復(fù)方萬(wàn)年青膠囊與順鉑注射液聯(lián)用對(duì)肝癌荷瘤小鼠免疫功能的影響

石 菊，佟志軍，于艷輝，宋德庫(kù)，曲笑鋒，唐曉桐，徐 建，鄢必新*

（1.吉林修正藥業(yè)新藥開(kāi)發(fā)有限公司，吉林 130103；2.吉林天立泰藥業(yè)有限公司，吉林 134400）

肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤，死亡率居惡性腫瘤的第3位，中國(guó)是肝癌的高發(fā)國(guó)家，其患者總量約占全球的55%。肝癌具有起病隱匿、病情發(fā)展迅速、易轉(zhuǎn)移、患者生存期短等特點(diǎn)，目前臨床治療主要根據(jù)肝癌的不同階段進(jìn)行個(gè)體化綜合，主要包括手術(shù)、放化療等[1]。順鉑注射液是臨床應(yīng)用較廣泛的抗腫瘤藥物，其副作用主要為消化道反應(yīng)、腎臟毒性、骨髓抑制以及聽(tīng)神經(jīng)毒性，導(dǎo)致臨床治療效果并不十分理想。隨著現(xiàn)代中醫(yī)學(xué)對(duì)腫瘤研究的深入，中藥聯(lián)合化療藥物抗腫瘤的優(yōu)勢(shì)日益凸顯，不僅能夠提高化療藥物的療效，還可以減輕化療藥物的不良反應(yīng)。復(fù)方萬(wàn)年青膠囊以虎眼萬(wàn)年青為主要成分，配以人參、黃芪、全蝎等制成，解毒化瘀，扶正固本。適用于肺癌、肝癌、胃癌化療合并用藥，具有減毒增效作用的中藥抗癌藥物。目前已被用于對(duì)肺癌、肝癌、胃癌的輔助治療，在改善免疫系統(tǒng)、治療腫瘤、抗氧化等方面發(fā)揮重要作用，有利于改善化療藥物對(duì)病人的損傷。本研究探討了復(fù)方萬(wàn)年青膠囊與順鉑注射液聯(lián)合應(yīng)用治療腫瘤以及減緩化療藥物毒副作用影響，為肝癌的更深一步研究治療提供幫助。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

BALB/c小鼠168只，SPF級(jí)，雌雄各半，體重18-22g，購(gòu)自長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司[合格證號(hào)：SCXK（吉）2020-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊（吉林天立泰藥業(yè)有限公司，0.4g×36s）；順鉑注射液（江蘇豪森藥業(yè)集團(tuán)有限公司，6mL:30mg×5支/盒）；碘伏（德州德新康消毒制品有限公司）；印度墨汁（源葉生物有限公司）；碳酸鈉（北京化工廠）；乳酸脫氫酶（LDH）、腫瘤壞死因子（TNFα）、白介素-2（IL-2）、免疫球蛋白M（IgM）、免疫球蛋白G（IgG）試劑盒（南京建成生物工程研究所）。

1.3 細(xì)胞株

人慢性骨髓性白血病K562細(xì)胞（賽百康），小鼠肝癌H22細(xì)胞（北納創(chuàng)聯(lián)）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 制備肝癌H22細(xì)胞懸液

小鼠腹腔接種H22瘤液后，待腹部出現(xiàn)明顯的腹水處死，仰臥固定，消毒皮膚，用眼科剪小心剝離表皮，露出外膜，抽取腹腔腫瘤積液，以0.9%氯化鈉注射液稀釋，調(diào)整細(xì)胞濃度至2.0×106個(gè)/mL，放在冰浴中備用。

2.2 模型復(fù)制及分組給藥[2-4]

將BALB/C小鼠隨機(jī)分為7組：空白組、模型組、化療藥對(duì)照組（7mg/kg）、復(fù)方萬(wàn)年青膠囊1倍臨床劑量對(duì)照組（0.5g/kg）、復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量對(duì)照組（1.5g/kg）、復(fù)方萬(wàn)年青膠囊1倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組（0.5g/kg+7mg/kg）、復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組（1.5g/kg+7mg/kg），每組24只，雌雄各半。除空白組以外，其余組將制備的腹水瘤液，注射在小鼠右前肢腋窩，緩慢注射0.2mL瘤液后迅速拔針，之后用棉簽在針口按壓數(shù)秒，防止瘤液流出，進(jìn)行建模[5-6]。24h后，空白組、模型組小鼠于造模第二天腹腔注射0.9%氯化鈉溶液10mL/kg，1次/14d；順鉑注射液對(duì)照組于造模第二天腹腔注射順鉑注射液，1次/14d；復(fù)方萬(wàn)年青膠囊對(duì)照組灌胃給藥，每天1次；聯(lián)用組于造模第二天腹腔注射順鉑注射液，同時(shí)分別灌胃給藥，每天1次。連續(xù)灌胃給藥14d。實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食和飲水，觀察小鼠一般情況。

2.3 對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率、臟器指數(shù)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

