酚酸類化感物質(zhì)種類、提取、分離和檢測(cè)研究進(jìn)展

程佳 王發(fā)啟 李小雙 杜亞東 謝越

摘要：酚酸類物質(zhì)是導(dǎo)致作物產(chǎn)生連作障礙問題的重要原因之一。對(duì)連作土壤中酚酸類物質(zhì)進(jìn)行有效提取和快速檢測(cè)，是酚酸類物質(zhì)研究的重要前提，也是農(nóng)業(yè)行業(yè)和產(chǎn)業(yè)的技術(shù)需求。對(duì)酚酸類化感物質(zhì)的種類結(jié)構(gòu)、提取工藝、分離純化和檢測(cè)手段4個(gè)方面進(jìn)行梳理總結(jié)，并對(duì)酚酸類物質(zhì)的研究進(jìn)行展望，以期為土壤中酚酸類物質(zhì)的科學(xué)研究提供理論和技術(shù)參考，為緩解因酚酸類化感物質(zhì)產(chǎn)生的土壤連作障礙問題提供新的思路。

關(guān)鍵詞：化感作用;酚酸類物質(zhì);提取;分離純化;定性定量分析

中圖分類號(hào)： S184;S344.4? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）06-0008-08

收稿日期：2021-05-14

基金項(xiàng)目：安徽省自然科學(xué)基金（編號(hào)：2008085MC81）;安徽省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃面上項(xiàng)目（編號(hào)：201904a06020042）;企業(yè)橫向委托項(xiàng)目（編號(hào)：2020QX001）。

作者簡(jiǎn)介：程 佳（1997—），女，安徽歙縣人，碩士研究生，主要從事農(nóng)業(yè)資源高效利用研究。E-mail：chengj8067@163.com。

通信作者：謝 越，博士，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事環(huán)境污染控制研究。E-mail：yorke@126.com。

化感作用是由Molish在1937年首次提出[1]，后來國(guó)際化感作用學(xué)會(huì)將其定義為植物在生長(zhǎng)發(fā)育過程中，將自身次生代謝的化學(xué)物質(zhì)釋放到周圍環(huán)境，改變周圍微生態(tài)環(huán)境，影響自身或周圍其他植物的生長(zhǎng)發(fā)育，導(dǎo)致植物間相互排斥或促進(jìn)的現(xiàn)象[2-3]。眾多研究表明，酚酸類物質(zhì)為植物微生態(tài)環(huán)境中被鑒定最多、活性最強(qiáng)的一類化感物質(zhì)[4-5]。國(guó)內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn)酚酸類化感物質(zhì)釋放到環(huán)境中有4種途徑，即植物被雨水淋洗、植物殘?bào)w分解（如凋落物）、根系滲出和揮發(fā)[6-7]。研究發(fā)現(xiàn)，這類化感物質(zhì)是導(dǎo)致植物連作障礙的一個(gè)重要原因，在連作土壤中檢測(cè)出的酚酸類物質(zhì)含量明顯增加。例如：在連作綏陽小米辣根際土壤中發(fā)現(xiàn)酚酸類物質(zhì)數(shù)量從最初的1種增長(zhǎng)到10種，其質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加44.8%[8]。連作3年的甜瓜土壤與未連作的土壤比較，土壤中7種酚酸總含量顯著增加，連作3年后干土中7種酚酸的總量較未連作土壤增加了96.80%[9]。

目前，酚酸類物質(zhì)能夠通過多種檢測(cè)手段進(jìn)行定性定量研究[10-13]，但是這些方法均較為繁瑣且檢測(cè)條件有限，檢測(cè)靈敏度較低，不適合連作田間土壤中酚酸物質(zhì)的快速分析，因此，探究土壤樣品中酚酸的前處理和酚酸類物質(zhì)高靈敏、簡(jiǎn)便、快捷的檢測(cè)方法已成為農(nóng)業(yè)行業(yè)和產(chǎn)業(yè)普遍亟待解決的問題。本文綜合國(guó)內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)，從酚酸類物質(zhì)的種類結(jié)構(gòu)、提取分離純化、檢測(cè)方法及定性定量檢測(cè)方面進(jìn)行了歸納總結(jié)，以期為酚酸類物質(zhì)引起的連作障礙問題的緩解提供技術(shù)參考。

