小麥DBB基因家族的生物信息學(xué)與表達(dá)分析

摘要：為了解小麥DBB轉(zhuǎn)錄因子基因家族成員的基本特征，分析其在基因結(jié)構(gòu)、蛋白結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹、染色體定位、不同物種間的進(jìn)化情況，并對(duì)小麥DBB基因家族成員在小麥不同組織中的表達(dá)水平進(jìn)行分析?；谛←溨袊旱幕蚪M數(shù)據(jù)，共鑒定得到29個(gè)DBB基因家族成員，它們不均勻地分布在小麥15條染色體上；系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹將小麥DBB蛋白分為4個(gè)亞族，其中擬南芥DBB基因家族成員在聚類中顯示出明顯的特異性，與其他物種具有較遠(yuǎn)的進(jìn)化關(guān)系；motif1位于小麥DBB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域，大部分TaDBB基因含有2～3個(gè)外顯子，最多為5個(gè)外顯子；小麥DBB基因的啟動(dòng)子區(qū)域具有豐富的調(diào)控植物生長發(fā)育、響應(yīng)激素以及非生物脅迫的順式作用元件，暗示TaDBB基因在調(diào)控小麥生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著多種潛在作用；小麥DBB基因在基因組內(nèi)的進(jìn)化主要是通過基因片段復(fù)制完成的，且同源基因間的片段復(fù)制在進(jìn)化過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用；不同物種間的進(jìn)化結(jié)果表明，小麥DBB基因與玉米具有更近的親緣關(guān)系；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的基因表達(dá)譜分析顯示，TaDBB1、TaDBB15和TaDBB21基因的表達(dá)具有明顯的組織特異性。該結(jié)果將為后續(xù)解析DBB基因在小麥中的生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：小麥；DBB基因家族；生物信息學(xué)；表達(dá)分析

中圖分類號(hào)：S512.103；S330 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-1302（2024）18-0059-09

收稿日期：2024-03-11

基金項(xiàng)目：國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（編號(hào)：2017YFD0301101、2023YFD2301502）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（編號(hào)：232102110018）。

作者簡介：連少英（1985—），女，河南滑縣人，碩士，助理研究員，主要從事植物保護(hù)與小麥遺傳育種研究。E-mail：lianshaoying@126.com。

通信作者：李 磊，博士，研究員，主要從事小麥遺傳育種研究，E-mail：lilei@henau.edu.cn；倪永靜，碩士，副研究員，主要從事植物保護(hù)與小麥遺傳育種研究，E-mail：nyj317@163.com。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors，TFs） 可以激活或抑制植物體內(nèi)靶基因的轉(zhuǎn)錄，在調(diào)控基因表達(dá)方面發(fā)揮著重要作用^［1］。目前，小麥至少包括56個(gè)轉(zhuǎn)錄因子類基因家族^［2］。鋅指蛋白是一類具有B-box結(jié)構(gòu)域鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子家族，該家族成員按照結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和種類可以分為不同的亞家族^［3］。其中，含有B-box 基序的蛋白稱為 BBX，DBB（double B-Box）家族是鋅指蛋白的一個(gè)亞家族，DBB蛋白的突出特點(diǎn)是N端具有2個(gè)或以上的B-Box結(jié)構(gòu)域，且C端缺乏CCT結(jié)構(gòu)域^［4］。

