益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌前病變肝干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響和作用機(jī)制

鞠 迪， 李 汨， 韓 曼， 房冰瑩， 閆曙光， 李京濤

1 陜西中醫(yī)藥大學(xué) a.陜西省中西醫(yī)結(jié)合心血管病防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, b.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院， 陜西 咸陽(yáng) 712046；2 陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院 肝病一科， 陜西 咸陽(yáng) 712000

肝細(xì)胞癌是人類最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一[1]，多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已至晚期，治療預(yù)后差，5年內(nèi)復(fù)發(fā)率高。肝癌前病變是肝纖維化、肝硬化發(fā)展為肝癌的過(guò)渡階段[2]，其進(jìn)展為惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)顯著增加，如果能及時(shí)阻斷這一惡變過(guò)程，就能阻止肝癌的發(fā)生。但目前肝癌前病變的發(fā)生機(jī)制仍未闡明，臨床也缺乏相應(yīng)的藥物。因此，尋找控制或逆轉(zhuǎn)肝癌前病變的分子機(jī)制具有重大理論意義。PI3K/Akt信號(hào)通路在維持干細(xì)胞增殖和多方向分化具有重要作用，PI3K/Akt信號(hào)通路的異?；罨诟胃杉?xì)胞周期失調(diào)、過(guò)度增殖過(guò)程中扮演重要角色[3-4]，可作為治療慢性肝病的重要靶標(biāo)[5]。益脾養(yǎng)肝方是陜西省名中醫(yī)常占杰教授沿用多年的防治肝硬化進(jìn)展的臨床常用方，前期研究已證實(shí)該方能有效改善肝癌前病變患者臨床癥狀[6]、抑制二乙基亞硝胺(DEN)誘發(fā)的大鼠肝癌前病變[7-12]，但作用機(jī)制尚不十分清楚。本研究旨在探討益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響，探討其是否通過(guò)調(diào)控PI3K/Akt/mTOR通路抑制肝干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化從而發(fā)揮抗肝癌前病變的作用，為該方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性Sprague-Dawley大鼠35只，體質(zhì)量180～200 g，購(gòu)自成都達(dá)碩生物科技有限公司，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2020-24，使用許可證編號(hào):SYXK(川)2019-189，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物正常飼養(yǎng)于溫度20 ℃～24 ℃、相對(duì)濕度50%～60%環(huán)境，自由進(jìn)食和飲水。

1.1.2 藥物及制備 益脾養(yǎng)肝方由白術(shù)、黨參、熟地、鱉甲、枸杞、半枝蓮、郁金、姜黃、白花蛇舌草組成，于陜西中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科購(gòu)買并制成每克生藥含量為5 g的凍干粉，置4 ℃冰箱封存。使用時(shí)溶于100 ℃沸水，配制成中藥湯液濃度為1.0 g/mL。護(hù)肝片由黑龍江葵花藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)。

1.1.3 試劑及耗材 DEN購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；AST、ALT、 Alb測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所；總RNA提取試劑盒購(gòu)自天根生化技術(shù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR?Green qPCR SuperMix購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白提取試劑盒、BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物有限公司；Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin抗體購(gòu)自proteintech公司；Phospho-PI3K p85 (Tyr458) /p55 (Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)抗體購(gòu)自Cell Signaling Techenology公司；谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶(GST3/GST pi)抗體購(gòu)自abcam公司；OV6抗體購(gòu)自R&D Systems公司；山羊抗兔IgG/HRP、山羊抗小鼠IgG/HRP抗體購(gòu)自西安壯志生物科技有限公司；ECL顯影液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司；兔SP試劑盒、鼠SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.4 主要儀器 冷凍型高通量組織研磨器(寧波新芝生物科技股份有限公司)、800TS吸收光酶標(biāo)儀(美國(guó)伯騰儀器有限公司)、超微量分光光度計(jì)(賽默飛世爾科技有限公司)、實(shí)時(shí)定量PCR(RT-PCR)儀(賽默飛世爾科技有限公司)、輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)、YD-AB型攤烤片機(jī)、YD-6L型生物組織包埋機(jī)(金華市益迪醫(yī)療設(shè)備有限公司)。BX41/60型光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)、化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(基因有限公司)，BS224S型電子分析天平(德國(guó)Sariorins公司)。