每組取12只小鼠末次給藥后1h，稱體重，各鼠均按0.1mL/10g劑量由尾靜脈注入印度墨汁（以生理鹽水按1∶5稀釋），注射后分別在1min（t1）、10min（t2）從小鼠眼眶靜脈叢取血20μL溶于2.0mL 0.1%Na2CO3溶液中搖勻，放置20min后680nm處測(cè)其吸光度值（A），以0.1%Na2CO3溶液做空白對(duì)照，將小鼠處死后取肝臟，剝離瘤塊并稱取瘤質(zhì)量，按公式（1）計(jì)算抑瘤率，同時(shí)剝離脾臟稱質(zhì)量，按公式（2）計(jì)算脾臟指數(shù)。

根據(jù)公式計(jì)算廓清指數(shù)K值和吞噬指數(shù)α值[7、8]。

式中：t1、t2分別為取血時(shí)間；A1、A2分別為在時(shí)間t1、t2時(shí)所取血樣對(duì)應(yīng)的吸光度。

2.4 合并用藥療效的計(jì)算[9]

根據(jù)Webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計(jì)算(fa)1,2=1-[1-(fa)1][1-(fa)2]，(fa)1和(fa)2分別為兩藥的抑瘤率，(fa)1,2為計(jì)算的理論相加效應(yīng)。若聯(lián)合用藥的效應(yīng)大于理論相加效應(yīng)，則表示有協(xié)同作用。

2.5 對(duì)荷瘤小鼠血清酶學(xué)指標(biāo)的影響

采集每組剩余小鼠外周血，放置于-80℃保存，用于隨后的檢測(cè)。通過(guò)酶聯(lián)免疫試劑盒檢測(cè)免疫球蛋白G（IgG）、免疫球蛋白M（IgM）、白介素2（IL-2）、腫瘤壞死因子α（TNF-α），相關(guān)操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

2.6 對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞活性的影響[10-12]

2.6.1 脾細(xì)胞懸液的制備

每組剩余小鼠脫頸椎處死，剪開(kāi)肌層無(wú)菌取脾，置于預(yù)冷PBS的培養(yǎng)皿中，剝離剩余脂肪和胰腺。剪碎脾臟通過(guò)70μm細(xì)胞過(guò)濾器以收集單細(xì)胞懸浮液。將細(xì)胞懸浮液1500rpm，5min離心后用Gey's溶液裂解紅細(xì)胞，靜止3min后再次離心。反復(fù)裂解離心直至無(wú)紅色沉淀，用PBS重懸即收獲脾細(xì)胞懸液。

2.6.2 NK細(xì)胞活性測(cè)定

對(duì)K562細(xì)胞以及脾細(xì)胞進(jìn)行活細(xì)胞計(jì)數(shù)。將100μL K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞（2.5×106個(gè)/mL）加入到96孔培養(yǎng)板的每個(gè)孔中。將100μL脾淋巴細(xì)胞用作效應(yīng)細(xì)胞（1×107個(gè)/mL）添加至每個(gè)測(cè)試孔。同時(shí)設(shè)最大釋放孔及空白對(duì)照孔，每組有2復(fù)孔。即：

測(cè) 試 孔：K562 100μL+脾細(xì)胞 100μL

空白對(duì)照孔：K562 100μL+RPMI1640 100μL

最大釋放孔：K562 100μL+LDH釋放劑（稀釋后）100μL

細(xì)胞于37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)4h后使用LDH測(cè)定試劑盒測(cè)量LDH水平?；诠接?jì)算NK細(xì)胞的細(xì)胞毒率：

式中ODtest表示試驗(yàn)孔的吸光度，ODmin表示空白對(duì)照孔的吸光度，ODmax表示最大釋放孔的吸光度。

2.7 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 19.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率、臟器指數(shù)和腹腔巨噬細(xì)胞吞噬作用的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組荷瘤小鼠脾臟系數(shù)非常顯著升高（P＜0.01），胸腺系數(shù)非常顯著降低（P＜0.01），吞噬指數(shù)α顯著降低（P＜0.05）；與模型組比較，復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組荷瘤小鼠脾臟系數(shù)極顯著降低（P＜0.001），吞噬指數(shù)α非常顯著升高（P＜0.01），復(fù)方萬(wàn)年青膠囊1倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組荷瘤小鼠脾臟系數(shù)極顯著降低（P＜0.001），吞噬指數(shù)α升高，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。詳見(jiàn)表1。

表1 對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率、臟器指數(shù)和吞噬指數(shù)的影響（X±S，n=12）

3.2 對(duì)荷瘤小鼠抑瘤率和合并用藥療效的影響

結(jié)果表明，各給藥組抑瘤率分別為43.2%、7.1%、12.7%、64.7%、71.7%，根據(jù)Webb氏分?jǐn)?shù)乘積法計(jì)算，復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組理論相加效應(yīng)為50.4%，實(shí)際為71.7%，說(shuō)明與順鉑注射液聯(lián)用有協(xié)同作用。復(fù)方萬(wàn)年青膠囊1倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組理論相加效應(yīng)為47.2%，實(shí)際為64.7%，說(shuō)明與順鉑注射液聯(lián)用有協(xié)同作用。詳見(jiàn)表2。