1 酚酸類物質(zhì)種類及結(jié)構(gòu)特征

酚酸類化合物是一類結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、含有芳香酚環(huán)、酚羥基和羧基的有機(jī)酸。具有化感作用的酚酸類物質(zhì)主要是苯甲酸為母核的C6-C1型酚酸和以苯丙烯酸為母核的C6-C3型酚酸。

1.1 以苯甲酸為母核的C6-C1型酚酸

具有化感作用的酚酸類化合物中，大部分屬于母核為C6-C1型的苯甲酸類酚酸。目前研究顯示，具有化感作用的物質(zhì)主要有苯甲酸、對(duì)羥基苯甲酸、沒食子酸、水楊酸、丁香酸、香草酸、原兒茶酸、龍膽酸等[10，14-15]，其分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)式詳見表1、圖1。

在藥用植物連作障礙的研究中發(fā)現(xiàn)，沒食子酸、水楊酸、丁香酸、香草酸、原兒茶酸等是導(dǎo)致三七、地黃、西洋參、人參、太子參、丹參、半夏等這些常用大宗道地藥材產(chǎn)生化感作用的主要酚酸物質(zhì)[16]。梁薇薇等通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)，闡明了苯甲酸、丁香酸及香草酸對(duì)紅松種子萌發(fā)存在抑制作用，且對(duì)種子萌發(fā)的抑制作用強(qiáng)于對(duì)胚軸及胚根長(zhǎng)的影響[14]。謝越等在研究5種酚酸對(duì)滁菊扦插幼苗的生長(zhǎng)影響時(shí)，發(fā)現(xiàn)對(duì)羥基苯甲酸、水楊酸等苯甲酸類外源酚酸對(duì)根長(zhǎng)度、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、葉綠素a含量、葉綠素b含量均有顯著抑制作用，其中對(duì)羥基苯甲酸的抑制作用最強(qiáng)[17]。魯曉峰等研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)羥基苯甲酸與鄰苯二甲酸2種酚酸能顯著影響植株根系H+-ATPase、K+/Na+-ATPase及Ca2+/Mg2+-ATPase活性，阻礙細(xì)胞內(nèi)外各離子的運(yùn)轉(zhuǎn)能力[18]。

1.2 以苯丙烯酸為母核的C6-C3型酚酸

以苯丙烯酸為母核的C6-C3型酚酸是具有化感作用的酚酸類化合物另一類主要構(gòu)型，主要以肉桂酸及其衍生物的形式存在。目前研究表明，具有化感作用的的苯丙烯酸類化合物包括肉桂酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸、咖啡酸、芥子酸、2-甲氧基肉桂酸、3-甲氧基肉桂酸、綠原酸等[10，15，19]，其分子式和化學(xué)結(jié)構(gòu)式詳見表2、圖2。

研究發(fā)現(xiàn)，低濃度的香豆素會(huì)對(duì)種子的萌發(fā)與生長(zhǎng)產(chǎn)生很強(qiáng)的抑制作用，綠原酸對(duì)植物細(xì)胞壁的建立與根的生成則具有脅迫作用 [20]。Abenavoli等研究表明，反式肉桂酸、對(duì)香豆酸、阿魏酸不同程度地抑制了玉米幼苗對(duì)硝酸鹽的吸收，影響了植物體內(nèi)氮素營(yíng)養(yǎng)情況，其抑制程度與酚酸濃度和其芳香環(huán)中取代基的結(jié)構(gòu)有關(guān)[21]。

2 酚酸類物質(zhì)提取

酚酸類物質(zhì)酚羥基是其主要活性基團(tuán)，但該基團(tuán)容易受到光照、溫度等外界因素的影響，大多易被氧化成羰基而失去活性[22]。因此，在酚酸的提取中須要注意光照、試驗(yàn)溫度、試驗(yàn)時(shí)間等試驗(yàn)條件的影響。

