11份蜜環(huán)菌種質(zhì)rDNA-ITS序列分析

莫盛龍，夏宗元，李繼，李園園，劉紅昌，黃明進(jìn)

（1.貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院，貴州 貴陽 550025；2.貴州大學(xué)石斛研究院，貴州 貴陽 550025；3.福泉市華源生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，貴州 福泉 550506；4.貴州省藥用植物繁育與種植重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550025）

蜜環(huán)菌（Armillaria mellea）隸屬于擔(dān)子菌亞門（Basiaiomycotina）傘菌目（Agaricales）泡頭菌科（Physalacriaceae）蜜環(huán)菌屬[Armillaria（Fr.）Staude]，是一類經(jīng)濟(jì)價(jià)值高并且為天麻生長(zhǎng)所必須的共生真菌，為本身無法進(jìn)行光合作用的天麻的生長(zhǎng)繁殖提供營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)天麻品質(zhì)及產(chǎn)量的影響較大[1-4]，同時(shí)它又是重要的藥食兼用真菌，其產(chǎn)品制劑是治療眩暈、頭痛、神經(jīng)衰弱的有效藥物，目前已廣泛應(yīng)用于臨床治療[5]。蜜環(huán)菌在世界各大洲均有分布，廣泛分布于北美洲、歐洲和亞洲等許多國家的熱帶及溫帶森林地區(qū)，前人通過互交不育性實(shí)驗(yàn)鑒定蜜環(huán)菌生物種多達(dá)40種，蜜環(huán)菌種類繁多，在我國主要有5個(gè)族17個(gè)種，其中高盧蜜環(huán)菌族有9個(gè)種，分別是Armillaria ingular、Armillaria gallica、Armillaria calvescens、Armillaria cepistipes、Armillaria sinapina、NABSX、Armillaria nabsnona、Armillaria luteopileata、Armillaria jozaensis；奧氏蜜環(huán)菌族有Armillaria ostayae、Armillaria gemina、Armillaria borealis 3個(gè)種；蜜環(huán)菌族有Armillaria mellea、CBSG 2個(gè)種；假蜜環(huán)菌族有Armillaria tabescens、Armillaria monadelpha 2個(gè)種；棘皮蜜環(huán)菌族只有Armillaria ectypa 1個(gè)種，主要分布在黑龍江、吉林、河南、山西、青海、云南、內(nèi)蒙古、西藏及臺(tái)灣等地區(qū)[6]。長(zhǎng)期以來，由于鑒定手段的局限，用于鑒定真菌種的都是形態(tài)學(xué)特征，隨著研究的不斷深入，蜜環(huán)菌的鑒定方法從傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定發(fā)展到如今的分子生物學(xué)鑒定。當(dāng)前用于蜜環(huán)菌分子鑒定的技術(shù)手段主要包括擴(kuò)增核糖體基因（Ribosomal DNA,rDNA）、限制性內(nèi)切酶的酶切、限制性片段多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism,RFLP）和隨機(jī)擴(kuò)增微衛(wèi)星（random amplified microsatellite,RAMS）等[7]。其中核糖體基因被認(rèn)為是最能反映物種間遺傳關(guān)系的指標(biāo)之一[8]，真核生物核糖體基因是高度重復(fù)的串聯(lián)序列單位，18S、5.8S和26S rDNA聯(lián)結(jié)在一起，作為一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位。18S～26S和rDNA之間的內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer,ITS）被5.8S分為ITS1和ITS2兩部分，由于該區(qū)具有選擇壓力較小、DNA堿基替換速率較快、拷貝數(shù)較大、適中的長(zhǎng)度以及快速的同步進(jìn)化等特點(diǎn)被廣泛應(yīng)用于真菌類群的系統(tǒng)演化和發(fā)育研究[9-11]。不同蜜環(huán)菌菌株在ITS區(qū)存在豐富的變異，變異以點(diǎn)突變?yōu)橹?，且變異位點(diǎn)相互獨(dú)立，通過擴(kuò)增rDNA-ITS保守序列，可以對(duì)廣泛的種類進(jìn)行鑒定[12]。本文采用真菌通用引物ITS4/ITS5對(duì)11份蜜環(huán)菌種質(zhì)的rDNAITS區(qū)段序列進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，利用MEGA-X軟件對(duì)11份蜜環(huán)菌進(jìn)行分類，并基于ITS序列進(jìn)行核酸序列數(shù)據(jù)庫GenBank同源性檢索比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，使用DNAMAN軟件對(duì)其特征序列進(jìn)行比對(duì)分析，以期為蜜環(huán)菌種質(zhì)資源的分類、鑒別及種質(zhì)資源評(píng)價(jià)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

