不同栽培土壤種植靈芝中主要成分的比較分析

汪戎錦，張鴻旭，武家杰，于曉風(fēng)，睢大筼，門麗慧

（1.吉林大學(xué)藥學(xué)院，長春 130021；2.吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，長春 130021）

靈芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]為擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，多孔菌科(Polyporaceae)，靈芝亞科(Ganodermatoideae)，靈芝屬(Ganoderma)真菌。具有扶正固本、滋陰強壯、補中益氣、延年益壽等功效，被列為上品，在民間享有“仙草”之美譽。我國靈芝作為藥材使用已有幾千年的歷史，《中華人民共和國藥典》[1]中收入作為藥材靈芝來源的為赤芝[Ganodermalucidum(Leys.ex Fr.)Karst]或紫芝[Ganodermajaponicum(Fr.)Lloyd]的干燥子實體。靈芝子實體所含活性成分較為復(fù)雜，目前已分離得到百余種化學(xué)成分，包括多糖類、三萜及甾醇類、氨基酸類、多肽類、蛋白類、核苷類、生物堿類、揮發(fā)油類以及多種微量元素等[2-6]。國內(nèi)外研究表明，靈芝主要活性成分具有多種藥理作用，包括抗腫瘤、抗氧化、降血糖、免疫調(diào)節(jié)、抗菌、抗病毒、抗衰老以及保肝等功效[7-10]。靈芝產(chǎn)業(yè)是白色現(xiàn)代農(nóng)業(yè)，符合低碳經(jīng)濟的發(fā)展方向，是一個不與人爭糧、不與糧爭地、不與地爭水、不與環(huán)境排污染、不與其它產(chǎn)業(yè)爭資源、低能耗可持續(xù)發(fā)展的行業(yè)，已成為農(nóng)業(yè)增產(chǎn)、農(nóng)民爭收的優(yōu)勢產(chǎn)業(yè)。隨著人參、鹿茸等名貴藥材成為吉林省的一大特色產(chǎn)業(yè)，長白山靈芝產(chǎn)業(yè)也蓄勢待發(fā)。

目前，靈芝種植均采用種植一年更換新地，或在原有土地加一層山沙土，嚴重破壞了自然環(huán)境。為解決靈芝在栽培中的土地資源、染菌、不能連種等問題，本課題組受吉林省重點科技研發(fā)項目資助，在吉林省蛟河市黃松甸鎮(zhèn)南頂子建立一棟168平方米的標(biāo)準靈芝栽培大棚，內(nèi)含4個28平方米試驗單元，間隔4米平方。分別以山核桃殼、玉米芯和玉米秸稈（均為20目粗粉）作為土壤，另設(shè)一個傳統(tǒng)山沙土。旨在解決土地資源問題，也減少山核桃殼、玉米棒及玉米秸稈的廢棄污染，從而變廢為寶。經(jīng)過三年研究，培育出與山沙土一樣的靈芝子實體。鑒于靈芝發(fā)揮藥理作用的主要藥效成分為多糖和三萜類成分[11]，因此本論文采用2020版《中國藥典》中的檢測方法，對4種不同土壤所栽培的靈芝中所含多糖、三萜及甾醇類化學(xué)成分進行提取并檢測其含量，結(jié)合幾種靈芝樣本的含水量及浸出物含量分析及經(jīng)濟性狀比較，探討不同栽培土壤條件是否對靈芝的質(zhì)量產(chǎn)生影響，從而為靈芝的質(zhì)量檢測及栽培條件選擇提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥材、試劑及儀器

藥材來源于4批不同土壤栽培的靈芝子實體樣本，分別為山核桃殼（1號）、山沙土（2號）、玉米芯（3號）及玉米秸稈（4號），由吉林昆閬醫(yī)藥有限公司提供；齊墩果酸標(biāo)準品（上海融禾醫(yī)藥科技有限公司）；乙醇（吉林省運昌化工有限公司）；甲醇為色譜純（美國Fisher公司）；葡萄糖、冰醋酸、濃硫酸、高氯酸均為分析純（北京化工廠）；香草醛（惠世生化試劑有限公司）；蒽酮（天津科密歐化學(xué)試劑有限公司）。

DFT-200手提式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；SHZ-Ⅲ型循環(huán)水真空泵（上海亞榮生化儀器廠）；Milli-QGradient A10超純水系統(tǒng)（美國Millipore Inc.）；真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海申生科技有限公司）；酶標(biāo)儀（SpectraMax）；TG16-WS臺式高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司）；Q-New Classic MF十萬分之一電子天平（METTLER TOLED）；KQ-500DE超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；真空干燥箱DZF-6020型（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；KDM型調(diào)溫電熱套（山東鄄城華魯電熱儀器有限公司）；SHHW21420型三用電熱恒溫水箱（余姚市東方電工儀器廠）。