2.1 溶劑提取法

酚酸類物質(zhì)在植物中通常以氫鍵和疏水鍵形式與其他大分子物質(zhì)形成穩(wěn)定的分子復(fù)合物，所以對(duì)提取溶劑要求是對(duì)酚酸具有很好的溶解性，但不應(yīng)與酚酸發(fā)生化學(xué)反應(yīng);有氫鍵斷裂的作用，但浸出雜質(zhì)少[23-24]。

常規(guī)溶劑提取法操作簡(jiǎn)單、成本低廉，不需要昂貴精密的儀器就能達(dá)到提取效果，被實(shí)驗(yàn)室作為最為常用的提取方法。楊澤良等通過應(yīng)用不同提取溶劑提取細(xì)葉旱芹地上部化感物質(zhì)，用其提取液處理蔬菜種子，發(fā)現(xiàn)乙醇提取液對(duì)蔬菜種子的萌發(fā)抑制效果最強(qiáng)，其次是甲醇提取物[25]。

除了常規(guī)的溶劑提取法，研究者還發(fā)現(xiàn)了新型綠色溶劑，在保證化合物高提取率的前提下，增加了環(huán)保、可持續(xù)性等功能。Alaón等提出了以氯化膽堿衍生物為基礎(chǔ)的深共晶溶劑作為橄欖葉中酚類化合物的新型綠色替代溶劑，其提取率與傳統(tǒng)溶劑相似[26]。深共晶溶劑具有熱穩(wěn)定性好、毒性低、可持續(xù)性、減少有機(jī)溶劑的使用和制備廉價(jià)等優(yōu)點(diǎn)，被稱為“21世紀(jì)的新型綠色溶劑”[27-28]。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲輔助提取法提取樣品中的有效成分是利用超聲波具有的機(jī)械效應(yīng)、空化效應(yīng)和熱效應(yīng)作用，增大孔徑從而加速化合物的擴(kuò)散[29]，超聲波輔助提取條件有溫度、溶劑、提取時(shí)間及料液比例等[30]。

超聲波輔助提取法作為一種快速提取技術(shù)，能在短時(shí)間內(nèi)提取高酚類、黃酮類和糖苷類化合物，減少溶劑消耗[31]。薛宏坤等提取萬壽菊花多酚成分，采用二階速率模型評(píng)價(jià)熱回流提取法、超聲波輔助提取法和微波輔助提取法3種提取方法，結(jié)果得出超聲波輔助提取的總酚含量高于其他2種提取方法[32]。有學(xué)者研究超聲輔助提取枸杞中綠原酸、咖啡酸、丁香酸、對(duì)香豆酸和阿魏酸等5種酚酸，采用4因素3水平Box-Behnken設(shè)計(jì)探討出最優(yōu)提取方法，即在33%的乙醇溶液 ∶樣品體積比為 40 ∶1 的比例下，采用100 W超聲功率，提取30 min，有利于酚類化合物的提取、分離和藥物分析，為枸杞作為保健食品和藥物的進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ)[33]。

2.3 微波輔助提取法

微波輔助提取是采用非接觸式熱源，能量傳遞更快，可選擇性加熱減少熱梯度，快速達(dá)到反應(yīng)過程，使提取時(shí)間縮短、減少溶劑消耗[34]。

微波輔助提取法與超聲波輔助提取法和溶劑提取法相比，該方法可以避免酚酸類物質(zhì)的降解，同時(shí)在較短的時(shí)間內(nèi)獲得了所有組分的最高回收率，消耗的溶劑和能量更少[35]。Chiremba等用微波輔助提取不同硬度高粱和玉米麩皮和面粉中的結(jié)合酚酸，避免了咖啡酸隨pH值的增加發(fā)生的不可逆的化學(xué)轉(zhuǎn)化，同時(shí)也減少了羥基肉桂酸和羥基苯甲酸衍生物因高溫產(chǎn)生的降解[36]。Pellati等在提取蜂膠原料中的酚酸類物質(zhì)時(shí)，其回收率為95.3%～98.1%，并且沒有降解產(chǎn)物生成[37]。Molina等比較不同方法提取酚酸和黃酮類化合物，結(jié)果表明，微波輔助提取的含量分別比索氏提取法和超聲波提取法高34.54%、31.95%。利用微波提取的方法比其他方法提取時(shí)間短得多，是一種不需要有機(jī)溶劑就能獲得酚酸類化合物的有效方法[38]。