表2 對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠抑瘤率的影響（X±S，n=12）

3.3 對(duì)荷瘤小鼠血清酶學(xué)指標(biāo)的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM、IgG活性均有不同程度升高（P＜0.05，P＜0.001）；與模型組比較，復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組荷瘤小鼠血清中TNFα、IL-2、IgM、IgG活性不同程度降低（P＜0.01，P＜0.001），復(fù)方萬(wàn)年青膠囊1倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM、IgG活性不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001）。詳見(jiàn)表3。

表3 對(duì)肝癌H22荷瘤小鼠血清中TNF-α、IL-2、IgM和IgG活力的影響（X±S，n=12）

3.4 對(duì)荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷率的影響

結(jié)果表明，與空白組比較，模型組荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷率明顯降低，但由于標(biāo)準(zhǔn)差較大，沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；與模型組比較，各給藥組荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷率不同程度升高（P＜0.05，P＜0.001），其中復(fù)方萬(wàn)年青膠囊3倍臨床劑量+順鉑注射液聯(lián)用組荷瘤小鼠NK細(xì)胞殺傷率達(dá)到102%，高于其他給藥組。詳見(jiàn)表4。

表4 對(duì)小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響（X±S，n=12）

4 討論

復(fù)方萬(wàn)年青膠囊以清熱解毒藥虎眼萬(wàn)年青、半枝蓮、虎杖、白花蛇舌草為君，以補(bǔ)氣升陽(yáng)藥人參、丹參、黃芪為臣，以郁金、全蝎、蜈蚣為佐使進(jìn)行配伍，具有解毒鎮(zhèn)痛、散結(jié)消腫的功效，清熱解毒的同時(shí)，補(bǔ)氣升陽(yáng)、活血止痛，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能。

肝細(xì)胞癌是高度惡性腫瘤之一，目前手術(shù)切除仍是其治療的主要手段，而術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移乃是治療失敗的主要原因。而且大多數(shù)化療藥物缺乏腫瘤細(xì)胞特異性，在殺傷腫瘤細(xì)胞的同時(shí)，對(duì)包括免疫細(xì)胞在內(nèi)的分裂增殖旺盛的正常細(xì)胞具有殺傷作用，影響巨噬細(xì)胞等免疫細(xì)胞正常的增殖活化，從而引起機(jī)體免疫功能的抑制，嚴(yán)重影響到惡性腫瘤的治療[13-14]。因此，調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)化療藥物療效，降低其不良反應(yīng)，尤其是預(yù)防治療患者化療后出現(xiàn)的免疫功能抑制，是有效改善食管癌患者生存條件的關(guān)鍵。有臨床研究表明，惡性肝癌者IgG、IgM含量與正常水平有明顯升高，Ig上升與腫瘤細(xì)胞學(xué)特點(diǎn)存在關(guān)聯(lián)性，細(xì)胞學(xué)存在分泌不正?；蛘哐宄煞植徽Ｇ闆r，或者可以提高體液Ig含量，據(jù)此，研究者表示癌細(xì)胞不正常分泌或者其誘導(dǎo)的其它體液不正常狀態(tài)是引發(fā)體液免疫反應(yīng)的關(guān)鍵，最終通過(guò)測(cè)定可直接發(fā)現(xiàn)部分Ig上升[15]。

本研究采用BALB/c小鼠的腋下移植瘤模型，研究復(fù)方萬(wàn)年青膠囊的免疫調(diào)節(jié)作用及對(duì)順鉑注射液的增效減毒作用[16-17]。研究結(jié)果表明，小鼠接種H22瘤株以后，會(huì)出現(xiàn)精神狀態(tài)萎靡、被毛光澤度低、日?；顒?dòng)次數(shù)減少，脾臟系數(shù)增加，腹腔巨噬細(xì)胞吞噬功能下降等免疫抑制狀態(tài)。復(fù)方萬(wàn)年青膠囊和順鉑注射液聯(lián)合治療后，小鼠精神狀態(tài)逐漸改善，被毛光澤度增高，日常活動(dòng)次數(shù)增加，聯(lián)用藥組優(yōu)于中藥對(duì)照組。脾臟系數(shù)明顯降低，腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬能力明顯提高。同時(shí)，復(fù)方萬(wàn)年青膠囊聯(lián)合順鉑注射液組荷瘤小鼠血清中IgG、IgM含量明顯降低并趨于正常水平，且炎性因子TNF-α活性明顯降低，其腫瘤生長(zhǎng)速率明顯變緩，小鼠一般情況明顯改善。二者聯(lián)合應(yīng)用與理論效應(yīng)值比較，說(shuō)明復(fù)方萬(wàn)年青膠囊對(duì)順鉑注射液的癌癥治療具有增效減毒作用，能夠顯著地提高癌癥治療效率并調(diào)節(jié)免疫功能。該研究為復(fù)方萬(wàn)年青膠囊臨床應(yīng)用提供了有力的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支持。