高加索和歐洲也有分布[1]。在鹽漬化土壤大量生長，常構(gòu)成鹽爪爪（Kalidium foliatum）-黑果枸杞鹽生植物群落[2]，是一種較為典型的儲鹽植物，也是荒漠化地區(qū)尤其是鹽堿化土地恢復(fù)植被的備選植物之一[3]。野生黑果枸杞的適應(yīng)能力很強，耐38.5 ℃高溫，且在-25.6 ℃下無凍害[4];為較耐旱植物，土壤水合補償點為3.81%[5];果實富含枸杞多糖、蛋白質(zhì)以及微量元素等多種營養(yǎng)成分，其提取物還具有降血糖、降血脂、抗氧化、延緩衰老及預(yù)防并治療動脈硬化、心血管疾病、腫瘤等中老年常見疾病的功效，保健和藥用價值遠遠超過普通紅枸杞，被譽為“軟黃金”[6-12]。近年來，隨著人們保健意識的增強，具有滋補養(yǎng)生、強身健體、美容養(yǎng)顏的黑果枸杞備受消費者的青睞。由于黑果枸杞市場需求量逐年增大，對野生資源的過度采摘，造成嚴(yán)重的生態(tài)影響，因此研究黑果枸杞組培快繁技術(shù)顯得尤為重要。植物組織培養(yǎng)起源于20世紀(jì)，對植物學(xué)的發(fā)展起到了重要的推動作用[13]。采用植物組織離體培養(yǎng)的方式對黑果枸杞進行研究，改變傳統(tǒng)育苗模式，既可以保障黑果枸杞的品質(zhì)，又能滿足市場需求，但目前有關(guān)黑果枸杞組培快繁技術(shù)的研究較少，僅僅局限于簡單的培養(yǎng)條件探索。該研究以黑果枸杞種子為材料，以MS培養(yǎng)基為基本培養(yǎng)基，用組織離體培養(yǎng)技術(shù)培育黑果枸杞試管苗，研究不同激素組合和不同培養(yǎng)基對無菌苗外植體不定芽增殖和生根的影響，旨在為黑果枸杞建立系統(tǒng)組培快繁體系提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試材料。供試種子為采自甘肅省敦煌市的野生黑果枸杞種子，供試苗為黑果枸杞種子繁殖的無菌苗。

1.1.2 培養(yǎng)條件。培養(yǎng)基中均加入蔗糖30 g/L，瓊脂5.5 g/L，調(diào)節(jié)pH 6.0～6.5，培養(yǎng)溫度（25±1） ℃，光照在2 000～4 000 lx，光照時間12 h/d，相對濕度60%左右。

1.2 方法

1.2.1 無菌苗的獲得。

選擇適宜大小的黑果枸杞果實→用洗潔精水清洗干凈表面→自來水沖洗30 min→蒸餾水沖洗3～4次→在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡30～45 s→無菌水沖洗2～3次→5 %次氯酸鈉溶液處理 8～10 min→無菌水沖洗 4～5次→用無菌濾紙吸干多余水分→在超凈工作臺上無菌條件下剝?nèi)》N子接種到不添加植物生長調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)，7 d后種子逐漸萌發(fā)，45 d左右苗高6～8 cm時備用（圖1a）。

1.2.2 增殖培養(yǎng)。將無菌苗剪切成帶2～3個腋芽的莖段，接種到添加不同濃度6-BA與IBA、IAA、NAA組合的MS培養(yǎng)基上誘導(dǎo)叢生芽（圖1b），每處理10瓶，每瓶接3～4個莖段，接種30 d后觀察生長情況并進行數(shù)據(jù)分析。

將上述篩選的最適植物生長調(diào)節(jié)劑濃度組合分別添加到1/2MS、MS、B5、N6和WPM的基本培養(yǎng)基中，分別將無菌苗莖段接種到以上5種基本培養(yǎng)基中，每處理10瓶，每瓶接3～4個莖段，接種30 d后觀察生長情況并統(tǒng)計分析數(shù)據(jù)。

增殖倍數(shù)=芽的增殖總數(shù)/接種單莖芽總數(shù)