1.2 實驗方法

本研究采用2020版《中國藥典》中的檢測方法對靈芝主要成分及各項指標(biāo)進行檢測。

1.2.1 靈芝三萜及甾醇含量測定

1.2.1.1 對照品溶液的制備

取齊墩果酸對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含0.2 mg的溶液，即得。

1.2.1.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醇50 ml，超聲處理（功率140 W，頻率42 kHz）45分鐘，濾過，濾液置100 ml量瓶中，用適量乙醇，分次洗滌濾器和濾渣，洗液并人同一量瓶中，加乙醇至刻度，搖勻，即得。

1.2.1.3 標(biāo)準曲線的制備

精密量取對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 ml，分別置15 ml具塞試管中，揮干，放冷，精密加入新配制的香草醛冰醋酸溶液（精密稱取香草醛0.5 g，加冰醋酸使溶解成10 ml，即得）0.2 ml，高氯酸0.8 ml，搖勻，在70℃水浴中加熱15分鐘，立即置冰浴中冷卻5分鐘，取出，精密加入乙酸乙酯4 ml，搖勻，以相應(yīng)試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在546 nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)、濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準曲線。

1.2.1.4 檢測方法

精密量取供試品溶液0.2 ml，置15 ml具塞試管中，照標(biāo)準曲線制備項下的方法，自“揮干”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準曲線上讀出供試品溶液中齊墩果酸的含量，計算，即得。每種栽培土壤取兩批靈芝樣本進行檢測，每批樣本平行檢測3次。

1.2.2 靈芝多糖含量測定

1.2.2.1 對照品溶液的制備

取無水葡萄糖對照品適量，精密稱定，加水制成每1ml含0.12mg的溶液，即得。

1.2.2.2 供試品溶液的制備

取本品粉末約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，加水60ml靜置1小時，加熱回流4小時，趁熱濾過，用少量熱水洗滌濾器和濾渣，將濾渣及濾紙置燒瓶中，加水60ml，加熱回流3小時，趁熱濾過，合并濾液，置水浴上蒸干，殘渣用水5ml溶解，邊攪拌邊緩慢滴加乙醇75ml，搖勻，在4℃放置12小時，離心，棄去上清液，沉淀物用熱水溶解并轉(zhuǎn)移至50ml量瓶中，放冷，加水至刻度，搖勻，取溶液適量，離心，精密量取上清液3ml，置25ml量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得。

1.2.2.3 標(biāo)準曲線的制備

精 密 量 取 對 照 品 溶 液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，分別置10ml具塞試管中，各加水至2.0ml，迅速精密加入硫酸蒽酮溶液（精密稱取蒽酮0.1g，加硫酸100ml使溶解，搖勻）6ml，立即搖勻，放置15分鐘后，立即置冰浴中冷卻15分鐘，取出，以相應(yīng)的試劑為空白，照紫外-可見分光光度法（通則0401），在625nm波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準曲線。

1.2.2.4 測定方法

精密量取供試品溶液2ml，置10ml具塞試管中，照標(biāo)準曲線制備項下的方法，自“迅速精密加入硫酸蔥酮溶液6ml”起，同法操作，測定吸光度，從標(biāo)準曲線上讀出供試品溶液中無水葡萄糖的含量，計算，即得。每種栽培土壤取兩批靈芝樣本進行檢測，每批樣本平行檢測3次。

1.2.3 靈芝浸出物及水分含量檢測

1.2.3.1 水分含量檢測

取供試品2~5 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱量瓶中，厚度不超過5 mm，疏松供試品不超過10 mm，精密稱定，開啟瓶蓋在100~105℃干燥5小時，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，放冷30分鐘，精密稱定，再在上述溫度干燥1小時，放冷，稱重，至連續(xù)兩次稱重的差異不超過5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計算供試品中含水量（%）。每種栽培土壤取3批靈芝樣本進行檢測。

1.2.3.2 浸出物含量檢測

取供試品約2~4 g，精密稱定，置100~250 ml的錐形瓶中，精密加水50~100 ml，密塞，稱定重量，靜置1小時后，連接回流冷凝管，加熱至沸騰，并保持微沸1小時。放冷后，取下錐形瓶，密塞，再稱定重量，用水補足減失的重量，搖勻，用干燥濾器濾過，精密量取濾液25 ml，置已干燥至恒重的蒸發(fā)皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小時，置干燥器中冷卻30分鐘，迅速精密稱定重量。每種栽培土壤取3批靈芝樣本進行檢測。

2 結(jié)果

2.1 不同土壤栽培靈芝子實體的形態(tài)比較

取4種土壤栽培的靈芝子實體各3株，進行初步經(jīng)濟性狀比較，包括干重、芝面長、芝面寬、柄長、柄粗。結(jié)果表明，山核桃殼、山沙土、玉米芯及玉米秸稈栽培的靈芝子實體干重（g）分別為333.33±38.19、286.67±51.32、177.67±38.68及213.33±51.32。與山核桃殼比較，玉米秸稈及玉米芯干重均明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），山沙土干重有降低趨勢（P＞0.05），與山沙土比較，玉米芯干重明顯降低（P＜0.05），玉米秸稈干重有降低趨勢（P＞0.05），4種土壤栽培的靈芝子實體芝面長、芝面寬、柄長及柄粗均無明顯差異（P＞0.05），詳見圖1。