3 酚酸類物質(zhì)分離純化

3.1 大孔樹脂分離純化

大孔吸附樹脂的吸附性能與其表面性能、孔結(jié)構(gòu)以及吸附劑的溶解度有關(guān)[39]。鐘方麗等研究 D-101、LX-28、LX-1、LSA-21、LX-36、AB-8這6種不同類型大孔樹脂對(duì)覆盆子總酚酸的靜態(tài)吸附及解吸附效率，結(jié)果得出，AB-8型大孔樹脂效果最好，吸附率達(dá)到89.56%，解吸率為90.69%，通過正交試驗(yàn)調(diào)整最佳純化條件，其提取干浸膏中總酚酸含量提高為原來的3.5倍[40];這與劉興賦等得出的結(jié)果[41]類似，AB-8分離蜘蛛香中總酚酸的效果最好，吸附率為92.93%，解吸率為84.24%。謝越等利用D-101大孔樹脂柱富集純化連作5年滁菊土壤樣品中的阿魏酸，得到的100份校正樣品經(jīng)過近紅外光譜法測(cè)定，其校正相關(guān)系數(shù)達(dá)到 0.991 4[11]。

3.2 萃取分離純化

土壤中酚酸含量低，須要進(jìn)行富集純化，與其他物質(zhì)分離，常用于富集酚酸的技術(shù)有液-液萃取[30]、固相萃取[42]、膜萃取[43]等。

有研究表明，在液-液萃取過程中進(jìn)行強(qiáng)烈的振動(dòng)，將極性相似的化合物轉(zhuǎn)移到有機(jī)相中進(jìn)行分離，正己烷和三氯甲烷餾分可以提取相對(duì)非極性的化合物，乙酸乙酯和丙酮可以提取相對(duì)極性的化合物，其余高極性的化合物則作為殘留物留在水相中[30]。固相萃取的效果由固相萃取柱的組成以及吸附、解吸原理決定，張曉華等用HLB、PSD和MAX這3種不同的固相萃取柱對(duì)模擬蜂蜜中酚酸類物質(zhì)檢測(cè)進(jìn)行前處理，結(jié)果表明，經(jīng)HLB柱處理的10種酚酸類物質(zhì)的平均回收率為70.9%～102.2%;經(jīng)PSD柱處理的平均回收率為55.7%～85.5%;經(jīng)MAX柱處理的平均回收率為1.8%～102.1%，表明不同的萃取柱組成導(dǎo)致的萃取效果不同[42]。

含極性或者極性較強(qiáng)的酸性有機(jī)物在高效氣相色譜或高效氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測(cè)前須要進(jìn)行衍生化才能實(shí)現(xiàn)，張莉等檢測(cè)水中酚酸采用聚苯乙烯-二乙烯苯膜萃取，萃取完成后，將膜片移入衍生瓶中，采用超聲技術(shù)對(duì)酸性有機(jī)物進(jìn)行洗脫和衍生，可以有效節(jié)省溶劑的使用和預(yù)處理時(shí)間[44]。Asadi等采用凝膠電膜法利用電輔助有效提取蘋果、橘子和獼猴桃汁中酚酸類化合物，以最佳參數(shù)對(duì)提取方法進(jìn)行了驗(yàn)證，得出較高的線性及回收率[43]，具有操作簡(jiǎn)便、成本低、環(huán)境友好等優(yōu)點(diǎn)。

