血管內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化遺傳示蹤小鼠模型的構(gòu)建及其在肝纖維化研究中的應(yīng)用

許 皓， 阮 柏,2， 歷志文， 房志強(qiáng)， 王 琳， 竇科峰

1 空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院 肝膽胰脾外科， 西安 710032；2 空軍軍醫(yī)大學(xué)航空航天醫(yī)學(xué)系 航空航天臨床醫(yī)學(xué)中心， 西安 710032

肝纖維化是各種慢性肝損傷的共同病理改變，也是慢性肝病發(fā)展到肝硬化的必經(jīng)環(huán)節(jié)。其病理特征是肌纖維母細(xì)胞產(chǎn)生大量肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)，并過(guò)度沉積在纖維間隔和竇周間隙，導(dǎo)致正常肝小葉結(jié)構(gòu)破壞和異常血管重建[1]。以往研究[2-3]普遍認(rèn)為，活化的肝星狀細(xì)胞(HSC)是纖維化肝臟中肌纖維母細(xì)胞的主要來(lái)源。

α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(alpha smooth muscle actin，α-SMA)是公認(rèn)的間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物。近年來(lái)，研究者通過(guò)遺傳示蹤技術(shù)在實(shí)體器官纖維化模型中證明，一部分血管內(nèi)皮細(xì)胞能夠轉(zhuǎn)分化為α-SMA+的肌纖維母細(xì)胞，進(jìn)而產(chǎn)生ECM并參與各器官的纖維化進(jìn)展[4-5]。肝臟組織特異性的血管內(nèi)皮——肝血竇內(nèi)皮細(xì)胞(liver sinusoidal endothelial cell，LSEC)在肝損傷病理?xiàng)l件下也會(huì)發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化，即由內(nèi)皮細(xì)胞向間質(zhì)樣細(xì)胞特征轉(zhuǎn)變。在此過(guò)程中，LSEC不僅表達(dá)間質(zhì)樣細(xì)胞標(biāo)志物，同時(shí)也會(huì)產(chǎn)生ECM并參與肝臟血竇區(qū)的膠原沉積和纖維化形成[6]。

tdTomato熒光蛋白(tandem-dimer tomato，tdTomato)和增強(qiáng)綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein，eGFP)作為穩(wěn)定的熒光標(biāo)記物，已廣泛應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因小鼠品系構(gòu)建和細(xì)胞標(biāo)記實(shí)驗(yàn)。利用熒光蛋白標(biāo)記α-SMA，可特異性反映細(xì)胞發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化的情況。同時(shí)，利用Cre/Loxp系統(tǒng)介導(dǎo)的他莫昔芬可誘導(dǎo)條件性基因敲除技術(shù)，Cre重組酶可在成體細(xì)胞中特異性識(shí)別兩個(gè)Loxp位點(diǎn)間的序列，發(fā)生特異性基因片段刪除的“剪切效應(yīng)”，實(shí)現(xiàn)特定種類細(xì)胞的靶基因敲除[7-8]。本研究設(shè)計(jì)構(gòu)建了一種Acta2-Knockin(KI)熒光示蹤基因敲入小鼠，該基因全長(zhǎng)包含9個(gè)外顯子(圖1)，構(gòu)建策略是在第2個(gè)外顯子的下游內(nèi)含子區(qū)插入Loxp-tdTomato-STOP-Loxp-eGFP片段。再與內(nèi)皮特異性Cdh5-CreERT工具鼠進(jìn)行雜交，最終構(gòu)建出Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤小鼠，當(dāng)他莫昔芬誘導(dǎo)Cre重組酶激活時(shí)，成體小鼠血管內(nèi)皮細(xì)胞中tdTomato和STOP終止子序列將被Cre/Loxp系統(tǒng)切除，形成移碼突變，此時(shí)若內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)Acta2，則會(huì)翻譯表達(dá)eGFP。

圖1 Cdh5-CreERT/Acta2小鼠的構(gòu)建策略與作用機(jī)制Figure 1 Establishing strategy and mechanism of Cdh5-CreERT/Acta2 mice

1 材料與方法

1.1 主要試劑 ECM培養(yǎng)基套裝(Sciencell：1001)、CCl4(天津富宇：04519)、橄欖油(國(guó)藥集團(tuán)：69018028)、他莫昔芬(Sigma：T5648)、玉米油(Sigma：C8267)、鼠尾直接PCR試劑盒(成都福際：TP-01331)、OCT包埋劑(Sakura：4583)、免疫熒光封閉液(碧云天：P0260)、免疫染色一抗/二抗稀釋液(碧云天：P0262/P0265)、Hoechst33342(Thermo：H3570)、兔源性RFP抗體(Abcam：ab62341)、小鼠源性eGFP抗體(Abcam：ab6673)、驢抗兔熒光二抗(Invitrogen：A-21206)、驢抗小鼠熒光二抗(Invitrogen：A-21202)等。