圖1 不同栽培土壤種植靈芝性狀a,e：山核桃殼栽培（1號）；b,f：山沙土栽培（2號）；c,g：玉米芯栽培（3號）；d,h：玉米秸稈栽培（4號）Figure 1 Characters of Ganoderma lucidum in different cultivated soils.a,e:Carya cathayensis shell cultivation(No.1);b,f:Mountain sand soil cultivation(No.2);c,g:Corn cob cultivation(No.3);d,h:Corn straw cultivation(No.4)

2.2 不同土壤栽培靈芝中靈芝多糖和三萜及甾醇類成分含量測定

如表1所示，4種土壤栽培的靈芝多糖含量在0.914~1.035%之間，符合藥典規(guī)定。其中，采用3號和4號土壤栽培的靈芝中多糖含量相對較高，而采用2號土壤栽培的靈芝中此成分含量較低。4種土壤栽培的靈芝三萜及甾醇含量在1.188~1.558%之間，均符合符合藥典規(guī)定。其中，采用3號和4號土壤栽培的靈芝中三萜及甾醇含量相對較高，而采用1號土壤栽培的靈芝中此成分含量較低。靈芝多糖和三萜及甾醇類成分的含量在4種土壤之間均無明顯差別（P＞0.05）。

表1 四種土壤栽培靈芝中靈芝多糖和三萜及甾醇類成分含量測定Table 1 Contents of polysaccharide,triterpenoids and sterols in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

2.3 不同土壤栽培靈芝中浸出物比較

如圖2所示，4種土壤栽培的靈芝浸出物在4.650~4.934%之間，均符合藥典規(guī)定。其中，4號土壤栽培的靈芝樣本中能夠檢測到含量較高的浸出物。

圖2 四種土壤栽培靈芝中浸出物檢查結(jié)果Figure 2 Results of extracts in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

2.4 不同土壤栽培靈芝中水分含量比較

如圖3所示，4種土壤栽培的靈芝水分含量在11.10~12.46%之間，均符合藥典規(guī)定。其中，4號土壤栽培的靈芝樣本中水分含量較少，而3號樣本含水量相對較高。

圖3 四種土壤栽培靈芝中水分檢查結(jié)果Figure 3 Results of water examination in Ganoderma lucidum cultivated in four soils

3 討論

為了探討不同栽培土壤對靈芝藥材質(zhì)量的影響，本研究采用藥典方法對4種栽培土壤種植的靈芝進行初步經(jīng)濟性狀比較，并對其三萜及甾醇類成分、多糖類成分以及水分和浸出物含量進行測定與比較。結(jié)果表明，4種栽培土壤所種植的靈芝上述各項指標(biāo)均符合藥典要求，提示山核桃殼、玉米芯及玉米秸稈土壤均可代替山沙土培育靈芝。在經(jīng)濟性狀比較中，玉米秸稈及玉米芯土壤栽培的靈芝子實體干重明顯低于山核桃殼，但主要成分多糖、三萜及甾醇含量確相對較高，可能與其質(zhì)輕疏松，保水量低有關(guān)。

山核桃樹是一種野生喬木，山核桃仁約占核桃重量10%，90%是殼。山核桃仁含有豐富的不飽和脂肪酸和豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)，被開發(fā)出多種高檔保健品。由此產(chǎn)生了大量的核桃殼廢棄物，污染了環(huán)境。山核桃殼是一種由多孔的木質(zhì)素和纖維素組成的物質(zhì)，具有較大的比孔容積和比表面積，其保水量達山核桃重量的70%，自然條件下保濕時間長達72小時。用山核桃殼粉代替土壤，不僅能很好供應(yīng)水分，本身又是有機質(zhì)，起到肥效作用，優(yōu)于土壤。玉米是吉林主要的農(nóng)作物，其產(chǎn)量位居全國第一。秋收后玉米脫粒，玉米棒（玉米芯）堆積如山，除少量供工業(yè)用，大量當(dāng)柴燒。玉米棒外層多由木質(zhì)素，纖維素組成，棒心多為纖維素，尚含有多種B族維生素和礦物質(zhì)。粉碎后質(zhì)輕，吸水較慢，保水量適中，用其代替土壤培育靈芝，不僅可提供水分，還可以提供碳水化合物、維生素、礦物質(zhì)等靈芝所需的營養(yǎng)素。每年我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)生的玉米秸稈約有3.5億噸。如何變廢為寶，高效率低成本地利用玉米秸稈，成為當(dāng)前在生物質(zhì)資源利用領(lǐng)域的研發(fā)熱點。玉米秸稈含有30%以上的碳水化合物、2%~4%的蛋白質(zhì)和0.5%~1%的脂肪。以山核桃殼粉、玉米芯粉及玉米秸稈粉等有機質(zhì)取代土壤，不僅可解決土地資源問題，也減少山核桃殼、玉米芯及玉米秸稈的廢棄污染，變廢為寶。綜合考量可優(yōu)先選擇玉米秸稈栽培土壤進行靈芝種植，有待活性研究進一步證實。