供試菌株于2020年6月收集，其中M-01～M-07均來自貴州大學(xué)農(nóng)學(xué)院、M-08購買于都勻市勻洞鎮(zhèn)馬場(chǎng)村峻康生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司、M-09購買于黔東南興昌菌業(yè)科技有限公司、M-10購買于宜昌市裕禾菌業(yè)有限公司、M-11在福泉市仙橋鄉(xiāng)月塘村野生蜜環(huán)菌子實(shí)體分離純化，共11份蜜環(huán)菌種質(zhì)。

1.2 主要試劑及設(shè)備

真菌基因組DNA提取試劑盒（Solarbio，D2300）；金牌Mix（Cat.TSE101，Lot.0BH21301）；瓊脂糖（Bio topped,Cat No.A6190,Lot No:190715）；DNA Ladder（BIOMIGA，Cat.#:9156，Lot.#:Specified on product label）；Marker（BIOMIGA，Cat.No:M2000，Lot.No:20200907）；1 TBE速溶顆粒（擎科生物，Cat.TSG002，Lot.1GO20701）；馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（上海博微生物科技有限公司，190710）；立式高壓蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，LDZF-50L）；超凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司，DL-CJ-1NDⅡ）；電泳儀（BIORAD，Model No.PowerpacTMBasic）；離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific，Sorvall Legend 17R）；PCR儀（成都錦世昌祥科技有限公司，C1000 TouchTMThermal Cycler）；凝膠成像儀（BIORAD，Model No:Universal HoodⅡ，Serial No:721BR03885）等。

1.3 培養(yǎng)基配制

分離純化培養(yǎng)基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（potato dextrose agar,PDA），按照說明書使用；活化培養(yǎng)基：每升培養(yǎng)基中加入馬鈴薯200.0 g、葡萄糖10.0 g、蔗糖10.0 g、蛋白胨2.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂0.5 g及瓊脂粉12.0 g，pH=6.0，馬鈴薯去皮，切成丁，加入適量的清水煮沸，持續(xù)沸騰期間用鐵勺搗碎，單層紗布過濾，分3次進(jìn)行，濾液加水至1 L后，加入其他原料，攪拌煮沸。

1.4 蜜環(huán)菌分離純化與活化

蜜環(huán)菌的分離：將野外采集到的蜜環(huán)菌子實(shí)體在超凈工作臺(tái)中用75%的酒精棉球擦試菌蓋表面，迅速用無菌水沖洗菌蓋，再用無菌棉球擦干菌蓋上的水，用鑷子撕去菌蓋表皮，在菌柄與菌蓋交接處切取0.3～0.5 cm2的組織塊，接種于PDA培養(yǎng)基上，置于25℃的恒溫培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)30 d，與搜集的蜜環(huán)菌原種存放于4～8℃環(huán)境中保存?zhèn)溆?。蜜環(huán)菌的活化：將分離純化和收集的原種菌絲或菌塊接種于活化培養(yǎng)基中，置于25℃的培養(yǎng)室內(nèi)避光培養(yǎng)，根據(jù)褐化情況置于4～8℃環(huán)境中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 樣品基因組DNA提取及測(cè)定

取活化后的新生蜜環(huán)菌菌絲，用液氮速凍，磨成粉狀，按照真菌基因組DNA提取試劑盒操作。取2.5L提取的基因組DNA用0.9%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分析以便了解提取情況。

1.6 序列擴(kuò)增

1.6.1 引物序列 本實(shí)驗(yàn)引物為核糖體基因序列的通用引物ITS4/ITS5[13]：ITS4堿基序列為5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'，ITS5堿基序列為5'-GGA AGT AAA AGT CGT AAC AAG G-3'，由北京擎科生物科技有限公司重慶分公司合成。

1.6.4 擴(kuò)增序列分析 通過DNAMAN6.0軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析，根據(jù)初步分類結(jié)果，登錄NCBI網(wǎng)（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/）提交序列，BLAST搜索分析，條件為高相似度序列，下載與11份蜜環(huán)菌種質(zhì)相似大的15份蜜環(huán)菌基因序列和1份茶樹耐鋁內(nèi)生真菌序列作為外群（表1），利用MEGA-X軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。

