核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3炎性小體在肝臟疾病中的作用機(jī)制

楊 燕， 葛斐林， 黃 倩， 張馨月， 曾 銳， 肖小河， 柏兆方， 孫 琴,4a,4b

1 西南醫(yī)科大學(xué) a.中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院, b.藥學(xué)院, 四川 瀘州 646000； 2 北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院, 北京 100029；3 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 全軍中醫(yī)藥研究所， 北京 100039； 4 西南醫(yī)科大學(xué)附屬中醫(yī)醫(yī)院 .中西醫(yī)結(jié)合藥物研究中心, b.國(guó)家中醫(yī)臨床研究基地, 四川 瀘州 646000

天然免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)與多種疾病有關(guān)。天然免疫中通過(guò)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式等多種危險(xiǎn)信號(hào)，啟動(dòng)特定的信號(hào)通路，誘導(dǎo)不同的基因表達(dá)，活化細(xì)胞從而產(chǎn)生一系列的炎癥因子，誘導(dǎo)發(fā)生炎癥反應(yīng)[1]。而識(shí)別危險(xiǎn)信號(hào)的模式識(shí)別受體(PRR)是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵之一，主要包括Toll受體、NOD樣受體、RIG受體、細(xì)胞質(zhì)DNA感受器、糖類(lèi)受體、清道夫受體等，而其中NOD樣受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中形成的炎癥小體在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用[2]。

正常情況下，炎癥小體通過(guò)炎癥反應(yīng)對(duì)肝臟受到的外來(lái)感染及損傷起到免疫保護(hù)作用，然而在其過(guò)度活化的情況下可能對(duì)肝臟造成炎癥損傷。尤其N(xiāo)LRP3炎癥小體介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)，可能與肝臟疾病的發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[3]。本文將分別對(duì)炎癥小體、NLRP3炎癥小體的活化機(jī)制及其在不同肝臟疾病中的作用機(jī)制進(jìn)行綜述。

1 炎癥小體的簡(jiǎn)介及活化機(jī)制

1.1 炎癥小體的簡(jiǎn)介 炎癥小體是NOD樣模式識(shí)別受體的蛋白復(fù)合物，由NOD樣模式識(shí)別受體蛋白、凋亡相關(guān)的斑點(diǎn)樣蛋白(ASC)及含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Pro-caspase1)組成，在固有免疫的炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著重要作用。其中NOD樣模式識(shí)別受體為受體蛋白，ASC為接頭蛋白，Pro-caspase1為效應(yīng)蛋白。ASC包含兩個(gè)重要的結(jié)構(gòu)域即PYD和CARD。其N(xiāo)端PYD結(jié)構(gòu)域與NLR的PYD結(jié)構(gòu)域結(jié)合并相互作用，C端的CARD結(jié)構(gòu)域與效應(yīng)器Pro-casepase1的CARD結(jié)構(gòu)域連接，通過(guò)募集Pro-caspase1介導(dǎo)形成炎癥小體復(fù)合物[4]。

由于NOD樣模式識(shí)別受體的不同，炎癥小體可以分為NLRP1炎癥小體、NLRP3炎癥小體、NLRP4炎癥小體、NLRP6炎癥小體、NLRP12炎癥小體、AIM2炎癥小體。不同的炎癥小體在肝臟疾病中發(fā)揮的作用也不盡相同[3]。NLRP4炎癥小體與酒精性肝病(ALD)的發(fā)展密切相關(guān)，具體機(jī)制尚不清楚[5]。NLRP6炎癥小體可以通過(guò)抑制NF-κB和MAP激酶的活化，增加傷寒沙門(mén)氏菌對(duì)肝臟的感染，促進(jìn)肝臟的炎癥損傷[6]。NLRP12炎癥小體通過(guò)抑制IκBα和ERK的磷酸化，增加肝臟對(duì)沙門(mén)氏菌的易感性[7]。AIM2炎癥小體通過(guò)促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放炎癥因子，從而促進(jìn)肝硬化患者的炎癥損傷[8]。在所有的炎癥小體中，NLRP3炎癥小體目前研究最多，機(jī)制也相對(duì)最清楚。