在擬南芥中共鑒定得到32個(gè)BBX蛋白成員，其中8個(gè)成員為DBB蛋白^［5］。隨后，越來越多的證據(jù)表明，植物BBX蛋白不僅參與植物的生長發(fā)育過程，在葉片發(fā)育、根的生長、果實(shí)發(fā)育、開花誘導(dǎo)等多種生理生化過程和非生物脅迫反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用^［6］。CONSTANS （CO）/AtBBX1是首個(gè)被研究的擬南芥BBX基因，該基因通過觸發(fā)Flowering Locus T （FT）基因的表達(dá)來調(diào)控開花時(shí)。在長日照條件下，co突變體顯著延遲開花時(shí)間，而在長日照和短日照條件下，co過表達(dá)的轉(zhuǎn)基因植物都提前開花^［7］。其他的BBX基因如BBX4、BBX7和BBX32，被發(fā)現(xiàn)調(diào)控開花時(shí)間^［8］，至少有10個(gè)BBX基因已被確定為早期光形態(tài)發(fā)生的調(diào)節(jié)因子^［9］。BBX蛋白也參與非生物應(yīng)激反應(yīng)和激素信號(hào)網(wǎng)絡(luò)。例如，BBX18和BBX23是熱形態(tài)形成的調(diào)節(jié)因子，BBX18和BBX23的缺陷突變導(dǎo)致熱響應(yīng)性下胚軸伸長減少^［10］。在擬南芥中，BBX24最初是作為一種耐鹽蛋白（STO）分離出來的，可增加酵母細(xì)胞的耐鹽活性^［9］。在擬南芥中過表達(dá)BBX24可促進(jìn)高鹽度條件下根系的生長^［11］。BBX19是DBB蛋白的一種，在擬南芥中被鑒定為光形態(tài)發(fā)生的負(fù)調(diào)節(jié)因子，在植物激素脫落酸（ABA）的抑制作用和光的促進(jìn)作用之間具有重要的連接作用。

隨著越來越多植物基因組測序的完成，不同植物的DBB基因家族成員也逐漸被鑒定出來，包括水稻^［12］、玉米^［5］、白菜^［11］、葡萄^［13］、橡膠樹^［14］等。小麥作為一種重要糧食作物，鑒定和研究小麥DBB基因家族成員具有重要的意義。本研究，系統(tǒng)分析了小麥DBB基因家族成員的結(jié)構(gòu)特征、系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系、染色體位置和基因進(jìn)化過程中的共線性關(guān)系，同時(shí)進(jìn)一步探討了其在不同小麥組織中的表達(dá)模式，研究結(jié)果可為進(jìn)一步深入分析小麥DBB基因家族的功能提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

本試驗(yàn)于2024年2月在河南省商丘市農(nóng)林科學(xué)院內(nèi)完成。

1.2 小麥DBB基因家族成員鑒定

利用已公開的小麥基因組版本IWGSC refseqv1.1 （http：//plants.ensembl.org/）的基因組序列和蛋白序列對(duì)小麥DBB基因家族成員進(jìn)行鑒定。下載已報(bào)道的擬南芥DBB蛋白序列，使用BLASTP在小麥數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行檢索。同時(shí)，從Pfam數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載DBB基因?qū)?yīng)的隱馬爾可夫模型PF00643，使用HMMER 3.3^［15］（http：//www.hmmer.org/）搜索DBB基因家族成員，以e值≤1×10^-5作為篩選閾值。

考慮到小麥基因組中每個(gè)基因可能有多個(gè)轉(zhuǎn)錄本，采用最長轉(zhuǎn)錄本對(duì)應(yīng)的氨基酸序列來鑒定DBB基因家族成員。所有候選基因通過CDD （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/bwrpsb/bwrpsb.cgi）和SMART程序（http：//smart.embl-heidelberg.de/）進(jìn)一步檢測，以證實(shí)B-Box蛋白保守結(jié)構(gòu)域的存在。

1.3 小麥DBB基因家族成員序列分析

利用在線程序Gene Structure Display Server （http：//www.gsds.cbi.pku.edu.cn）確定并繪制小麥DBB基因家族成員的外顯子-內(nèi)含子結(jié)構(gòu)。利用蛋白質(zhì)序列分析的MEME在線程序（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）鑒定小麥DBB基因家族成員中的保守基序，MEME參數(shù)設(shè)置為：motif發(fā)現(xiàn)模式為經(jīng)典模式，位點(diǎn)分布為Zero or One Occurrence Per Sequence （zoops），motif發(fā)現(xiàn)的最大數(shù)目為5，其他參數(shù)為默認(rèn)值。

1.4 小麥DBB基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析與分類

采用MEGA 7.0（http：//www.megasoftware.net/）軟件的Neighbor-Joining （NJ）方法繪制小麥、水稻、玉米和擬南芥共4種植物DBB基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)化樹構(gòu)建選擇泊松分布模型、雙端比較，bootstrap設(shè)置為1 000次。