1.2 示蹤小鼠的構(gòu)建與繁育 本實(shí)驗(yàn)所用遺傳示蹤小鼠的構(gòu)建策略如圖1所示。利用CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，構(gòu)建基于Acta2基因的Loxp-tdTomato-STOP-Loxp-eGFP基因敲入(Acta2-KI)小鼠，并與本實(shí)驗(yàn)室繁育的Cdh5-CreERT工具鼠雜交。選取Cdh5-CreERT+且Acta2-KI雜合或純合小鼠作為目標(biāo)示蹤C(jī)dh5-CreERT/Acta2-KI小鼠進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。實(shí)驗(yàn)用小鼠均在SPF級(jí)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室內(nèi)飼養(yǎng)[實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(軍)-2017-0021，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍)-2017-0044]，每天光照12 h，溫度20 ℃～25 ℃，濕度50%～60%。

1.3 小鼠基因組DNA提取與基因型鑒定 小鼠基因組DNA的提取按鼠尾直接PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。分別剪取子代小鼠尾尖約0.5 cm于離心管中，每管加入4 μL Foregene Protease Plus和100 μL Buffer MP，渦旋混勻。65 ℃金屬浴孵育30 min后，95 ℃孵育5 min。12000 r/min離心5 min，取上清至新的離心管中。

將提取的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增并鑒定其基因型，PCR引物見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)20 μL體系包括：基因組DNA模板2 μL，上、下游引物(10 nmol/L)各0.5 μL，2×Taq MasterMix(Dye)10 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸2 min。取10 μL PCR終產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖核酸凝膠電泳。后置于凝膠電泳儀中成像并分析。

表1 PCR擴(kuò)增引物Table 1 PCR amplification primer

1.4 他莫昔芬誘導(dǎo)方案與肝纖維化模型建立 經(jīng)PCR基因型鑒定，得到Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，待小鼠6～8周齡時(shí)，開(kāi)始他莫昔芬誘導(dǎo)。用玉米油配制他莫昔芬終濃度為20 μg/μL，按100 μL/只劑量，腹腔注射連續(xù)5 d(1次/d)，共5次，誘導(dǎo)Cre重組酶激活。再靜置1周后，用橄欖油配制15%CCl4，按4 μL/g體質(zhì)量劑量，腹腔注射連續(xù)6周(2次/周)，共12次，誘導(dǎo)小鼠形成肝纖維化病變，完成后取材。

1.5 小鼠肝臟組織處理 腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉小鼠，20 mL生理鹽水灌注左心室，同時(shí)剪開(kāi)右心耳，剝離肝臟，剪取部分肝葉，4%多聚甲醛固定30 min，30%蔗糖PBS溶液4 ℃過(guò)夜脫水，次日以O(shè)CT包埋，-80 ℃凍存小鼠肝臟組織包埋塊，于冰凍切片機(jī)上切片，片厚8 μm。

1.6 小鼠原代LSEC分離與培養(yǎng) 參考本實(shí)驗(yàn)室既往研究[9]報(bào)道的實(shí)驗(yàn)方法分離小鼠原代LSEC。采用膠原酶兩步灌注法對(duì)小鼠肝臟進(jìn)行消化，組織處理器勻漿消化，篩網(wǎng)過(guò)濾，反復(fù)50×g低速離心去除細(xì)胞懸液中的肝細(xì)胞，獲得的細(xì)胞懸液用400×g離心7 min收集細(xì)胞沉淀，通過(guò)OptiPrep密度梯度離心獲取上層HSC，通過(guò)CD146免疫磁珠進(jìn)一步分選獲得LSEC。

將新鮮分離出的LSEC用ECM培養(yǎng)基(含胎牛血清、雙抗)重懸，接種于鋪好細(xì)胞爬片的24孔板中，37 ℃ 5%CO2培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)，4～5 h后倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞是否貼壁，對(duì)貼壁后的細(xì)胞換液，此后每2 d換液1次，7 d后鏡下觀察。待LSEC發(fā)生間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化后，用1×PBS緩沖液洗5 min，4%多聚甲醛固定15 min后染色觀察。

1.7 免疫熒光染色 小鼠肝臟組織冰凍切片上滴加免疫熒光染色封閉液，于濕盒內(nèi)室溫封閉1 h，將稀釋后的抗RFP和GFP一抗(稀釋比1∶200)滴加在組織上，濕盒4 ℃過(guò)夜；次日，用對(duì)應(yīng)稀釋后熒光二抗(稀釋比1∶300)室溫避光染色2 h，Hoechst33342染核10 min，50%緩沖甘油封片，4 ℃保存。原代LSEC細(xì)胞爬片的免疫熒光染色步驟，類同此法。用激光共聚焦顯微鏡分別觀察組織、細(xì)胞樣本中熒光蛋白tdTomato(紅色)和eGFP(綠色)的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 小鼠基因型鑒定結(jié)果 小鼠基因型檢測(cè)結(jié)果顯示：Cdh5-CreERT、Acta2-KI突變型、Acta2-KI野生型小鼠PCR分別擴(kuò)增出900 bp、1663 bp、301 bp的目的條帶，綜合三種瓊脂糖核酸凝膠電泳分析結(jié)果，即可鑒定小鼠基因型。2、4號(hào)(擴(kuò)增出900 bp、1663 bp、301 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI+/-雜合小鼠，5號(hào)(擴(kuò)增出900 bp、1663 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI+/+純合小鼠，3、7、8號(hào)(擴(kuò)增出900 bp、301 bp條帶)為Cdh5-CreERT+/Acta2-KI-野生型小鼠(圖2)。