1.2.3 生根培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)的組培苗剪切成帶2～3個腋芽莖段，接種到5種基本培養(yǎng)基上誘導(dǎo)生根，每處理10瓶，每瓶接4個莖段，接種20 d后觀察生長情況并進行數(shù)據(jù)分析。

由上述試驗篩選出最適宜誘導(dǎo)黑果枸杞組培苗生根的基本培養(yǎng)基，在該基本培養(yǎng)基中分別添加不同濃度的IBA、IAA和NAA，將無菌苗莖段接種到添加生長素的最適基本培養(yǎng)基中，每處理10瓶，每瓶接3個莖段，接種20 d后觀察生長情況并進行數(shù)據(jù)分析。

生根率=生長出根系的植株數(shù)/接種單莖芽的總數(shù)×100%

平均根數(shù)=生長出的根系總數(shù)/生長出根系的植株數(shù)×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合對黑果枸杞組培苗增殖的影響

將組培苗莖段接種到不同植物生長調(diào)節(jié)劑組合的MS培養(yǎng)基上，探究添加不同濃度6-BA與IBA、IAA、NAA組合對黑果枸杞組培苗增殖的影響。由表1可知，6-BA與NAA組合只促進黑果枸杞組培苗愈傷組織的形成，愈傷大，致密，淡綠色;而6-BA與IBA組合不同程度地促進了黑果枸杞組培苗的增殖，其中增殖倍數(shù)最高的組合為0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L IBA，增值倍數(shù)為4.93，且芽少，枝粗，葉片肥厚，第2組0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA處理還出現(xiàn)了玻璃化，甚至畸形的現(xiàn)象;在添加相同濃度的6-BA時，IAA對黑果枸杞組培苗增殖的影響要優(yōu)于IBA，以第8組（0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA）的增殖效果最好，增殖倍數(shù)最大，達到9.33，且苗生長狀況良好（圖1c）。

2.2 不同基本培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗增殖的影響

將組培苗莖段接種到0.5 mg/L 6-BA+0.5 mg/L IAA基本培養(yǎng)基上，探究不同基本培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗增殖的影響。由表2可知，基本培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗增殖均有不同程度的影響，1/2MS、N6和WPM培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗增殖影響較小，芽少，增殖倍數(shù)低;B5培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗增殖的影響最小，增殖倍數(shù)僅1.00，且生長一般;MS培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗的增殖效果最好，增值倍數(shù)達到8.83倍，且生長狀況良好。

2.3 不同基本培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗生根的影響

將組培苗莖段接種到不含激素的不同基本培養(yǎng)基上，研究不同基本培養(yǎng)基對黑果枸杞組培苗生根的影響。由表3可知，N6培養(yǎng)基上接種的組培苗生根率為0，對黑果枸杞組培苗生根不僅沒有促進作用，還抑制黑果枸杞組培苗的生根;1/2MS和MS培養(yǎng)基上的組培苗雖然生根株數(shù)少，但是生長較好，無愈傷;B5培養(yǎng)基上的組培苗不僅生根率低，且生長不佳;WPM培養(yǎng)基上生長的組培苗生根率最高，達到97.5%，有利于黑果枸杞組培苗的生根。

2.4 不同生長素對黑果枸杞組培苗生根的影響

將組培苗莖段接種到添加不同生長素的WPM培養(yǎng)基上，研究不同濃度IAA、IBA、NAA對黑果枸杞組培苗生根的影響。由表4可知，NAA只促進黑果枸杞組培苗愈傷組織的形成，對生根沒有幫助，IBA和IAA不同程度地抑制了黑果枸杞組培苗生根，其中，IBA對組培苗的生根抑制程度較大，但根系發(fā)達粗壯，適合壯苗，IAA對組培苗的生根抑制程度較小，根纖細。以第1組（不添加生長素的WPM培養(yǎng)基）生根效果最好（圖1d），生根率達95.0%，平均生根條數(shù)最多，達到了7.42條，生長狀況較好?？梢姡谂囵B(yǎng)基中添加生長素反而不利于其生根。