1.2 動(dòng)物分組 35只大鼠隨機(jī)分為4組：正常對(duì)照組(空白組)5只，DEN模型組(模型組)10只，DEN+護(hù)肝片組(護(hù)肝片組)10只，DEN+益脾養(yǎng)肝方組(益脾養(yǎng)肝方組)10只。除空白組外，其余各組均以0.5 mL/100 g的DEN腹腔注射，每周50 mg/kg(2次/周，即1次/84 h)，連續(xù)給藥16周；空白組：給予同等條件的飼養(yǎng)與抓捕，同等時(shí)間點(diǎn)注射等量生理鹽水。造模次日起益脾養(yǎng)肝方組給予濃度為1.0 g/mL的益脾養(yǎng)肝方藥液灌胃，護(hù)肝片組按 921 mg/kg大鼠體質(zhì)量灌胃，空白組、DEN組大鼠給予等量生理鹽水灌胃。灌胃持續(xù)16周，1次/d。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，每周測(cè)量記錄大鼠體質(zhì)量。待實(shí)驗(yàn)周期結(jié)束，全部大鼠用10%的水合氯醛腹腔注射(0.3 mL/100 g)，待大鼠麻醉后腹主動(dòng)脈取血，收集血清，置于-80 ℃冰箱備用；取各組大鼠肝臟左葉約1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常溫固定過(guò)夜后制作石蠟切片；取肝右葉組織約1 cm×1 cm×1 cm提取總蛋白和總RNA；其余肝組織置于-80 ℃冰箱備用。

1.3 研究方法

1.3.1 肝臟指數(shù) 采集大鼠肝臟，測(cè)量肝重比(肝臟指數(shù))。肝臟指數(shù)(%)=肝臟重量/大鼠體質(zhì)量×100%。

1.3.2 肝功能指標(biāo)的檢測(cè) 采集大鼠腹主動(dòng)脈血，收集血清，檢測(cè)ALT、AST和Alb水平。

1.3.3 肝臟病理組織觀察 病理組織學(xué)采用蘇木素-伊紅(HE)染色和天狼星紅染色觀察各組大鼠肝損傷情況和膠原沉積情況，取各組大鼠肝臟左葉約1 cm×1 cm×1 cm浸入4%多聚甲醛中，常溫固定過(guò)夜后制作石蠟，3 μm切片，經(jīng)脫蠟、水化、染色、分化、透明，中性樹(shù)膠封片。光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠肝組織形態(tài)結(jié)構(gòu)變化，隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行圖片采集，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)肝臟組織膠原沉積光密度值進(jìn)行半定量分析。

1.3.4 免疫組化檢測(cè)GST-Pi及OV6表達(dá) 石蠟切片經(jīng)脫蠟、水化、抗原修復(fù)冷卻后，3% H2O2阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶的活性，0.05%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過(guò)夜，PBS清洗，二抗室溫孵育2 h，PBS清洗，三抗室溫孵育30 min，PBS清洗，DAB顯色，蘇木素復(fù)染、脫水透明后封片。光學(xué)顯微鏡下隨機(jī)選取3個(gè)視野進(jìn)行圖片采集，用Image-Pro Plus 6.0 軟件對(duì)肝組織目的蛋白光密度值進(jìn)行半定量分析。

1.3.5 Western Blot 檢測(cè) 取50 mg肝組織加入蛋白裂解液，使用冷凍型高通量組織研磨器研磨提取總蛋白，BCA法檢測(cè)總蛋白濃度；取20 μg蛋白上樣后電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。一抗Akt、Phospho-Akt(Ser473)、PI3K p85、mTOR、Beta Actin、Phospho-PI3K p85(Tyr458)/p55(Tyr199)、Phospho-mTOR(Ser2448)4 ℃孵育過(guò)夜，二抗室溫孵育1 h，加ECL顯影液曝光。Image J分析計(jì)算條帶的灰度值。

1.3.6 RT-PCR檢測(cè)EpCAM、CD133和CD90表達(dá) 取50 mg肝組織，按RNA提取試劑盒說(shuō)明提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。根據(jù)美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心(NCBI)公布的大鼠基因序列，應(yīng)用Primer 5軟件設(shè)計(jì)引物(表1)，以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR。采用三步法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后根據(jù)各樣本CT值，利用2-ΔΔCT計(jì)算各組基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表Table 1 Primer sequences used in RT-PCR

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝癌前病變的病理變化 造模過(guò)程中，空白組大鼠無(wú)死亡，余5只；模型組死亡1只，余9只；護(hù)肝片組死亡1只，余9只；益脾養(yǎng)肝方組無(wú)死亡，余10只。肉眼觀察：空白組大鼠肝臟表面光滑，質(zhì)地柔軟，無(wú)明顯病變出現(xiàn)；與空白組相比，模型組大鼠肝臟表面可見(jiàn)大量結(jié)節(jié)，分布不均且數(shù)量不等，部分肝組織可伴有淤血及腫塊；益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組肝臟表面粗糙，結(jié)節(jié)數(shù)量及程度較模型組減輕，其中益脾養(yǎng)肝方組改善作用更強(qiáng)。

