非小細(xì)胞肺癌患者外周血自然殺傷細(xì)胞受體表達(dá)及與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系研究

張靖悅，鄭光輝，楊常建，閆建強(qiáng)

平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，河南 平頂山 467000

非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）是最常見(jiàn)的肺癌類(lèi)型，約占肺癌總數(shù)的80%，由于NSCLC的早期癥狀不明顯，許多患者在就診時(shí)已發(fā)展到中晚期，導(dǎo)致預(yù)后極差，病死率高[1]，故早期診斷和積極治療是NSCLC防治的關(guān)鍵。正常生理狀態(tài)下免疫系統(tǒng)能夠清除突變細(xì)胞，而NSCLC的發(fā)生發(fā)展與腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視密切相關(guān)[2]。自然殺傷（natural killer，NK）細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞，可直接殺傷腫瘤細(xì)胞，其細(xì)胞表面包括可激發(fā)NK細(xì)胞產(chǎn)生殺傷作用的活化性受體[自然殺傷細(xì)胞2族成員D（natural killer group 2 member D，NKG2D）、自然殺傷細(xì)胞活化性受體p30（natural killer p30，NKp30）、自然殺傷細(xì)胞活化性受體 p44（natural killer p44，NKp44）等]和抑制NK細(xì)胞殺傷作用的抑制性受體[自然殺傷細(xì)胞2族 成 員 A（natural killer group 2 member A，NKG2A）、CD158a、CD158b][3-4]。腫瘤細(xì)胞可通過(guò)抑制活化性受體的表達(dá)及促進(jìn)抑制性受體的表達(dá)，而削弱NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫監(jiān)視及清除作用[5-6]。腫瘤標(biāo)志物是腫瘤輔助診斷的新突破，對(duì)NSCLC的早期診斷有一定價(jià)值[7-8]。因此，本研究擬分析NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體的表達(dá)及與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2018年1月至2020年12月平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院收治的NSCLC患者的病歷資料。納入標(biāo)準(zhǔn)：均經(jīng)病理檢查診斷為NSCLC；首次發(fā)病；未接受過(guò)放化療等抗腫瘤治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并急性感染性疾??；既往有腫瘤病史。根據(jù)納入、排除標(biāo)準(zhǔn)，共納入122例NSCLC患者作為NSCLC組，其中，男性73例，女性49例；年齡36～85歲，平均（59.68±11.24）歲；病理類(lèi)型：腺癌62例，鱗狀細(xì)胞癌41例，大細(xì)胞癌19例；TNM分期：Ⅰ～Ⅱ期47例，Ⅲ～Ⅳ期75例。另選取同期在平煤神馬醫(yī)療集團(tuán)總醫(yī)院體檢的46例健康體檢者作為對(duì)照組，其中男性29例，女性17例；年齡32～81歲，平均（61.34±9.46）歲。兩組研究對(duì)象性別、年齡比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 檢測(cè)方法

1.2.1 樣本采集采集兩組研究對(duì)象空腹外周靜脈血各兩管，每管采集5 ml，其中一管用于外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)檢測(cè)，需于采集后2 h內(nèi)檢測(cè)，另一管用于血清腫瘤標(biāo)志物水平檢測(cè)，待離心分離血清后，可于-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.2.2 外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)檢測(cè)每個(gè)流式管中加入50 μl全血，再加入5 μl anti-CD3-FITC、anti-CD56-APC、anti-CD16-Per CP，然后每管再分別加入5 μl單克隆抗體（anti-NKG2D-PE、anti-NKp30-PE、anti-NKp44-PE、anti-NKG2A-PE、anti-CD158a-PE、anti-CD158b-PE），同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組，加入相同熒光標(biāo)記的同種免疫球蛋白。各組樣本經(jīng)充分混勻后，在室溫下放置20 min，再加入細(xì)胞裂解液室溫靜置10 min，再加入磷酸鹽緩沖液振蕩混勻，再用磷酸鹽緩沖液洗滌2次，然后使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 血清腫瘤標(biāo)志物水平檢測(cè)采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)兩組研究對(duì)象血清腫瘤標(biāo)志物[癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、細(xì)胞角質(zhì)蛋白19片段抗原21-1（cyto-keratin 19 fragment antigen 21-1，CYFRA21-1）、神經(jīng)元特異性烯醇化酶（neuron specific enolase，NSE）]水平，試劑盒均購(gòu)自瑞士羅氏公司，實(shí)驗(yàn)操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 20.0軟件處理數(shù)據(jù)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩組比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以例數(shù)表示，相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)水平的比較

NSCLC組患者NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達(dá)水平均明顯低于對(duì)照組，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達(dá)水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表1）

表1 兩組研究對(duì)象外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)水平的比較（%，x-± s）