4 酚酸類物質(zhì)的檢測(cè)方法

4.1 福林酚（Folin-Ciocalteu）比色法

福林酚比色法多酚含量測(cè)定的原理為在堿性條件下，酚類化合物的酚羥基與Folin-Ciocalteu試劑中鎢鉬酸的W6+反應(yīng)，將其還原成W5+，生成藍(lán)色絡(luò)合物[45]，在一定波長(zhǎng)范圍內(nèi)可測(cè)定其吸收度。

福林酚比色法適合較為簡(jiǎn)單的總酚測(cè)定，可以準(zhǔn)確穩(wěn)定測(cè)出總酚含量，林倩等采用響應(yīng)面法優(yōu)化福林酚法測(cè)定冬棗中總酚含量，優(yōu)化后Folin-Ciocalteu試劑濃度為0.8 mol/L、20%碳酸鈉溶液取0.6 mL、反應(yīng)溫度為40 ℃，測(cè)得的總酚含量與預(yù)估值吻合度達(dá)98.4%[46]。但是福林酚比色法會(huì)受到其他氧化物質(zhì)的干擾，對(duì)酚類物質(zhì)不具有特異性，在較復(fù)雜的植物樣品的測(cè)定前需要注意其他易氧化物質(zhì)的干擾[47]。Padda等測(cè)定甘薯總酚時(shí)比較Folin-Denis、Folin-Ciocalteu 2種試劑測(cè)出的總酚含量，發(fā)現(xiàn)Folin-Ciocalteu試劑受還原糖及抗壞血酸等其他易氧化物質(zhì)的干擾更大，導(dǎo)致Folin-Ciocalteu試劑測(cè)出的總酚含量偏高[48]。這與Showkat等在研究菊芋酚酸時(shí)的結(jié)論一致，福林酚比色法測(cè)出的總酚含量偏高[49]。

4.2 高效液相色譜（HPLC）法

利用高效液相色譜研究土壤中的化感自毒物質(zhì)酚酸類物質(zhì)文獻(xiàn)報(bào)道很多。大部分文獻(xiàn)報(bào)道中色譜柱采用十八烷基鍵合硅膠色譜柱，流動(dòng)相體系均為有機(jī)相——水，調(diào)節(jié)pH值使流動(dòng)相體系成弱酸性，減少了苯酚、酚羥基和羧基的電離[50]，有利于酚酸物質(zhì)的分離。謝越等選用Symmetry C18色譜柱同時(shí)測(cè)定滁菊樣品中的9種酚酸，色譜條件為流動(dòng)相A為乙腈，流動(dòng)相B為以冰醋酸調(diào)節(jié)至pH值為2.8的0.02 mol/L磷酸鹽緩沖溶液，柱溫設(shè)為 25 ℃，在280 nm檢測(cè)波長(zhǎng)下運(yùn)行30 min，結(jié)果表明，其檢出限介于0.01～0.08 mg/L，達(dá)到痕量檢測(cè)要求[10]。González-González等建立了高選擇性、高靈敏度、高精確度的高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)器同時(shí)測(cè)定龍葵水提物及其水解產(chǎn)物中6種酚酸的含量，該方法在濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系（r>0.999），回收率為88.07%～109.17%，基質(zhì)效應(yīng)均小于5%，可作為藥用植物提取液的檢測(cè)[51]。Nian等則利用HPLC快速、高準(zhǔn)確度等特點(diǎn)在 30 min 內(nèi)檢測(cè)出茶葉中20種化合物，其中包括酚酸類化合物[52]。

現(xiàn)在對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)酚酸物質(zhì)的方法越來越成熟，越來越多研究者們結(jié)合其他方法或條件，使檢測(cè)結(jié)果更加準(zhǔn)確。比如，超高壓液相色譜法與小粒徑色譜柱結(jié)合，可以達(dá)到高效、快速的分離目的，中藥虎杖中的34種化合物可以在10 min內(nèi)分析完成[53]。還有結(jié)合數(shù)學(xué)方法，利用數(shù)字色譜結(jié)合普通色譜或質(zhì)譜的方法將重疊難區(qū)分的譜圖分辨為純物質(zhì)的譜圖，從而實(shí)現(xiàn)化合物的快速檢測(cè)，比如利用高效液相色譜法結(jié)合交替三線性分解算法（ATLD），可實(shí)現(xiàn)蜂蜜中10種酚酸類物質(zhì)快速定性和定量分析[42]。

