毛蕊花糖苷對睪丸間質細胞氧化損傷的保護作用

陳 雪，安 英，沈 楠，徐 博，趙麗晶

（吉林醫(yī)藥學院基礎醫(yī)學院·吉林吉林·132013）

肉蓯蓉為列當科植物蓯蓉或管花肉蓯蓉的干燥帶鱗葉的肉質莖，為我國傳統(tǒng)名貴中藥材，藥用價值極高，在歷代增力配方中使用頻率居首位，在滋補、抗衰老延年類配方中居第位，僅次于人參。肉蓯蓉作為兩千年來使用頻率最高的補腎壯陽中藥，被美譽為“沙漠人參”，具有補腎壯陽，益精血、潤腸通便、延緩衰老等療效。研究發(fā)現，肉蓯蓉可促進幼齡小鼠及大鼠睪丸生長發(fā)育，增加精囊前列腺的質量，證明其具有促激素樣作用。對幼年去勢大鼠，無論是生品還是炮制品，均可明顯增加副性器官的質量，同樣顯示了雄激素樣作用。近年來，國內外對肉蓯蓉的化學成分進行了許多分析研究，已分離出多種類型的物質，如苯乙醇苷類、環(huán)烯醚帖類、揮發(fā)性成分、木質素類、多糖、生物堿等［1-3］。

毛蕊花糖苷(Acteoside，ACT)為苯乙醇苷類(phenylethanoid glycoside，PhG)化合物，是植物界中該類的代表性化合物，藥理學研究證明，ACT具有廣泛的藥理作用，包括抗氧化、保護神經、改善學習記憶、抗炎、抗腫瘤、保護肝臟以及免疫調節(jié)等作用［4-8］。國內外有關毛蕊花糖苷在改善生精功能障礙、促進精子成熟領域的研究報道較少，尚缺乏系統(tǒng)深入的研究，本研究主要通過體外實驗揭示毛蕊花糖苷對氧化損傷睪丸間質細胞保護作用。

1 材料和方法

1.1 TM3細胞株

TM3細胞株，購自中國科學院細胞庫。

1.2 試劑

毛蕊花糖苷由維克奇生物科技有限公司提供；胎牛血清(Fetalbovineserum)、DMEM-F12、胰蛋白酶(tyrsin)，Gibeo公司；青霉素鈉(penicillin)、硫酸鏈霉素(streptomycin)，西安制藥公司；3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)、DMSO，美國Sigma公司；Trypsin、EDTA，Amresco公司。

1.3 儀器設備

CO2恒溫細胞培養(yǎng)箱(SHELL/JB型)，美國Sartorius公司；全自動高壓消毒鍋（SM-51），日本Yamato公司；倒置相差顯微鏡，日本OlymPuS公司；超凈工作室(FLB-lB型)，蘇州蘇靜集團；-80℃低溫冰箱，美國Revco公司；高速低溫離心機(型號JZ-CM)，美國BECKMAN公司；Milli-Q、Synthesis超純水系統(tǒng)，美國Millipore。

1.4 實驗方法

1.4.1 睪丸間質細胞的培養(yǎng)與傳代

從-80℃取出凍存的TM3細胞株，在37℃水浴融化后，迅速移至超凈工作臺上復蘇，將其用移液槍加入含10%血清的F12培養(yǎng)液中，以1∶2的比例傳代，在37℃、5%CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。次日觀察細胞狀態(tài)，用于后續(xù)試驗。

1.4.2 細胞計數

1.4.2.1 細胞的傳代

經步驟1.4.1培養(yǎng)的TM3細胞貼壁后，進行傳代。在超凈臺中，打開酒精燈，在酒精燈周圍打開瓶蓋，瓶蓋過火滅菌，倒掉原有培養(yǎng)基，PBS清洗3次，用移液槍吸取消化液加入瓶中，平鋪瓶內，使消化液完全覆蓋住瓶壁上的TM3細胞。一邊晃動培養(yǎng)瓶一邊觀察，當瓶內細胞大塊滑落，立即用移液槍取2mL含10%血清的F12培養(yǎng)液加入瓶內，終止消化。移液槍從瓶內一側吹打細胞，形成單個細胞懸液。將細胞懸液移至無菌的離心管中，封口膜封好瓶口。將離心管對稱放入離心機中1000rpm速度離心4min。離心后，棄上清，移液器吸出新的培養(yǎng)基加入管中與沉淀混合，再將懸液平均分到2個培養(yǎng)瓶中。