2.2 不同病理類(lèi)型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)水平的比較

不同病理類(lèi)型的NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)水平比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；Ⅲ～Ⅳ期NSCLC患者NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達(dá)水平均明顯低于Ⅰ～Ⅱ期患者，抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達(dá)水平均明顯高于Ⅰ～Ⅱ期患者，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=11.205、4.725、3.002、7.162、5.287、8.112，P＜0.01）。（表2）

表2 不同病理類(lèi)型及TNM分期NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)水平（%，x-± s）

2.3 血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較

NSCLC組患者血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。（表3）

表3 兩組研究對(duì)象血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較（ng/ml，±s）

表3 兩組研究對(duì)象血清腫瘤標(biāo)志物水平的比較（ng/ml，±s）

組別NSCLC組（n=122）對(duì)照組（n=46）t值CEA 37.36±3.83 1.47±0.52 63.220 CYFRA21-1 10.95±2.62 1.92±0.50 23.176 NSE 17.06±1.99 7.65±2.42 25.712 P值0.0000.0000.000

2.4 NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，NSCLC患者活化性受 體 NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達(dá)與CEA水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與CYFRA21-1、NSE均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。（表4）

表4 NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的相關(guān)性

3 討論

NSCLC是肺癌中最常見(jiàn)的組織類(lèi)型，國(guó)內(nèi)外的發(fā)病率和病死率均位居前列[9]。近年來(lái)，盡管肺癌的臨床診治方法得到了不斷提高與更新，也開(kāi)始出現(xiàn)新的化療藥物及免疫治療藥物，但患者的整體預(yù)后仍不理想，這主要是由于多數(shù)患者在確診時(shí)已處于晚期階段[10-11]。目前，有關(guān)NSCLC的早期診斷和治療仍是中國(guó)乃至世界范圍需要迫切解決的一個(gè)重要難題。

細(xì)胞免疫系統(tǒng)是體內(nèi)對(duì)抗腫瘤細(xì)胞的重要武器，主要的免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞、B細(xì)胞、NK細(xì)胞，而NK細(xì)胞又是抵抗腫瘤細(xì)胞的第一道防線(xiàn)[12-13]。NK細(xì)胞表面受體按功能不同分為活化性受體和抑制性受體，NK細(xì)胞的活化受活化性受體和抑制性受體表達(dá)的調(diào)控[14]，正常情況下，活化性受體的上調(diào)可激活NK細(xì)胞，從而發(fā)揮直接殺傷腫瘤的作用，而且活化的NK細(xì)胞還可以通過(guò)誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子和趨化因子的釋放而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)及殺傷靶細(xì)胞的作用[15-16]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組患者NK細(xì)胞活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44表達(dá)均明顯低于對(duì)照組（P＜0.01），抑制性受體NKG2A、CD158a、CD158b表達(dá)均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），且不同TNM分期的NSCLC組患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)存在明顯差異（P＜0.01），提示NK細(xì)胞活化性受體表達(dá)的降低和抑制性受體表達(dá)的升高可能與NSCLC的發(fā)生及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

腫瘤標(biāo)志物是一種化學(xué)類(lèi)物質(zhì)，對(duì)臨床疾病診斷和評(píng)估患者的預(yù)后有著重要意義[17]，近年來(lái)其也獲得了越來(lái)越多的關(guān)注，其中CEA、CYFRA21-1、NSE是用于輔助診斷NSCLC的常用腫瘤標(biāo)志物[18-19]。本研究結(jié)果顯示，NSCLC組患者血清腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均明顯高于對(duì)照組（P＜0.01），這與以往的研究報(bào)道一致[20-21]。

然而，目前尚不清楚NSCLC患者外周血NK細(xì)胞表面受體與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系。本研究通過(guò)Pearson相關(guān)性分析研究了NSCLC患者外周血NK細(xì)胞受體表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物的關(guān)系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)NSCLC患者活化性受體NKG2D、NKp30、NKp44及抑制性受體CD158a、CD158b表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物CEA、CYFRA21-1、NSE水平均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）；NSCLC患者抑制性受體NKG2A表達(dá)與CEA 水平呈正相關(guān)（P＜0.05），與 CYFRA21-1、NSE均無(wú)相關(guān)性（P＞0.05）。提示NK細(xì)胞表面受體與腫瘤標(biāo)志物有一定關(guān)系，但由于納入的樣本量有限需要在今后進(jìn)行更大規(guī)模的驗(yàn)證，以明確二者的關(guān)系。

綜上所述，NSCLC患者外周血NK細(xì)胞活化性受體表達(dá)降低，抑制性受體表達(dá)升高，其中活化性受體表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物無(wú)相關(guān)性，抑制性受體NKG2A表達(dá)與腫瘤標(biāo)志物CEA呈正相關(guān)。