早期肝癌無創(chuàng)診斷之匙
——循環(huán)游離DNA聯(lián)合型液體活檢

葉婷丹， 雷學(xué)忠

1 四川大學(xué) 華西臨床醫(yī)學(xué)院， 成都 610041； 2 四川大學(xué)華西醫(yī)院 感染性疾病中心， 成都 610041

肝癌是全球第四大常見惡性腫瘤。最常用的肝癌標(biāo)志物主要是AFP、異常凝血酶原 (protein induced by vitamin K absence，PIVKA-Ⅱ)等[1]。目前臨床上最常用的肝癌篩查模式——AFP聯(lián)合超聲檢測對肝硬化中晚期患者漏診誤診率高、對小腫瘤的檢出率低，以致大部分肝癌患者在被確診時已處于中晚期，導(dǎo)致嚴(yán)重的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)及不良預(yù)后。美國肝病學(xué)會指南早已不再建議將AFP檢測作為單獨篩查診斷肝癌的指標(biāo)。

近年來，隨著分子生物學(xué)、基因組學(xué)等基礎(chǔ)學(xué)科向癌癥領(lǐng)域延伸，液體活檢應(yīng)運而生，已成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療領(lǐng)域的前沿?zé)狳c。液體活檢是指從血液中捕獲游離的腫瘤信息，進而反映機體全身腫瘤信息。與傳統(tǒng)的穿刺活檢相比，液體活檢具備無創(chuàng)、可反復(fù)采樣、可實時“更新反饋”腫瘤負(fù)荷、克服腫瘤異質(zhì)性、指導(dǎo)個性化用藥等優(yōu)點[2]。尤其是循環(huán)游離DNA(circulating free DNA, cfDNA)，在腫瘤的早期篩查、診斷、監(jiān)測、輔助指導(dǎo)治療，腫瘤來源定位，腫瘤預(yù)后及復(fù)發(fā)，甚至在器官移植、孕婦非侵入性產(chǎn)前檢測等研究方向都有了更加深入的研究進展[3-4]。cfDNA自1948年被首次發(fā)現(xiàn)以來，已有不少學(xué)者[5-13]對其研究進展進行詳細(xì)歸納、回顧。本文主要對近年來液體活檢法聯(lián)合各類標(biāo)志物診斷早期肝癌的國內(nèi)外研究進展及其在臨床應(yīng)用中的潛力進行綜述。

1 液體活檢研究概述

液體活檢具體內(nèi)容包括cfDNA檢測，循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cell, CTC)檢測及外泌體檢測。其中，CTC是指存在于血液中的游離腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的術(shù)后動態(tài)監(jiān)測及轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)等預(yù)后評價方面具有巨大的臨床應(yīng)用價值。外泌體則通過多種機制促進肝癌的發(fā)生發(fā)展，其與肝癌的早期診斷、耐藥性檢測、預(yù)后評估及治療密切相關(guān)。然而，大多數(shù)外泌體的研究尚處于細(xì)胞實驗及體外取材的早期研究階段，需進一步實驗數(shù)據(jù)支撐。而cfDNA作為液體活檢重點研究對象，1948年被Mandel等[14]首次報道后未引起重視，直到1977年Leon等[15]研究發(fā)現(xiàn)cfDNA在腫瘤患者血液中濃度明顯增加。經(jīng)過研究者們數(shù)十年的不斷驗證和深入探索，cfDNA在癌癥的診斷、監(jiān)測、治療等各個方面的應(yīng)用逐漸廣泛。

目前cfDNA的來源機制尚不完全明確，大多數(shù)研究認(rèn)為其是由腫瘤細(xì)胞、體細(xì)胞凋亡或壞死后釋放入血，cfDNA片段也被證實含有與同源腫瘤組織相同的基因異常改變?nèi)琰c突變、擴增、重排等[16]。cfDNA在健康人外周血濃度平均值約30 ng/mL，而在腫瘤患者中濃度明顯升高，血漿中的cfDNA半衰期為1.5～2 h[17]。根據(jù)具體檢測內(nèi)容不同，cfDNA液體活檢主要包括最初的濃度檢測即定量分析，進一步的定性分析如cfDNA完整性評估、cfDNA甲基化、腫瘤特異性DNA、cfDNA點突變、雜合子缺失及微衛(wèi)星不穩(wěn)定、新興的cfDNA片段化模式以及尚處于假設(shè)階段、未來可能涉及到的其他研究方向如血漿中線粒體DNA的分?jǐn)?shù)濃度等。