1.2 NLRP3炎癥小體的的活化機(jī)制 NLRP3炎癥小體不僅存在于肝臟免疫細(xì)胞中，如單核巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞中，尤其以單核巨噬細(xì)胞居多，還可見(jiàn)于一些非免疫細(xì)胞，如肝臟實(shí)質(zhì)細(xì)胞、肝星狀細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及肌纖維母細(xì)胞等, 可引起一系列免疫炎癥反應(yīng)[9]。NLRP3炎癥小體由 NLRP3、ASC和Pro-caspase1組成，其中NLRP3為受體蛋白，ASC為接頭蛋白，Pro-caspase1為效應(yīng)蛋白。NLRP3炎癥小體的活化需要兩級(jí)信號(hào)[10]，第一級(jí)信號(hào)(初始階段)：病原體相關(guān)分子模式比如LPS與細(xì)胞表面的Toll樣受體結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄因子NF-κB，進(jìn)而激活調(diào)控NLRP3蛋白和Pro-caspase1的基因表達(dá)，NLRP3蛋白和Pro-caspase1分泌增多；第二級(jí)信號(hào)(活化階段)：在ATP、二氧化硅(SiO2)、尿酸鈉晶體(MSU)、尼日利亞菌素等物質(zhì)的刺激下，NLRP3、ASC和Pro-caspase1組裝形成了復(fù)合體——NLRP3炎癥小體。NLRP3炎癥小體促進(jìn)Pro-caspase1的自我剪切形成caspase1蛋白，caspase1蛋白剪切IL-1β和IL-18的前體蛋白pro-IL-1β、pro-IL-18，產(chǎn)生大量的炎癥因子IL-1β和IL-18，從而引起炎癥反應(yīng)。值得注意的是[11]，在NLRP3炎癥小體的第二級(jí)信號(hào)中，炎癥小體介導(dǎo)包含caspase-1在內(nèi)的多種caspase的激活，進(jìn)而促進(jìn)消皮素D等多種消皮素家族成員的剪切和多聚化，引起細(xì)胞焦亡，從而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)容物的釋放進(jìn)而引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)(圖1)。

2 NLRP3炎癥小體在肝臟疾病中的作用機(jī)制

2.1 NLRP3炎癥小體在病毒性肝病中的作用機(jī)制 有研究[12]表明，炎癥小體在病毒性肝病中發(fā)揮著重要作用。在病毒引起的炎癥性肝損傷死亡患者中，大約90%是由于感染HBV[13]。HBV主要通過(guò)肝細(xì)胞的鈉離子?；悄懰峁厕D(zhuǎn)運(yùn)蛋白(NTCP)進(jìn)入到肝細(xì)胞內(nèi)，進(jìn)而在肝細(xì)胞內(nèi)復(fù)制增殖。HBV的病原學(xué)機(jī)制復(fù)雜，目前仍尚不確切。近年來(lái)從NLRP3炎癥小體角度研究HBV的機(jī)制是新興熱點(diǎn)之一[14]。HBV本身不會(huì)對(duì)宿主細(xì)胞造成損傷，然而其分泌的相關(guān)蛋白包括HBsAg、HBeAg、HBX蛋白以及DNA、RNA作為病原體相關(guān)分子模式，可以通過(guò)識(shí)別單核巨噬細(xì)胞或者肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的NOD樣受體，進(jìn)而激活固有免疫，釋放大量炎性細(xì)胞因子造成肝臟的炎癥損傷。由于HBV cccDNA已經(jīng)整合到肝細(xì)胞的細(xì)胞核中，因此現(xiàn)有藥物很難完全清除HBV，從而造成體內(nèi)持續(xù)的炎癥損傷[15]。

圖1 NLRP3炎癥小體的活化機(jī)制示意圖

HBV對(duì)NLRP3炎癥小體的作用是雙向的，一方面，有研究[16]表明，HBV的HBX蛋白通過(guò)激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)氧化應(yīng)激而導(dǎo)致肝細(xì)胞炎癥損傷。在乙型肝炎活動(dòng)期未經(jīng)治療的患者中，其肝臟中的NLRP3、caspase1和IL-1β顯著升高[17]，表明NLRP3介導(dǎo)的IL-1β與HBV介導(dǎo)的肝臟炎癥損傷密切相關(guān)。而另一方面，研究[18]表明HBeAg通過(guò)抑制NF-κB通路和活性氧(ROS)的產(chǎn)生，來(lái)抑制脂多糖誘導(dǎo)的NLRP3炎性小體的激活和IL-1β的產(chǎn)生，通過(guò)對(duì)固有免疫的抑制而拮抗機(jī)體對(duì)其免疫清除。值得注意的是，NLRP3炎癥小體在急性HBV感染與慢性HBV感染中的表達(dá)亦是有差異的，但是機(jī)制尚不清楚[19]。