HE染色顯示：空白組大鼠肝細(xì)胞大小均一，排列整齊，以中央靜脈為軸心呈放射狀排列形成肝索，肝小葉結(jié)構(gòu)完整；模型組大鼠肝細(xì)胞變性壞死，體積增大，核質(zhì)比增加，肝索結(jié)構(gòu)紊亂，并有廣泛的炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，形成大量假小葉；益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組較模型組肝臟病理形態(tài)顯著改善，變性壞死細(xì)胞明顯減少，核質(zhì)比相對(duì)降低，假小葉相對(duì)較少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)減少。天狼星紅染色顯示: 空白組匯管區(qū)血管有少量膠原沉積；模型組可見(jiàn)大量纖維條索將肝組織分割形成假小葉，膠原沉積顯著增多(P<0.05)；益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組纖維條索明顯減少，肝臟分隔減少，膠原沉積顯著減少(P值均<0.05)，益脾養(yǎng)肝方組比護(hù)肝片組更明顯(圖1，表2)。

表2 各組大鼠肝組織中膠原沉積半定量分析Table 2 Semi-quantitative analysis of collagen depositionin liver tissues of rats in various groups

2.2 大鼠肝臟指數(shù)和肝功能的比較 與空白組相比，模型組肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST水平顯著升高(P值均<0.01)，Alb顯著降低(P<0.01)； 與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.01)，Alb明顯升高(P值均<0.01)。與護(hù)肝片組相比，益脾養(yǎng)肝方組肝臟指數(shù)及血清中ALT、AST水平明顯下降(P值均<0.01)，Alb水平明顯升高(P<0.01)。提示益脾養(yǎng)肝方和護(hù)肝片對(duì)DEN誘導(dǎo)的肝癌前病變模型大鼠肝損傷具有保護(hù)作用，且益脾養(yǎng)肝方組效果比護(hù)肝片組顯著(表3)。

圖1 肝組織HE染色和天狼星紅染色(×100)Figure 1 Images of liver sections stained by Hematoxylin-Eosin (HE) and Sirius Red staining(×100)

表3 各組大鼠血清ALT、AST、Alb和肝臟指數(shù)比較Table 3 Comparison of ALT, AST, Alb and liver index in various groups

2.3 大鼠肝癌前病變組織中GST-Pi、OV6蛋白水平的變化 免疫組化結(jié)果顯示，GST-Pi陽(yáng)性灶主要分布在細(xì)胞胞漿中，呈圓形或不規(guī)則形棕黃色團(tuán)塊。空白組未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)；與空白組相比，模型組在匯管區(qū)周圍及肝小葉內(nèi)可見(jiàn)棕黃色陽(yáng)性灶，且顏色較深，GST-Pi呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)(P<0.05)；與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組大鼠肝組織GST-Pi表達(dá)顯著下調(diào)(P值均<0.05)；與護(hù)肝片組相比，益脾養(yǎng)肝方組大鼠肝臟組織GST-Pi表達(dá)明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果提示益脾養(yǎng)肝方和護(hù)肝片可抑制大鼠肝癌前病變的形成，且益脾養(yǎng)肝方組比護(hù)肝片組顯著(圖2，表4)。

免疫組化結(jié)果顯示，OV6蛋白陽(yáng)性灶主要分布在纖維間隔周圍，呈棕黃或棕褐色?？瞻捉M未見(jiàn)明顯陽(yáng)性表達(dá)；與空白組相比，模型組OV6 表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組大鼠肝組織OV6表達(dá)顯著下調(diào)(P值均<0.05)；與護(hù)肝片組相比，益脾養(yǎng)肝方組大鼠肝組織OV6表達(dá)明顯降低(P<0.05)。上述結(jié)果提示益脾養(yǎng)肝方和護(hù)肝片可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝干細(xì)胞標(biāo)志物OV6的表達(dá)，且益脾養(yǎng)肝方組比護(hù)肝片組顯著(圖2，表4)。

注：GST-Pi免疫組化染色(×200)，OV6免疫組化染色(×400)。

表4 各組大鼠肝組織中OV6及GST-Pi含量半定量分析Table 4 Semi-quantitative analysis of OV6 and GST-Piin liver tissues of rats in various groups