1.5 小麥DBB基因啟動(dòng)子順式作用元件分析

從植物基因組數(shù)據(jù)庫 （http：//plants.ensembl.org/）檢索各小麥DBB基因編碼區(qū)上游2 000 bp的啟動(dòng)子序列。使用PlantCARE的在線程序（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）進(jìn)行DBB基因順式作用元件的預(yù)測^［16］。

1.6 小麥DBB基因家族成員染色體分布

基于小麥基因組數(shù)據(jù)庫中的物理位置信息，使用Circos軟件^［17］將所有DBB基因家族成員定位到小麥染色體上。采用多重共線性掃描工具（Multiple Collinearity Scan toolkit，MCScanX）分析基因重復(fù)事件，參數(shù)默認(rèn)^［18］。

1.7 小麥DBB基因家族成員的比較基因組分析

使用共線性繪圖軟件Multiple Systeny Plot （https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）繪制分別繪制小麥-擬南芥、小麥-玉米、小麥-水稻基因組之間的DBB基因家族成員共線圖，進(jìn)行比較基因組分析。

1.8 小麥DBB基因家族成員在小麥各器官組織中的表達(dá)分析

原始基因表達(dá)數(shù)據(jù)從小麥表達(dá)瀏覽器（http：//www.wheat-expression.com/）下載。對(duì)來自六倍體春小麥品種Azhurnaya的測序數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)來自根、莖、旗葉、幼穗、雄蕊、雌蕊、籽粒等7個(gè)重要的小麥組織或器官?；虮磉_(dá)水平由每百萬轉(zhuǎn)錄本（TPM）值估計(jì)，并以log₂轉(zhuǎn)換的規(guī)范化TPM表示，熱圖的可視化由TBtools軟件繪制^［19］。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥DBB基因家族成員的鑒定結(jié)果

利用隱馬爾可夫（HMM）模型，在小麥基因組中共獲得29個(gè)DBB基因家族成員，對(duì)這些蛋白序列進(jìn)一步驗(yàn)證B-Box結(jié)構(gòu)域的存在，發(fā)現(xiàn)這29個(gè)DBB蛋白序列在N端都含有2個(gè)B-Box蛋白保守結(jié)構(gòu)域（圖1）。因此，可以判定小麥DBB基因家族共有29個(gè)成員。

根據(jù)小麥DBB基因家族的29個(gè)成員在染色體上的位置信息，對(duì)其進(jìn)行命名為TaDBB1～TaDBB29（表1），每個(gè)基因?qū)?yīng)唯一的轉(zhuǎn)錄本。29個(gè)TaDBB基因不均勻地分布在除1號(hào)染色體（包括1A、1B和1D）和4號(hào)染色體（包括4A、4B和4D）的15條染色體上。對(duì)TaDBB蛋白進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，TaDBB蛋白序列的氨基酸長度范圍為211～363 aa，分子量為22.05～38.77 ku，等電點(diǎn)（pI）為4.32～6.04，且全部為酸性蛋白（pI<7.5），表明小麥DBB蛋白在理化性質(zhì)上存在差異，暗示其基因功能的多樣性，表明這些成員可能在小麥生長發(fā)育過程中發(fā)揮著不同的調(diào)控作用。

2.2 小麥DBB基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育分析

為研究小麥DBB基因家族成員的系統(tǒng)發(fā)育，將小麥DBB基因家族成員與擬南芥、玉米、水稻等3個(gè)物種進(jìn)行聚類分析（圖2），29個(gè)DBB蛋白分為Group1、Group2、Group3和Group4共4個(gè)亞族，擬南芥僅存在于Group1、Group2和Group3這3個(gè)亞族中，且擬南芥DBB顯示出其聚類的特異性，與其他物種進(jìn)化關(guān)系較遠(yuǎn)。此外，聚類的4個(gè)亞族中均存在小麥、水稻和玉米的DBB基因家族成員，顯示小麥、水稻和玉米的DBB基因之間具有較為緊密的聚類關(guān)系，推測其功能相似。