表1 用于系統(tǒng)發(fā)育分析的類群的GenBank登錄號(hào)Table 1 GenBank accession numbers of the taxa used for phylogenetic analysis

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

采用1%瓊脂糖凝膠電泳在凝膠成像系統(tǒng)中拍照，對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，11份蜜環(huán)菌種質(zhì)在ITS序列上的擴(kuò)增成功率均為100%，每份蜜環(huán)菌種質(zhì)在750～1 000 bp處只有1個(gè)條帶且條帶清晰（圖1）。

圖1 11份蜜環(huán)菌種質(zhì)rDNA-ITS序列PCR擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)Fig.1 Detection of PCR amplification products of the 11strains with rDNA-ITS sequences

2.2 11份蜜環(huán)菌種質(zhì)聚類

11份蜜環(huán)菌種質(zhì)樣品測(cè)序峰圖較好，序列拼接后，長(zhǎng)度為851～895 bp，利用DNAMAN軟件對(duì)所有序列進(jìn)行多重對(duì)位排列，手動(dòng)將對(duì)位排列結(jié)果中5'和3'端的非對(duì)位排列區(qū)去除，序列長(zhǎng)度為848～866 bp，通過構(gòu)建同源樹對(duì)11份蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行聚類，結(jié)果表明，11份蜜環(huán)菌種質(zhì)劃分為兩個(gè)大類和4個(gè)亞類，第Ⅰ類包括M-01～M-05和M-08～M-10，相似度為99%，第Ⅰ-Ⅰ類包括M-01、M-02、M-04、M-05和M-08～M-10，相似度為100%，第Ⅰ-Ⅱ類為M-03；第Ⅱ類包括M-06、M-07和M-11，相似度為99%，第Ⅱ-Ⅰ類包括M-06和M-07，相似度為100%，第Ⅱ-Ⅱ類為M-11（圖2）。

圖2 基于rDNA-ITS序列的11份蜜環(huán)菌種聚類分析Fig.2 Clustering analysis ofstrains base d on rDNA-ITS sequence

2.3 特征序列分析

分別對(duì)這兩個(gè)大類的蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)分析，同上（2.2）去除非對(duì)位排列區(qū)后，第Ⅰ類序列長(zhǎng)度均為847 bp，第Ⅱ類序列長(zhǎng)度均為873 bp，參考模式菌株蜜環(huán)菌（登錄號(hào)：KT822289）對(duì)各區(qū)段進(jìn)行大致劃分，即18S區(qū)為1～34 bp，ITS1區(qū)為35～273 bp，5.8S區(qū)為274～431 bp，ITS2區(qū)為432～815 bp，28S為816～864 bp，其中第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)M-03在ITS1區(qū)段發(fā)生5個(gè)堿基置換，分別在120 bp、121 bp、148 bp、164 bp和266 bp處由C→T，在ITS2區(qū)段發(fā)生3個(gè)堿基置換，分別在597 bp和693 bp處由A→G，在664 bp處由G→A，共有序列長(zhǎng)度為840 bp，其中堿基A、C、G和T所占比例分別為33.0%、23.1%、21.1%和22.9%，C+G含量為44.2%（表2）；第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)M-11在ITS1區(qū)段發(fā)生4個(gè)堿基置換，分別在100 bp處由T→C，在125 bp和147 bp處由G→A，在373 bp處由A→G，在ITS2區(qū)段僅有1個(gè)堿基發(fā)生置換，在706 bp處由C→T，共有序列長(zhǎng)度為869 bp，其中堿基A、C、G和T所占比例分別為33.7%、23.6%、19.0%和23.7%，C+G含量為42.6%（表3）。上述表明，11份蜜環(huán)菌種質(zhì)在18S、5.8S和28S區(qū)較保守，變異的信息位點(diǎn)主要在ITS1和ITS2。

表2 第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)特征位點(diǎn)Table 2 Characteristic loci of the classⅠstrains

表2 第Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)特征位點(diǎn)Table 2 Characteristic loci of the classⅠstrains

編號(hào) Serial number特征位點(diǎn) Characteristic loci ITS1 ITS2 120 121 148 164 266 597 693 664 M-01 C C C C C A A G M-02 C C C C C A A G M-03 T T T T T G G A M-04 C C C C C A A G M-05 C C C C C A A G M-08 C C C C C A A G M-09 C C C C C A A G M-10 C C C C C A A G