4.3 毛細(xì)管電泳法

毛細(xì)管電泳法具有分辨率高、模式多、分析時(shí)間短、操作成本低、污染物去除容易等優(yōu)點(diǎn)，可以高效地進(jìn)行提取物的分離與測(cè)定[54]。Martí 等通過響應(yīng)面法優(yōu)化在20 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)了番茄中9種多酚的分離，經(jīng)過方法驗(yàn)證，該方法回收率為77%～106%，日內(nèi)、日間的峰面積相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別<3.1%、<3.7%，保留時(shí)間的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別<0.2%、<1.4%，檢出限濃度為0.8～3.8 mg/kg，滿足了毛細(xì)管電泳法分析番茄中多酚類物質(zhì)的要求[12]。

電動(dòng)增壓毛細(xì)管電泳是瞬間等速電泳和場(chǎng)放大進(jìn)樣結(jié)合的在線富集方法，可同時(shí)分析植物中常見的10種酚酸，該方法驗(yàn)證結(jié)果表明，回歸曲線的相關(guān)系數(shù)大于0.997，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和相對(duì)誤差分別小于9.63%、4.70%，檢出限（LOD）為0.01～2.5 ng/mL，與傳統(tǒng)的毛細(xì)管區(qū)帶電泳方法相比，該方法對(duì)酚酸的靈敏度可提高2.5萬倍[55]。毛細(xì)管電泳-化學(xué)發(fā)光法可以快速分離并定量檢測(cè)出中藥中阿魏酸、綠原酸、水楊酸這3種酚酸類物質(zhì)，在優(yōu)化條件下，可在7 min內(nèi)達(dá)到化合物的分離并快速檢測(cè)[56]。毛細(xì)管電泳法是一種比HPLC法樣品消耗量和溶劑消耗量低的綠色方法，符合環(huán)境友好的環(huán)保要求。

4.4 紅外吸收光譜法

近年來，紅外吸收光譜法作為一種快速檢測(cè)分析的方法，而且可以對(duì)化合物基團(tuán)進(jìn)行準(zhǔn)確鑒別，逐漸進(jìn)入研究者的視野。紅外吸收光譜法測(cè)出各物質(zhì)的數(shù)據(jù)較復(fù)雜，可能出現(xiàn)非線性關(guān)系且含量差異大，因此需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)復(fù)雜的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，偏最小二乘法就是常用的與紅外吸收光譜結(jié)合的常用方法[57]。偏最小二乘傅里葉變換紅外光譜法測(cè)定藥用植物提取物中酚酸含量，測(cè)得的酚酸含量與Folin-Ciocalteu比色法測(cè)得的酚酸含量在相同范圍內(nèi)，通過不同波段比較，其中紅外法測(cè)得的結(jié)果最為準(zhǔn)確[58]。謝越等快速檢測(cè)連作土壤中阿魏酸含量，測(cè)出數(shù)據(jù)采用偏最小二乘法分析，結(jié)果表明，模型校正集和驗(yàn)證集與高效液相色譜法測(cè)定的參考值之間均呈現(xiàn)良好的相關(guān)關(guān)系，校正相關(guān)系數(shù)與交叉驗(yàn)證相關(guān)系數(shù)均大于0.99[11]。Vivar-Quintana等利用近紅外光譜法測(cè)定蜂膠中的酚酸物質(zhì)，得出結(jié)果[59]也與高效液相色譜法一致。

也有學(xué)者認(rèn)為近紅外光譜法需要通過數(shù)學(xué)模型進(jìn)行二次擬合，才能得到被測(cè)化合物的含量，其準(zhǔn)確度不足以取代傳統(tǒng)的高效液相色譜法，且建立近紅外光譜的識(shí)別和定量模型需要大量的時(shí)間、成本和精力，但模型建立后，近紅外光譜具有非破壞性和測(cè)量時(shí)間短（約5 min）的巨大優(yōu)勢(shì)[60]。近紅外光譜作為一種快速、無損的方法，在不使用試劑的情況下，制備樣品較少或不需要制備樣品，是未來酚酸類檢測(cè)的可行性方法。