2.4 益脾養(yǎng)肝方對(duì)大鼠肝癌前病變組織中EpCAM、CD133、CD90表達(dá)的影響 與空白組相比，模型組大鼠肝組織EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達(dá)水平均顯著增高(P值均<0.05)；與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組大鼠肝組織EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.05)；與護(hù)肝片組相比，益脾養(yǎng)肝方組EpCAM、CD133和CD90 mRNA表達(dá)水平均顯著降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示益脾養(yǎng)肝方和護(hù)肝片可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、CD133和CD90的表達(dá)，且益脾養(yǎng)肝方組比護(hù)肝片組顯著(表5)。

2.5 益脾養(yǎng)肝方可抑制大鼠肝組織PI3K/Akt /mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白的磷酸化 Western Blot結(jié)果顯示,與空白組相比，模型組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)均顯著升高(P值均<0.05)；與模型組相比，益脾養(yǎng)肝方組和護(hù)肝片組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)；與護(hù)肝片組相比，益脾養(yǎng)肝方組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白的表達(dá)均顯著降低(P值均<0.05)。上述結(jié)果提示益脾養(yǎng)肝方和護(hù)肝片可抑制肝癌病變模型大鼠PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白PI3K、Akt、mTOR的磷酸化，且益脾養(yǎng)肝方組比護(hù)肝片組顯著(圖3，表6)。

圖3 PI3K/Akt/mTOR在DEN誘導(dǎo)肝癌前病變組織中的表達(dá)

3 討論

癌前病變是一種臨床常見(jiàn)的組織學(xué)改變，其進(jìn)展為惡性腫瘤的風(fēng)險(xiǎn)高，及時(shí)阻斷癌前病變的發(fā)生、發(fā)展，是癌癥防治工作的重點(diǎn)。肝癌前病變是肝纖維化、肝硬化發(fā)展為肝癌的過(guò)渡階段，目前肝癌前病變的發(fā)生機(jī)制尚未闡明，臨床也缺乏相應(yīng)的藥物。隨著大量且深入的臨床療效觀察，中醫(yī)藥在防治肝癌及肝癌前病變方面展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，可降低肝癌發(fā)生率、延緩疾病進(jìn)程[13-15]。本著“未病先防”“既病防變”的思想，從整體觀念出發(fā)，辨病與辨證相結(jié)合，以求能夠更加客觀把握疾病發(fā)生發(fā)展規(guī)律，為肝癌前病變的治療研究提供了新思路[16]。益脾養(yǎng)肝方是陜西省名中醫(yī)常占杰教授沿用多年的防治肝硬化進(jìn)展的臨床常用方，由黨參、白術(shù)、熟地、枸杞、姜黃、鱉甲、郁金、半枝蓮、白花蛇舌草九味藥物組成，具有益脾養(yǎng)肝、行氣活血、解毒散結(jié)的功效。臨床研究[6]表明該方能有效改善肝癌前病變患者臨床癥狀，緩解高危轉(zhuǎn)癌風(fēng)險(xiǎn)患者的患癌率。已完成的實(shí)驗(yàn)研究[7-12]證實(shí)益脾養(yǎng)肝方顯著減輕DEN誘發(fā)的大鼠肝癌前病變組織的病理形態(tài)，通過(guò)下調(diào)PCNA和GGT蛋白的表達(dá)，發(fā)揮抗細(xì)胞增殖、抗細(xì)胞氧化損傷的作用；通過(guò)抑制肝組織IL-6、TNFα、TLR4、NF-κB、STAT3等炎癥相關(guān)因子的表達(dá)，降低炎癥纖維化微環(huán)境對(duì)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的刺激作用；可提高CD3+、CD4+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，降低CD8+T淋巴細(xì)胞數(shù)量，調(diào)控T淋巴細(xì)胞亞群數(shù)目和比例，增強(qiáng)機(jī)體免疫功能；可上調(diào)抑癌因子miRNA-124并下調(diào)致癌因子miRNA-221的表達(dá)，從而延緩肝癌前病變進(jìn)展[7-12]。

表5 各組大鼠肝組織中EpCAM、CD133和CD90 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較Table 5 Comparison of mRNA expression levels of EpCAM, CD133 and CD90 in various groups

表6 各組大鼠肝組織中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路相關(guān)蛋白半定量分析Table 6 Semi-quantitative analysis of PI3K/Akt/mTOR signaling pathway-related protein in liver tissues of rats in various groups