3 討論

降低黑果枸杞外植體污染率是研究黑果枸杞快繁技術(shù)要解決的重要問題，通常選用的外植體都比較幼嫩，經(jīng)過消毒滅菌會對植物組織造成不同程度的損傷，但取自田間的外植體又存在帶菌較多的問題，較難徹底消毒滅菌。該試驗通過直接對黑果枸杞種子進行消毒滅菌處理，將滅過菌的種子直接接入基本培養(yǎng)基即可生長出無菌的幼嫩植株，再由無菌植株得到無菌莖段直接進行腋芽的誘導(dǎo)，避免了對幼嫩莖段的損傷，有效解決了無菌系建立所面臨的污染率較高的問題。

同一試驗材料，若外植體的取材時間和來源不同，所需要的培養(yǎng)條件也會對增殖倍數(shù)產(chǎn)生不同影響。馬彥軍等[14]對甘肅省永靖縣黑果枸杞嫩枝進行組織培養(yǎng)研究，通過試驗得出，誘導(dǎo)黑果枸杞增殖的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.1 mg/L+NAA 0.2 mg/L，增值倍數(shù)達到3.58。而該試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)黑果枸杞增殖的最佳培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5 mg/L+IAA 0.5 mg/L，且NAA只促進黑果枸杞組培苗愈傷組織的形成，難以促進其增殖。馬彥軍等[14]研究所用的外植體是7月份直接取自田間的黑果枸杞嫩枝，而筆者選用的莖段取自無菌種子長出的45 d組培苗。由此可知，篩選黑果枸杞增殖的最適培養(yǎng)基配方需要嚴(yán)格考察外植體的多方面因素，并且該試驗對種子進行消毒滅菌，利用無菌莖段直接進行快繁技術(shù)研究，極大地降低了污染率。

提高生根率對于黑果枸杞快繁體系的建立意義重大。楊寧等[15]對甘肅省民勤縣黑果枸杞種子進行組織培養(yǎng)研究，通過試驗得出誘導(dǎo)黑果枸杞生根的最適培養(yǎng)基配方為MS+IBA 0.1 mg/L+蔗糖5 g/L，生根率為95%。而該試驗結(jié)果表明，誘導(dǎo)黑果枸杞增殖的最佳培養(yǎng)基為不添加任何生長素的WPM，黑果枸杞組培苗的生根率高達97.5%，平均根數(shù)為7.55條，平均根長為6.48 cm，且根系多，生長較好，無愈傷。楊寧等[15]研究了不同濃度IBA對黑果枸杞組培苗生根的影響，而該試驗選擇3種生長素及5種基本培養(yǎng)基作比較，結(jié)果表明，生長素會抑制黑果枸杞組培苗的生根，而NAA可促進愈傷組織的形成。

在誘導(dǎo)黑果枸杞增殖培養(yǎng)時，0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA出現(xiàn)玻璃化現(xiàn)象，甚至出現(xiàn)畸形苗，這與其他相關(guān)研究有較大差異[14-16]。該研究中，各種植物生長調(diào)節(jié)劑的組合均對黑果枸杞增殖產(chǎn)生一定作用，而各種生長素會抑制黑果枸杞組培苗的生根，不添加任何激素WPM為促進黑果枸杞組培苗生根的最適培養(yǎng)基配方，可見今后需對優(yōu)化黑果枸杞組培快繁技術(shù)進行進一步研究。

4 結(jié)論

該研究結(jié)果表明，誘導(dǎo)黑果枸杞增殖的最適培養(yǎng)基配方為MS+6-BA 0.5? mg/L+IAA 0.5? mg/L，誘導(dǎo)黑果枸杞生根的最適培養(yǎng)基配方為不添加任何激素的WPM，不管是生根試驗還是增殖試驗，添加NAA都會促進愈傷組織的形成，但不利于生根或增殖;IAA與6-BA的組合有利于黑果枸杞的增殖。該研究通過對增殖速度和生根時間進行調(diào)控，實現(xiàn)了優(yōu)質(zhì)、高效快繁黑果枸杞種苗的目的。但是該試驗僅篩選了部分植物生長調(diào)節(jié)劑的組合進行研究，因此對黑果枸杞組培快繁技術(shù)仍有很大的研究空間。

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