表3 第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)特征位點(diǎn)Table 3 Characteristic loci of the classⅡ

表3 第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)特征位點(diǎn)Table 3 Characteristic loci of the classⅡ

編號(hào) Serial number特征位點(diǎn) Characteristic loci ITS1 ITS2 100 125 147 373 706 M-06 T G G A C M-07 T G G G C M-11 C A A G T

對(duì)兩個(gè)大類的共有序列進(jìn)行兩對(duì)序列對(duì)比分析，同上（2.2）去除非對(duì)位排列區(qū)后，兩對(duì)共有序列相似度為88.71%，堿基變異位點(diǎn)豐富，且除堿基的置換外，還存在堿基的缺失，在18S區(qū)有1個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生置換，在ITS1區(qū)有23個(gè)位點(diǎn)堿基缺失，22個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生置換，在5.8S區(qū)有8個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生置換，在ITS2區(qū)有21個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生置換，12個(gè)位點(diǎn)堿基缺失，在28S區(qū)有4個(gè)位點(diǎn)堿基發(fā)生置換，1個(gè)位點(diǎn)堿基缺失（表4）。表明采用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增的序列可以對(duì)這兩類蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行區(qū)分。

表4 第Ⅰ類和第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)共有序列特征位點(diǎn)Table 4 Characteristic loci of the classⅠandⅡcommon sequencesstrains

表4 第Ⅰ類和第Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)共有序列特征位點(diǎn)Table 4 Characteristic loci of the classⅠandⅡcommon sequencesstrains

編號(hào) Serial number特征位點(diǎn) Characteristic loci 18S ITS1 12 64 98 100 102 104 105 108ⅠG G G A T--AⅡA C A C G A C T編號(hào) Serial number ITS1 109 120 121 122 123 124 125 126ⅠA G------ⅡT C C G C G C T編號(hào) Serial number ITS1 127 128 133 144 148 162 164 165Ⅰ--G G G C C AⅡA A T C C A --編號(hào) Serial number ITS1 196 199 235 238 240 241 242 243ⅠA T T G----Ⅱ-C G A A G T T編號(hào) Serial number ITS1 244 255 246 249 254 257 258 262Ⅰ---C G T G CⅡC C T T C A A T編號(hào) Serial number ITS1 263 271 275 282 365 374 379 380Ⅰ-G--A A C AⅡT A C C G C A T編號(hào) Serial number 5.8S 381 391 392 399 400 405 409 414ⅠT G C C C G G GⅡA A T T G A C C

續(xù)表

2.4 種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算

利用MEGA-X軟件，對(duì)11份蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行多序列比對(duì)，同上（2.2）去除非對(duì)位排列區(qū)后，對(duì)其種內(nèi)種間遺傳距離進(jìn)行計(jì)算，遺傳距離的大小既反映了物種間的相似度大小，也反映了它們之間的遺傳多樣性，遺傳距離越小，表明它們之間相似度越大，遺傳多樣性就越小。反之，遺傳距離越大，它們之間相似度越小，遺傳性多樣就越大。結(jié)果表明：11份蜜環(huán)菌種質(zhì)種內(nèi)遺傳距離均為0.000，第Ⅱ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)的種間遺傳距離最大為0.035，第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類、第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅰ類及第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅰ類蜜環(huán)菌種質(zhì)的種間遺傳距離次之，分別為0.033、0.032和0.031，第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅰ-Ⅱ類和第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)的種間遺傳距離最小，分別為0.004和0.002（表5）。因此，第Ⅱ-Ⅰ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)的相似性小，具有較豐富的遺傳多樣性，而第Ⅰ-Ⅰ類與第Ⅰ-Ⅱ類和第Ⅰ-Ⅱ類與第Ⅱ-Ⅱ類蜜環(huán)菌種質(zhì)，相似性大，遺傳多樣性程度較低。

表5 11份蜜環(huán)菌種質(zhì)種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算Table 5 Genetic distance between species and within species of 11strains

表5 11份蜜環(huán)菌種質(zhì)種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算Table 5 Genetic distance between species and within species of 11strains