2 cfDNA單獨應(yīng)用的不足

cfDNA的應(yīng)用目前面臨許多障礙。除了患者血漿中腫瘤來源特異性DNA比例通常很低這一因素需要一定的技術(shù)支持外，還有不少亟待解決的問題。首先，臨床實踐中可獲得的血液量是有限的，可用標(biāo)本的cfDNA通常處于低水平；其次，cfDNA在采血后應(yīng)盡快處理，以免受到血細(xì)胞裂解釋放的背景DNA干擾。不同的DNA分離技術(shù)和儀器也可能產(chǎn)生cfDNA的顯著變化。例如目前觀察到的常用亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化等離子體方法可以導(dǎo)致輸入DNA的降解以及測序數(shù)據(jù)偏差；而DNA甲基化譜在性別和種族方面也表現(xiàn)出個體差異及腫瘤異質(zhì)性，可能影響甲基化對應(yīng)的檢測效果。目前該研究領(lǐng)域仍缺乏全球標(biāo)準(zhǔn)化cfDNA分離方案及檢測流程。

Liao等[18]第一次對2015年前已發(fā)表的文獻進行Meta分析以評估cfDNA在肝癌診斷中的應(yīng)用，結(jié)果表明，cfDNA在早期肝癌診斷中具有一定的潛力，但是單純cfDNA濃度診斷亞組及單基因甲基化亞組的診斷效能均表現(xiàn)不穩(wěn)定，不足以反映腫瘤的真實情況。同時，AFP聯(lián)合cfDNA診斷亞組(共6例)中檢測敏感度、特異度等所有結(jié)果均有改善。由此提出單獨運用cfDNA的定量和定性分析進行肝癌診斷時，其結(jié)果有很高的假陽性或假陰性概率，這將限制cfDNA的實際價值。

3 cfDNA聯(lián)合型液體活檢

現(xiàn)有更多研究表示cfDNA適宜多指標(biāo)聯(lián)合檢測或與其他肝癌診斷標(biāo)志物進行聯(lián)合檢測，筆者回顧2021年7月前已發(fā)表的聯(lián)合診斷型研究詳見附錄，包括cfDNA定量及定性分析指標(biāo)間的相互聯(lián)合診斷；不同甲基化基因的組合診斷；聯(lián)合AFP、PIVKA-Ⅱ、血清甲胎蛋白異質(zhì)體(serum alpha-fetoprotein variants，AFP-L3)、α-L-巖藻糖苷酶(α-L fucosidase，AFU)診斷；甲基化及腫瘤拷貝數(shù)差之間的聯(lián)合[19-42]。其中，cfDNA定量或定性分析(尤其是DNA甲基化、腫瘤特異性突變等)與AFP、PIVKA-Ⅱ的聯(lián)合檢測備受關(guān)注。

多項基礎(chǔ)研究[43-44]證實，血液中檢測出的DNA啟動子甲基化與其在腫瘤組織中高度一致，DNA甲基化在聯(lián)合AFP等蛋白標(biāo)志物時可提高診斷效能，最早的聯(lián)合甲基化液體活檢可追溯至2011年。2017年，Cohen等[45]研究證實，將基因突變與胰腺癌相關(guān)的生物標(biāo)志物聯(lián)合檢測可以提高經(jīng)血液診斷早期胰腺癌的敏感性，且不會顯著提高假陽性率。其在研究中也闡述了聯(lián)合型液體活檢的兩大顯著優(yōu)點：既解決了cfDNA缺乏實體腫瘤定位性的問題，其檢測效能又優(yōu)于任一單一腫瘤標(biāo)志物。這種方法被證實有很好前景應(yīng)用于多種實體癌癥的早期篩查診斷中[43]。在肝癌領(lǐng)域，蛋白質(zhì)生物標(biāo)志物與超敏腫瘤特異性DNA結(jié)合的一系列研究成為熱門，并不斷有研究證實cfDNA在肝癌診斷方面可與AFP或PIVKA形成優(yōu)勢互補。液體活檢檢測原理及內(nèi)容完全不同于蛋白標(biāo)志物，在AFP陰性人群中表現(xiàn)依舊良好。但此類研究往往自肝癌患者血液及腫瘤組織學(xué)活檢對比中得出，驗證隊列同樣為已確診的腫瘤患者，大多為橫斷面或回顧性研究，缺乏進一步大規(guī)模臨床試驗驗證。Qu等[24]構(gòu)建的肝癌聯(lián)合液體活檢診斷模型中不但納入了年齡、性別等可分析的臨床特征，其驗證隊列為前瞻性研究，并隨訪至今。該診斷模型加入DNA甲基化調(diào)整后，正在筆者中心進行一項乙型肝炎肝硬化患者早期肝癌篩查的前瞻性診斷實驗研究，預(yù)計納入500例。