2.3 小麥DBB蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)分析

小麥DBB基因家族成員的蛋白保守基序表現(xiàn)出一定的差異，其中motif1在29個(gè)蛋白序列中均有分布，因此推測motif1位于小麥DBB蛋白的保守結(jié)構(gòu)域。motif2在除TaDBB26蛋白外的其他28個(gè)TaDBB蛋白序列中都有分布，且主要分布在蛋白序列的N端，motif3存在于除TaDBB11、TaDBB12、TaDBB13、TaDBB26的其他25個(gè)TaDBB蛋白序列中，其他的motif4存在于除TaDBB3、TaDBB5、TaDBB7、TaDBB16、TaDBB19和TaDBB22的其他23個(gè)TaDBB蛋白序列中。此外，motif5和motif6在不同的DBB蛋白序列中也表現(xiàn)出差異（圖3）。

小麥DBB基因家族成員的基因結(jié)構(gòu)存在一定的差異（圖3），具體表現(xiàn)在外顯子和內(nèi)含子數(shù)量上的差異，其中TaDBB11、TaDBB12和TaDBB13分別含有5個(gè)外顯子，具有最多的外顯子；大部分TaDBB基因含有2～3個(gè)外顯子，基因聚類發(fā)現(xiàn)，每個(gè)聚類的基因簇具有相似的基因結(jié)構(gòu)，比如TaDBB3、TaDBB5和TaDBB7為一簇；TaDBB16、TaDBB19和TaDBB22為一簇；TaDBB23、TaDBB25和TaDBB28為一簇等，推測其基因功能相似。根據(jù)蛋白保守基序和基因結(jié)構(gòu)的分析結(jié)果，在一定程度上反映出不同DBB基因之間的差異性，以及同源基因蛋白功能的相似性。

2.4 小麥DBB基因家族成員順式作用元件分析

小麥DBB基因的啟動(dòng)子具有豐富的順式作用元件（圖4），其中與植物生長發(fā)育相關(guān)的順式作用元件主要包括ARE、CAT-box、GC-motif、GCN4-motif、O2-site、RY-element、TGA-element；與脅迫相關(guān)的順式作用元件CCAAT-Box、LTR、MBS、MRE、TC-rich repeats，每個(gè)DBB基因都同時(shí)包含1個(gè)或多個(gè)與植物生長發(fā)育相關(guān)或與脅迫相關(guān)的順式作用元件，這些順式作用元件表明TaDBB基因在調(diào)控小麥生長發(fā)育和脅迫響應(yīng)中發(fā)揮著多種潛在作用。

2.5 小麥DBB基因家族成員的染色體定位和共線性分析

小麥DBB基因家族成員不均勻地分布在小麥15條染色體上（除1號(hào)和4號(hào)染色體），其中6號(hào)染色體上具有最多的TaDBB基因數(shù)量，共9個(gè)；3號(hào)和5號(hào)染色體各含有3個(gè)TaDBB基因。基因在染色體上的數(shù)量信息可以在一定程度上反映出其進(jìn)化時(shí)間的長短。

通過共線性分析進(jìn)一步探索DBB基因家族成員在小麥基因組內(nèi)的進(jìn)化機(jī)制，在小麥基因組內(nèi)共發(fā)現(xiàn)了40個(gè)同源基因?qū)Τ霈F(xiàn)片段復(fù)制（TaDBB1∶4、TaDBB 3∶5、TaDBB 1∶6等）（圖5），共線性關(guān)系主要以片段復(fù)制的形式存在與同源染色體間，未發(fā)現(xiàn)有串聯(lián)復(fù)制事件的發(fā)生。如2A、2B和2D之間存在6個(gè)共線性基因?qū)Γ?A、3B和3D之間存在3個(gè)共線性基因?qū)Γ?A、5B和5D之間存在3個(gè)共線性基因?qū)Γ?A、6B和6D之間存在9個(gè)共線性基因?qū)Γ?A、7B和7D之間存在6個(gè)共線性基因?qū)?；值得一提的是，在不同染色體間（2號(hào)染色體和6號(hào)染色體）也存在大量的共線性基因?qū)?，?3個(gè)共線性基因?qū)?，表明DBB基因在2號(hào)染色體和6號(hào)染色體經(jīng)歷了更長的進(jìn)化時(shí)間，TaDBB基因在小麥基因組內(nèi)的進(jìn)化主要是通過基因片段復(fù)制完成的，且同源基因間的片段復(fù)制在進(jìn)化過程中發(fā)揮著主導(dǎo)作用。