編號(hào)Serial number M-01 M-02 M-03 M-04 M-05 M-06 M-07 M-08 M-09 M-10 M-01 M-02 0.000 M-03 0.004 0.004 M-04 0.000 0.000 0.004 M-05 0.000 0.000 0.004 0.000 M-06 0.031 0.031 0.032 0.031 0.031 M-07 0.031 0.031 0.032 0.031 0.031 0.000 M-08 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 M-09 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 0.000 M-10 0.000 0.000 0.004 0.000 0.000 0.031 0.031 0.000 0.000 M-11 0.033 0.033 0.035 0.033 0.033 0.002 0.002 0.033 0.033 0.033

2.5 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫中BLAST對(duì)比，搜索并下載與11份蜜環(huán)菌種質(zhì)相似較高的15份同源的蜜環(huán)菌序列及1份茶樹耐鋁內(nèi)生真菌序列（表1），利用MEGA-X軟件進(jìn)行多序列比對(duì)，采用鄰接法（NJ）構(gòu)建ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3）。結(jié)果顯示11份蜜環(huán)菌種質(zhì)與下載的同源蜜環(huán)菌序列均沒有歸在一類。因此，11份蜜環(huán)菌可能是一個(gè)較為龐大的復(fù)合群，采用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增的核糖體基因可以對(duì)此類蜜環(huán)菌進(jìn)行分類但不適合作為鑒定的持家基因。

圖3 基于rDNA-ITS序列的系統(tǒng)發(fā)育樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree based on the rDNA-ITS sequence

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增11份蜜環(huán)菌種質(zhì)的核糖體基因，通過構(gòu)建同源樹聚類、特征序列對(duì)比、種內(nèi)種間遺傳距離計(jì)算及在NCBI數(shù)據(jù)庫中下載15個(gè)相似度較大的蜜環(huán)菌序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，得出結(jié)論：11份密環(huán)菌種質(zhì)可能是一個(gè)較為龐大的復(fù)合群，采用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增的核糖體基因可以對(duì)此類蜜環(huán)菌進(jìn)行分類但不適合作為鑒定的持家基因。

楊海旭[14]對(duì)秦巴山區(qū)分離的18株蜜環(huán)菌利用通用引物ITS1/ITS4對(duì)ITS序列擴(kuò)增，對(duì)序列進(jìn)行兩兩相似比較，通過構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)18株蜜環(huán)菌進(jìn)行了鑒定及親緣關(guān)系分類；彭述敏[15]采用通用引物ITS4/ITS5對(duì)供試3個(gè)蜜環(huán)菌菌株進(jìn)行鑒定，初步確定各蜜環(huán)菌菌株的分類地位為：SNA01為芥黃蜜環(huán)菌Armillaria sinapina Berub＆Dessur，SNA04為高盧蜜環(huán)菌Armillaria gallica Marxm＆Romagn，京-234為蜜環(huán)菌Armillaria mellea（Vahl:Fr.）P.Kumm；陸春云[16]利用通用引物組合ITS4/ITS5和通用引物組合983F/2218R對(duì)7株蜜環(huán)菌進(jìn)行鑒定，將菌株1～5號(hào)歸為了一族，菌株6～7號(hào)分為另一族，且菌株6號(hào)形成了一個(gè)分離良好（70%）的姐妹系A(chǔ)rmillaria mellea（AFTOL-ID449），7號(hào)菌株與其他近緣種分離良好（72%），表明菌株6號(hào)和菌株7號(hào)可能與其他蜜環(huán)菌為不同的種，甚至可能為不同的族。以上這些研究方法和研究結(jié)果對(duì)蜜環(huán)菌屬的分子鑒定和分類提供了重要的參考資料。蜜環(huán)菌屬種質(zhì)資源豐富，外觀鑒定較困難，為保證蜜環(huán)菌的優(yōu)質(zhì)穩(wěn)定，種質(zhì)溯源是關(guān)鍵，但在本次研究中，采用通用引物ITS4/ITS5擴(kuò)增核糖體基因，僅將11份蜜環(huán)菌種質(zhì)分為了兩個(gè)大類4個(gè)亞類，不能進(jìn)一步鑒定到種，因此，需繼續(xù)找更加合適、穩(wěn)定的持家基因或結(jié)合其他引物擴(kuò)增的序列，利用NCBI數(shù)據(jù)庫BLAST對(duì)比進(jìn)一步對(duì)11份蜜環(huán)菌種質(zhì)進(jìn)行鑒定。