4.5 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法（UPLC-MS/MS）

超高效液相色譜在高效液相色譜的基礎(chǔ)上對(duì)分離效果和靈敏度進(jìn)一步提高[61-62]，但是對(duì)分離化學(xué)分子質(zhì)量、結(jié)構(gòu)相近的化合物以及含量較低的游離酚酸分離效果和靈敏度還存在不足[63]。Fang等采用UPLC-MS對(duì)全國(guó)各地的金蓮花湯劑中化學(xué)成分進(jìn)行鑒定，共鑒定出89種化合物，除個(gè)別化合物外，其他化合物的精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性和回收率均符合測(cè)定要求，定量限低至0.05～4.67 ng/mL[64]，可用于中藥制劑痕量成分的相關(guān)研究。

優(yōu)化色譜柱、流動(dòng)相組成和流速等色譜條件，使相鄰峰得到最佳分離，避免了峰拖尾，可以得到更好的檢測(cè)結(jié)果。Wabaidur等優(yōu)化UPLC-MS建立了一種簡(jiǎn)便、靈敏、準(zhǔn)確的UPLC-MS方法，用于蜂蜜中9種酚酸類、9種黃酮類、4種酚類物質(zhì)的同時(shí)分離、鑒定和定量[13]。對(duì)于復(fù)雜的樣品，UPLC與MS聯(lián)用可以同時(shí)對(duì)多種酚酸類物質(zhì)在較短的時(shí)間里進(jìn)行定性與定量分析，具有高選擇性與高靈敏度，可節(jié)約試驗(yàn)時(shí)間以及試驗(yàn)?zāi)茉?，UPLC-MS越來越被科研工作者青睞。

5 展望

酚酸類物質(zhì)已經(jīng)被證明是單一體系連作的重要化感物質(zhì)。然而，其產(chǎn)生機(jī)制尚不完全明確，與植物生長(zhǎng)的相互作用還需要深入研究，進(jìn)行這些科學(xué)研究工作的前提是酚酸類物質(zhì)從土壤環(huán)境中有效分離和快速分析，這對(duì)于快速發(fā)展的現(xiàn)代農(nóng)業(yè)行業(yè)和產(chǎn)業(yè)來說，是急迫的技術(shù)需求。

另外，有研究發(fā)現(xiàn)酚酸物質(zhì)在田間土壤中的濃度，明顯低于實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)抑制種子發(fā)芽和幼苗生長(zhǎng)的濃度，田間條件下酚酸自毒的作用是如何發(fā)揮的？各種酚酸結(jié)構(gòu)中的不同官能團(tuán)，是否在化感自毒過程中扮演不同作用？酚酸類物質(zhì)性質(zhì)不穩(wěn)定，其酚羥基在光照、溫度等自然環(huán)境下會(huì)造成氧化失活，發(fā)生降解等反應(yīng)，因此，溫室效應(yīng)下氣溫升高與二氧化碳濃度升高是否會(huì)對(duì)酚酸類物質(zhì)產(chǎn)生和降解產(chǎn)生影響？在農(nóng)田自然條件下可以采取哪些措施，促進(jìn)酚酸類物質(zhì)降解？這些科學(xué)問題關(guān)系到田間土壤體系中酚酸物質(zhì)自毒機(jī)理，以及能否通過改變環(huán)境因素，改變酚酸形態(tài)，降低酚酸濃度，甚至在田間土壤環(huán)境中，原位降解酚酸，減少酚酸類物質(zhì)的自毒效應(yīng)，從而緩解作物的連作障礙問題。上述這些問題關(guān)系到農(nóng)業(yè)的綠色高質(zhì)量發(fā)展，都值得進(jìn)一步深入研究。

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