1.4.2.2 TM3細胞的分組

將細胞分為正常組、過氧化氫模型組、毛蕊花糖苷低劑量組（25μg/ml）、中劑量組（50μg/ml）、髙劑量組（100μg/ml）共5瓶細胞，在模型組、毛蕊花糖苷低、中、高劑量組加入400μmol/L過氧化氫作用4h后，分別加入相應濃度為25、50、100μg/ml的藥物作用24h，備用。

1.4.2.3 MTT法檢測細胞活性

TM3細胞長至約80%左右，消化細胞，進行細胞計數，調整細胞數量。在無菌的96孔板中接種細胞（106個細胞/孔），培養(yǎng)過夜。按1.4.2.2步驟進行細胞的分組，每組設5個復孔，加入5mg/ml四甲基偶氮唑藍(MTT)溶液20μl/孔培養(yǎng)4h，吸棄培養(yǎng)液，每孔加人200μl DMSO室溫振蕩10min，在酶標儀上以490nm波長測定各孔吸光度(A值)，記錄結果，實驗重復3次，結果取均值。

2 結果

2.1 細胞形態(tài)學觀察

顯微鏡下可見：細胞培養(yǎng)24h后，貼壁的TM3細胞大部分都伸展出偽足，呈三角形，細胞生長密集且數量多，如圖1所示（正常組）；經400μmol/L過氧化氫損傷后的模型組細胞生長受到抑制，細胞體積變小并且數量明顯減少，折光弱；隨著毛蕊花糖苷給藥劑量的增加，細胞數量逐漸增加，尤其是毛蕊花糖苷高劑量組細胞基本恢復正常。

圖1 細胞形態(tài)學觀察

2.2 毛蕊花糖苷對TM3細胞生長的影響

以25、50、100μg/ml的毛蕊花糖苷F12培養(yǎng)液處理氧化損傷后TM3細胞24小時后，各組細胞存活率詳見圖2。

圖2 毛蕊花糖苷對TM3細胞生長的影響

隨著毛蕊花糖苷濃度的增加，吸光度(A值)略有增高，其中毛蕊花糖苷中劑量組和毛蕊花糖苷高劑量組與模型組比較，差異顯著（P＜0.05）。

3 結論

通過體外培養(yǎng)睪丸間質細胞（TM3），在培養(yǎng)環(huán)境中加入H2O2制備TM3氧化應激損傷模型，并檢測毛蕊花糖苷對TM3氧化應激損傷后作用。結果顯示，毛蕊花糖苷對培養(yǎng)的TM3細胞無毒性作用，25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷對細胞的生長無明顯抑制作用，而且還具有一定的促進增殖趨勢。25、50、100μg/ml毛蕊花糖苷對氧化損傷具有明顯的保護作用，且呈濃度依賴。

4 結語

隨著時代的發(fā)展，人們比起以前更加關注自身的健康狀況，不孕不育這一重要問題也日益被人所關注，發(fā)病率趨勢逐年增加，其發(fā)病原因、影響因素已成為全球性生殖醫(yī)學的研究熱點。

男性不育癥的病因很多，目前已經明確許多因素與男性不育癥明顯相關，如性腺功能低下、精索靜脈曲張、感染、免疫性不育、輸精管梗阻所致不育、隱睪癥等[9-10]，應用針對病因的藥物或者手術治療可以取得比較滿意的治療效果，男科醫(yī)生在這些方面的治療已經積累了不少經驗。但是仍有相當一部分男性不育癥的病因不明，目前現有的技術手段不能找出病因的不育癥，即特發(fā)性男性不育癥，約占男性不育癥的31.6%[11-12]，對這類不育癥的治療目前只是經驗性的，而且療效不確定，治療機制也多不明了，從而給西醫(yī)治療帶來了難度。

睪丸間質細胞是睪丸中一種能特異性產生男性雄激素的細胞，這對男性的生育能力和精子發(fā)生的維護至關重要，本研究結果為男性不育的藥物治療提供了新思路,為研究毛蕊花糖苷的生精作用研究奠定了基礎。