2.6 小麥DBB基因家族成員的比較基因組分析

對(duì)小麥和其他3個(gè)代表性植物（包括十字花科模式植物擬南芥、水稻和玉米）進(jìn)行不同基因組間的共線性分析（圖6）。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，小麥和擬南芥的基因組中不存在DBB基因的共線性關(guān)系；小麥和水稻的基因組間存在38個(gè)DBB基因的共線性關(guān)系；小麥和玉米的基因組中存在51個(gè)DBB基因的共線性關(guān)系，小麥和玉米基因組擁有的共線性基因?qū)?shù)目最多。表明DBB基因在雙子葉植物中擁有更快的進(jìn)化速度，且相比水稻，DBB基因在小麥和玉米之間具有更近的親緣關(guān)系。

2.7 TaDBB基因在不同組織中的表達(dá)模式

對(duì)29個(gè)TaDBB基因家族成員的表達(dá)模式進(jìn)行分析，結(jié)果（圖7）表明，TaDBB基因在不同的植物組織中表達(dá)模式具有明顯差異。總體來看，小麥DBB家族基因主要在小麥葉片的生長發(fā)育中具有較高的表達(dá)水平，大部分基因在小麥各個(gè)組織的表達(dá)水平接近，一般表現(xiàn)出基因表達(dá)水平較低或者不表達(dá)，如TaDBB5、TaDBB6、TaDBB8、TaDBB9和TaDBB10，推測這些基因在小麥的生長發(fā)育過程中發(fā)揮著較為基礎(chǔ)的作用以保障小麥正常的生長發(fā)育。部分基因的表達(dá)水平表現(xiàn)出明顯的組織特異性，如TaDBB1、TaDBB15和TaDBB21在小麥的旗葉中表達(dá)水平顯著較高。

3 討論與結(jié)論

本研究中鑒定得到29個(gè)小麥DBB基因家族成員，將小麥與擬南芥、水稻、玉米的DBB基因進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，所有DBB基因可劃分為4個(gè)亞類（圖2）。同一亞家族中大多數(shù)DBB基因具有相似的外顯子/內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，具有相似結(jié)構(gòu)的GRF基因具有相似的進(jìn)化歷史和功能，在一定程度上反映了植物DBB基因的進(jìn)化關(guān)系^［20］。在每個(gè)分支中，擬南芥的DBB基因與其他物種的DBB基因都表現(xiàn)出更遠(yuǎn)的親緣關(guān)系，而單子葉（小麥、水稻和玉米）的DBB基因則聚集在一起，表明單子葉和雙子葉分化后DBB基因是分開進(jìn)化的，這一發(fā)現(xiàn)與報(bào)道的結(jié)果^［21］一致，基因的串聯(lián)復(fù)制事件和片段復(fù)制事件在基因家族成員的擴(kuò)增中起著至關(guān)重要的作用。

本研究對(duì)小麥DBB基因家族的串聯(lián)復(fù)制和片段復(fù)制進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，在小麥基因組中，發(fā)現(xiàn)存在大量片段復(fù)制的基因?qū)?，未發(fā)現(xiàn)串聯(lián)復(fù)制。結(jié)果表明，小麥DBB基因家族的擴(kuò)增主要是通過片段重復(fù)事件進(jìn)行的。此外，在其他的小麥基因家族中也發(fā)現(xiàn)有類似的基因家族進(jìn)化的潛在機(jī)制^［22］。通過分析DBB基因在不同組織或部位的表達(dá)模式可以預(yù)測其基因功能的多樣性，研究發(fā)現(xiàn)，DBB基因不僅具有不同的基因結(jié)構(gòu)，不同的基因表達(dá)模式也有很大的差異，但基因的表達(dá)模式與啟動(dòng)子密切相關(guān)^［23］。到目前為止，DBB基因的功能研究大多集中在擬南芥中進(jìn)行，大多數(shù)TaDBBs也具有典型的組織特異性表達(dá)譜，表明它們在小麥發(fā)育中的不同功能。值得一提的是，有研究表明，DBB基因在擬南芥中與光信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑有關(guān)，本研究發(fā)現(xiàn)，TaDBB1、TaDBB15和TaDBB21在小麥的旗葉中表達(dá)水平顯著較高，具有明顯的組織特異性，該發(fā)現(xiàn)可以為研究小麥的葉片發(fā)育提供重要參考。

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