4 討論與展望

現(xiàn)今臨床研究中可嘗試用于肝癌診斷的生物標(biāo)志物越來越多，包括傳統(tǒng)經(jīng)典蛋白標(biāo)志物、表觀遺傳標(biāo)志物(cfDNA、肝癌相關(guān)基因、微小RNA、長鏈非編碼RNA等)、新興糖代謝組學(xué)寡糖鏈組分檢測(G-test)等。目前已有研究涉及到三聯(lián)甚至更多蛋白標(biāo)志物的聯(lián)合診斷，例如甲基化基因聯(lián)合檢測面板、異常甲基化基因與微小RNA組合模型[37]、G-test聯(lián)合AFP及PIVKA-Ⅱ[46]等等，但識別準(zhǔn)確可行的標(biāo)志物及診斷模式仍十分具有挑戰(zhàn)性，研究目標(biāo)應(yīng)該依舊是不顯著降低特異性的前提下盡可能提高檢測手段的敏感性。

cfDNA的優(yōu)勢在于相對無創(chuàng)、可重復(fù)、可監(jiān)測，與腫瘤突變具有高度一致性；且檢測原理完全不同于蛋白標(biāo)志物，經(jīng)研究證實與AFP、PIVKA等無顯著相關(guān)性，在肝癌診斷中具有疊加效應(yīng)；對于評估預(yù)后、監(jiān)測復(fù)發(fā)方面亦有重要作用。不足之處在于cfDNA檢測敏感度仍然較低，單獨應(yīng)用穩(wěn)定性差，不推薦獨立應(yīng)用；其檢測大體基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和下一代測序技術(shù)(NGS)兩大類，尤其是NGS檢測依賴于高通量的技術(shù)、高質(zhì)量的血液樣本、高額的研究成本，cfDNA的樣品處理、DNA提取、定量和數(shù)據(jù)分析等方面未得到規(guī)范統(tǒng)一，使得這些研究結(jié)果難以直接比較；此外，已發(fā)表的研究樣本量普遍偏少，部分研究缺乏與AFP等常用標(biāo)志物的對比分析，部分研究在選擇肝癌患者時僅關(guān)注HBV或HCV相關(guān)肝癌，其結(jié)果缺乏包容性及可重復(fù)性。目前研究顯示，cfDNA在聯(lián)合應(yīng)用中診斷敏感度可提高至70%～80%，特異度80%～90%。cfDNA對肝癌的診斷和/或預(yù)后價值的明確結(jié)論尚需進一步的多中心、大樣本、前瞻性研究。為最大程度發(fā)揮cfDNA價值，在今后相關(guān)研究設(shè)計過程中可考慮建立規(guī)范、標(biāo)準(zhǔn)、可重復(fù)的cfDNA檢測流程及評定標(biāo)準(zhǔn)；選擇已被證實的特異性肝癌突變基因、甲基化位點進行互補驗證、聯(lián)合診斷甚至序貫診斷；納入各種病因、各臨床分期肝癌患者分層分析，適當(dāng)擴大樣本量，增加前瞻性研究比例；繼續(xù)探索驗證新發(fā)現(xiàn)的潛在標(biāo)志物如外泌體、游離RNA等。隨著以上問題的逐一解決，cfDNA聯(lián)合型液體活檢法必然能夠打開“無創(chuàng)”診斷肝癌的快捷之門，使得肝癌診斷水平得到質(zhì)的飛躍。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：葉婷丹對研究的思路或設(shè)計有關(guān)鍵貢獻，參與了研究數(shù)據(jù)的獲取分析解釋過程，參與起草或修改文章關(guān)鍵內(nèi)容；雷學(xué)忠負(fù)責(zé)指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。

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