2.2 NLRP3炎癥小體在ALD中的作用機(jī)制 ALD是由于酒精的過(guò)度攝入而引起的肝損傷，嚴(yán)重者可能發(fā)展為肝硬化、肝衰竭、肝癌[20]。有研究[21]表明，在ALD模型小鼠，NLRP3炎癥小體介導(dǎo)的NLRP3、caspase1 和IL-1β升高，然而將NLRP3、caspase-1的基因敲除后，小鼠的肝臟炎癥性損傷顯著降低，表明NLRP3炎癥小體與ALD的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步研究表明，暴露于酒精的肝臟單核巨噬細(xì)胞通過(guò)激活NLRP3炎癥小體而促進(jìn)IL-1β的釋放，進(jìn)而募集更多的自然殺傷T淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞，導(dǎo)致肝炎的加劇[22]。NLRP3炎癥小體不僅能夠增加IL-1β的分泌，還能介導(dǎo)細(xì)胞的焦亡[23]。有研究[24]表明，在ALD模型小鼠，焦亡相關(guān)蛋白消皮素含量較高，細(xì)胞焦亡引發(fā)的炎癥反應(yīng)加重了肝臟的炎癥損傷。綜上，NLRP3炎癥小體在ALD中發(fā)揮著重要作用，但是其機(jī)制仍然尚不確切。

2.3 NLRP3炎癥小體在非酒精性脂肪性肝病(NAFLD) 中的作用機(jī)制 NAFLD 是最常見(jiàn)的慢性肝病，根據(jù)其病程進(jìn)展，分為非酒精性肝脂肪變、非酒精脂肪性肝炎(NASH) 、肝硬化和肝細(xì)胞癌。據(jù)估計(jì)，10%～20%的 NAFLD最終將發(fā)展為 NASH，其具體機(jī)制雖尚未完全明確，但目前已證實(shí)的是，炎癥反應(yīng)在“二次打擊”假說(shuō)中發(fā)揮重要作用[25]。NASH患者脂代謝紊亂，肝脂肪異常沉積，脂肪組織分解導(dǎo)致血清游離脂肪酸水平增高，通過(guò)上述溶酶體破裂、線粒體反應(yīng)等途徑，飽和脂肪酸可誘導(dǎo)大量ROS 生成，激活 NLRP3 炎性小體從而造成炎癥損傷[25-26]。其中，NASH中主要是通過(guò)M1型巨噬細(xì)胞激活NLRP3 炎性小體而發(fā)揮炎癥效應(yīng)[27]。

NLRP3 炎性小體的過(guò)度表達(dá)促進(jìn)于NASH的病理過(guò)程。一方面可以直接影響NASH，有研究[28]還發(fā)現(xiàn)，NLRP3敲除小鼠的血清和肝組織TNFα、IL-18含量明顯降低，肝損傷和肝纖維化程度亦有所改善。另一方面，NLRP3 炎性小體可能調(diào)控胰島素抵抗(IR)而影響NASH,其作用機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)控AMPK/NLRP3/HMGB-1信號(hào)通路而減輕脂肪β細(xì)胞自身的炎癥反應(yīng)，并改善肝細(xì)胞對(duì)胰島素的敏感性[29]。此外， NLRP3 炎性小體介導(dǎo)的焦亡效應(yīng)也可以調(diào)控NASH, 有研究[30]表明，通過(guò)敲除消皮素基因，可以顯著降低NASH老鼠的炎癥損傷，表明消皮素介導(dǎo)的細(xì)胞焦亡在NASH中發(fā)揮著重要作用。值得注意的是，P2X7是NLRP3 炎性小體活化第二級(jí)信號(hào)中的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，P2X7受體/NLRP3軸在NAFLD/NASH中也發(fā)揮著重要作用，有研究[31-33]發(fā)現(xiàn)通過(guò)抑制P2X7，從而抑制NLRP3炎性小體活化，可以最終改善NASH。