GSTs是一組與機(jī)體解毒作用有關(guān)的酶類，其中GST-Pi可作為肝癌前病變的標(biāo)志，是肝癌研究中檢測(cè)癌前病變的常用指標(biāo)[17]。GST-Pi在正常大鼠肝臟基本無(wú)活性，出現(xiàn)癌前病變時(shí)，肝細(xì)胞的去分化和肝干細(xì)胞的異常分化與增生可促進(jìn)GST-Pi的表達(dá)。ALT、AST、Alb是評(píng)價(jià)肝功能的常用指標(biāo)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)益脾養(yǎng)肝方可抑制肝癌前病變大鼠血清中ALT和AST的升高，提高Alb的水平，且明顯改善大鼠肝組織病理形態(tài)，減少膠原沉積及假小葉的形成，降低肝癌前病變標(biāo)志物GST-Pi的表達(dá)，表明益脾養(yǎng)肝方可明顯抑制肝癌前病變的進(jìn)展，與前期研究相符。

肝癌前病變的產(chǎn)生涉及炎癥纖維化微環(huán)境的形成、肝癌干細(xì)胞的產(chǎn)生及二者相互作用并最終形成結(jié)節(jié)性病變。其中肝癌干細(xì)胞的產(chǎn)生是整個(gè)過(guò)程中最關(guān)鍵的步驟之一[18]。以往認(rèn)為肝癌干細(xì)胞來(lái)源于成熟肝細(xì)胞的去分化，而越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明肝癌干細(xì)胞來(lái)源于肝干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化[19]。肝干細(xì)胞主要存在于肝膽管末端Hering管，又稱卵圓細(xì)胞，是慢性肝病患者肝臟中出現(xiàn)的一種具有多向分化潛能的原始細(xì)胞[20]。在肝細(xì)胞嚴(yán)重受損或分裂增生受到抑制時(shí)，肝干細(xì)胞可向肝細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞多向分化；當(dāng)致癌因素存在時(shí)，可誘導(dǎo)肝干細(xì)胞活化增殖與惡性轉(zhuǎn)化為肝癌干細(xì)胞[21]。已有研究報(bào)道PI3K/Akt信號(hào)通路在肝癌前病變進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。PI3K是細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖和遷移調(diào)控的第二信使，可通過(guò)下游Akt信號(hào)分子共同維持干細(xì)胞增殖和多方向分化。PI3K/Akt信號(hào)通路的異?；罨诟胃杉?xì)胞周期失調(diào)、過(guò)度增殖過(guò)程中扮演重要角色[3-4]，在肝纖維化、肝硬化和肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可作為治療慢性肝病的重要靶標(biāo)[5]。葛根素6-O-木糖苷[22]可通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR降低肝癌細(xì)胞活力、增殖和干性，并促進(jìn)了肝癌細(xì)胞自噬和線粒體依賴的凋亡；苦參堿衍生物[23]通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路減少肝癌干細(xì)胞富集；丹參多酚酸鹽[24]通過(guò)抑制PI3K/Akt/mTOR通路降低α-SMA、Collagen Ⅰ、CollagenⅢ的表達(dá)發(fā)揮抗纖維化的作用。本研究顯示益脾養(yǎng)肝方可抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路中PI3K、Akt、mTOR蛋白的磷酸化，繼而改善肝癌前病變。

本研究的創(chuàng)新之處在基于肝干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化在肝癌前病變中的作用，選擇臨床療效確切的名中醫(yī)經(jīng)驗(yàn)方作為研究對(duì)象，從肝癌前病變出發(fā)，符合中醫(yī)治未病理論。但益脾養(yǎng)肝方對(duì)肝干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的影響尚未完全闡明，本研究結(jié)果顯示益脾養(yǎng)肝方可降低肝干細(xì)胞標(biāo)志物OV6的表達(dá)，同時(shí)可顯著抑制肝癌干細(xì)胞標(biāo)志物EpCAM、CD133、CD90的表達(dá)，表明益脾養(yǎng)肝方可抑制肝干細(xì)胞向肝癌干細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化，在一定程度上闡明了益脾養(yǎng)肝方抗肝癌前病變的作用機(jī)制。

綜上所述，益脾養(yǎng)肝方可抑制大鼠肝癌前病變組織中肝干細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化，其機(jī)制可能與調(diào)控PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路有關(guān)。本研究結(jié)果為益脾養(yǎng)肝方抗肝癌前病變的臨床應(yīng)用提供了理論基礎(chǔ)，也為益脾養(yǎng)肝方抗肝癌前病變作用機(jī)制的深入探討提供了一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2019年3月13日經(jīng)由陜西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會(huì)審批，批號(hào)：SUCMDL20211115001，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：鞠迪負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；李汨、韓曼負(fù)責(zé)收集數(shù)據(jù)，修改論文；房冰瑩負(fù)責(zé)整理數(shù)據(jù)，統(tǒng)計(jì)分析；李京濤、閆曙光負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。