NLRP3 炎性小體的適度表達(dá)抑制NASH的病理過(guò)程。有研究[6]發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體缺失會(huì)增加NASH患者的細(xì)菌感染和損傷，認(rèn)為NLRP3炎癥小體對(duì)NASH患者有益。此外[34]，NLRP3炎癥小體及其效應(yīng)蛋白IL-18可通過(guò)調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，減輕肝細(xì)胞壞死或凋亡。以上研究表明NLRP3炎癥小體在NASH患者中發(fā)揮著雙向調(diào)節(jié)作用，因此，在NASH患者的治療中，不能純粹的抑制NLRP3炎癥小體，適當(dāng)調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體才能達(dá)到更好的治療效果。

2.4 NLRP3炎癥小體在肝纖維化的作用機(jī)制 肝纖維化是一種由酒精、病毒、循環(huán)障礙、自身免疫應(yīng)答、代謝異常、遺傳及藥物等多種因素，長(zhǎng)期或反復(fù)刺激引起導(dǎo)致的慢性進(jìn)行性肝臟受損，是多種肝臟疾病發(fā)展為終末期肝病的病理基礎(chǔ)。簡(jiǎn)言之，多種肝病“殊途同歸”的病理過(guò)程/疾病即肝纖維化。而在整個(gè)肝纖維化的病理過(guò)程中，炎癥幾乎貫穿始終。其中尤其以NLRP3炎性小體為中心的NLRP3信號(hào)通路尤為重要，已成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)，活化的NLRP3炎性小體可刺激大量致炎因子生成與釋放，從而加速纖維化的發(fā)展[35]。

針對(duì)NLRP3炎性小體在肝纖維化中的作用，有學(xué)者[35]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)NLRP3炎性小體缺乏的小鼠 Ⅰ 型膠原和TIMP-1蛋白的表達(dá)顯著降低。同時(shí)，與正常小鼠(健康小鼠)相比，NLRP3炎性小體正常的肝纖維化小鼠肝組織中NLRP3與肝星狀細(xì)胞標(biāo)志物的共定位增加。以上實(shí)驗(yàn)表明NLRP3炎性小體與肝纖維化的發(fā)病密切相關(guān)，可以促進(jìn)肝纖維化的生成。進(jìn)一步研究[36]表明，除肝星狀細(xì)胞外，巨噬細(xì)胞在肝纖維化中發(fā)揮著重要作用。肝星狀細(xì)胞和巨噬細(xì)胞通過(guò)激活NLRP3小體，釋放大量的致炎因子(IL-1β)，從而刺激肝星狀細(xì)胞的活化和不斷增殖。此外，有研究[37]表明M2型巨噬細(xì)胞是肝纖維化中發(fā)揮主要作用的肝臟巨噬細(xì)胞類(lèi)型。

2.5 NLRP3炎癥小體在肝癌中的作用機(jī)制 NLRP3炎癥小體在肝癌的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮著兩種相反作用[38-39]。一方面，NLRP3炎癥小體在肝癌中發(fā)揮促進(jìn)作用。在腫瘤的發(fā)生過(guò)程中，纖維細(xì)胞與腫瘤的生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，其通過(guò)感受損傷相關(guān)分子模式，進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體導(dǎo)致IL-1、IL-18等炎癥因子的釋放，促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移基因和生長(zhǎng)因子的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的黏附和轉(zhuǎn)移。除纖維細(xì)胞外，在樹(shù)突狀細(xì)胞介導(dǎo)的T淋巴細(xì)胞釋放IFN γ的過(guò)程中，NLRP3炎癥小體也發(fā)揮了重要作用[40]。另一方面，NLRP3炎癥小體在肝癌中發(fā)揮了保護(hù)作用。當(dāng)肝癌患者的肝組織損傷到一定程度后，IL-1β的釋放可以誘導(dǎo)腫瘤前體細(xì)胞凋亡，發(fā)揮腫瘤抑制作用。此外，IL-18信號(hào)通路的適當(dāng)激活對(duì)于腫瘤也有抑制作用[41]。

2.6 NLRP3炎癥小體在藥物性肝損傷(DILI)中的作用機(jī)制 DILI是指由各類(lèi)處方和非處方的化學(xué)藥物、生物制劑、中藥、天然藥、保健品、膳食補(bǔ)充劑及其代謝產(chǎn)物等所誘發(fā)肝細(xì)胞損傷死亡、肝酶異常及引起相關(guān)臨床表現(xiàn)的疾病，部分患者能夠引起急性肝衰竭甚至死亡。盡管DILI發(fā)生的機(jī)制上游不盡相同，然而其下游損傷機(jī)制均主要集中于炎癥損傷。對(duì)于固有型肝毒性，當(dāng)有毒中藥或者經(jīng)過(guò)肝臟代謝的有毒成分可以對(duì)肝細(xì)胞直接造成損傷，損傷的肝臟細(xì)胞會(huì)釋放損傷相關(guān)分子模式(比如尿酸、活性氧等)，通過(guò)與免疫細(xì)胞上的模式識(shí)別受體結(jié)合進(jìn)而激活NLRP3炎癥小體，IL-1β大量釋放招募肝臟更多的炎癥細(xì)胞，從而引起肝臟的炎癥損傷。比如雷公藤及其主要活性成分均可以導(dǎo)致固有肝毒性，Yuan等[42]研究表明，雷公藤甲素通過(guò)激活NLRP3炎癥小體而導(dǎo)致肝毒性的發(fā)生。

表1 NLRP3炎癥小體在肝臟疾病中的作用機(jī)制小結(jié)Table 1 Summary of the mechanism of NLRP3 inflammasome in liver diseases

而免疫特異質(zhì)肝損傷則是藥物在免疫異常狀態(tài)下發(fā)生肝毒性，而在正常狀態(tài)下則不易產(chǎn)生肝毒性。Wang等[43]發(fā)現(xiàn)卡馬西平在正常小鼠上沒(méi)有出現(xiàn)明顯肝毒性，然而在LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)激狀態(tài)下則產(chǎn)生顯著肝毒性。將LPS介導(dǎo)的免疫應(yīng)激狀態(tài)下小鼠NLRP3炎癥小體敲除后沒(méi)有出現(xiàn)明顯肝毒性，表明NLRP3炎癥小體在免疫特異質(zhì)肝損傷的發(fā)生中發(fā)揮著重要作用。深入研究表明，卡馬西平可以增加線粒體損傷而導(dǎo)致ROS釋放，進(jìn)而促進(jìn)肝臟單核巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞中NLRP3炎癥小體的活化，IL-1β等炎癥因子大量釋放從而引起肝臟的炎癥損傷。除化學(xué)藥外，中藥引起的特異質(zhì)肝損傷中亦與NLRP3炎癥小體密切相關(guān)，中藥淫羊藿的有效成分淫羊藿次苷Ⅰ可以特異性地促進(jìn)ATP或尼日利亞霉素誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體活化，從而引起特異性肝毒性[44]。

3 小結(jié)

NLRP3炎癥小體是固有免疫中的核心成分之一，在正常狀態(tài)下，通過(guò)固有免疫反應(yīng)對(duì)病原微生物、損傷相關(guān)成分、腫瘤等對(duì)機(jī)體“不利”的因素進(jìn)行清除，從而發(fā)揮對(duì)肝臟的免疫保護(hù)作用。然而，NLRP3炎癥小體的過(guò)度活化會(huì)引起過(guò)度的免疫炎癥反應(yīng)，從而引起肝臟的炎癥損傷，可以導(dǎo)致病毒性肝病、ALD、NAFLD、肝癌、肝纖維化、藥源性肝病等(表1)。綜上，NLRP3炎癥小體在肝臟中存在雙重作用，其適當(dāng)表達(dá)對(duì)肝臟有保護(hù)作用、過(guò)度表達(dá)對(duì)肝臟有炎癥損傷作用，正如中醫(yī)上的陰陽(yáng)平衡原則，“陰平陽(yáng)秘，精神乃至，陰陽(yáng)離決，精氣乃絕”。因此，盡管大多數(shù)肝臟相關(guān)疾病均是由于NLRP3炎癥小體的過(guò)度上調(diào)而引起，抑制NLRP3炎癥小體活化是肝臟疾病治療的一個(gè)好的方向。然而NLRP3炎癥小體的作用是一把雙刃劍，處于一個(gè)相對(duì)平衡的狀態(tài)對(duì)機(jī)體最有益處，因此在肝臟疾病中應(yīng)當(dāng)對(duì)NLRP3炎癥小體進(jìn)行適度調(diào)節(jié)，從而達(dá)到NLRP3小體的一個(gè)適度活化狀態(tài)，以期達(dá)到最理想的治療效果。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楊燕、葛斐林負(fù)責(zé)起草文章；黃倩、張馨月、曾銳負(fù)責(zé)收集資料；肖小河、柏兆方、孫琴負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，修改文章關(guān)鍵內(nèi)容并最后定稿。