注：(A)為 Cdh5-CreERT條帶；(B) 為Acta2-KI突變型條帶； (C) 為Acta2-KI野生型條帶。

2.2 體外轉(zhuǎn)分化模型中熒光示蹤 研究表明，體外培養(yǎng)的HSC會(huì)發(fā)生細(xì)胞形變，隨著培養(yǎng)天數(shù)增加逐步趨向肌纖維母細(xì)胞的特性。為從細(xì)胞水平闡明LSEC向肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞轉(zhuǎn)分化的能力，取健康7～9周齡未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)、誘導(dǎo)完成后的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，分離原代LSEC和HSC，在體外培養(yǎng)，用倒置顯微鏡觀察其培養(yǎng)不同天數(shù)后的形態(tài)變化。發(fā)現(xiàn)3 d時(shí)，部分LSEC已由最初的卵圓形變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，繼續(xù)延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，細(xì)胞體積變大，細(xì)胞邊緣向周圍伸展生成較多偽足，7 d時(shí)外形特征已近似肌纖維母細(xì)胞，提示LSEC在體外培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化。在體外培養(yǎng)7 d后，進(jìn)行免疫熒光染色，結(jié)果顯示(圖3)：(1)免疫染色陰性對(duì)照組，LSEC無(wú)顯著的紅色

圖3 體外培養(yǎng)7 d后LSEC和HSC的免疫熒光染色Figure 3 Immunofluorescent staining of LSEC and HSC after 7 d culture in vitro

圖4 CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型肝臟組織免疫熒光染色Figure 4 Immunofluorescent staining of liver tissue for CCl4 induced fibrotic model

熒光(tdTomato)和綠色熒光(eGFP)，HSC經(jīng)活化后產(chǎn)生較顯著的紅色熒光；(2)未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)組經(jīng)免疫染色后，LSEC和HSC均表達(dá)紅色熒光；(3)他莫昔芬誘導(dǎo)組經(jīng)免疫染色后，LSEC出現(xiàn)明顯的綠色熒光，說(shuō)明Cre/LoxP系統(tǒng)在他莫昔芬的誘導(dǎo)下產(chǎn)生了“基因剪切”效應(yīng)，表達(dá)出eGFP，即LSEC轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞樣細(xì)胞。

2.3 肝纖維化模型的熒光示蹤 為進(jìn)一步驗(yàn)證該遺傳示蹤小鼠的可靠性，分別選取7～9周齡未經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)和誘導(dǎo)完成后的Cdh5-CreERT/Acta2-KI小鼠，同時(shí)用CCl4造模6周，取肝臟組織制作冰凍切片，對(duì)LSEC進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果顯示(圖4)：未誘導(dǎo)組肝臟切片可見(jiàn)明顯的紅色熒光，但未出現(xiàn)綠色熒光；而經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)組除了紅色熒光，同時(shí)可見(jiàn)部分區(qū)域表達(dá)綠色熒光。這說(shuō)明在肝纖維化過(guò)程中，部分LSEC確實(shí)發(fā)生了內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化。

3 討論

幾乎各種慢性肝病的誘因均可引起肝纖維化。多種損傷因素刺激下，肝臟產(chǎn)生慢性炎癥并反復(fù)發(fā)作，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期的自我修復(fù)，最終限制正常的肝再生，增加肝功能衰竭的風(fēng)險(xiǎn)，逐漸形成難以恢復(fù)的肝硬化[10]。從細(xì)胞層面來(lái)看，肝纖維化過(guò)程中，除肝細(xì)胞變形、凋亡甚至壞死，各類炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)和炎癥因子的刺激外，肝內(nèi)多種被激活的非實(shí)質(zhì)細(xì)胞均有可能轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞，產(chǎn)生ECM并在肝臟中大量沉積[1,11]。及時(shí)逆轉(zhuǎn)早期形成的纖維化，是近幾十年來(lái)公認(rèn)的能夠有效阻止肝硬化發(fā)生的治療策略[12]。

以往研究普遍認(rèn)為活化的HSC是轉(zhuǎn)化為肌纖維母細(xì)胞的主要來(lái)源細(xì)胞。近年研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化廣泛存在于心[13]、腎[14]、肺[15]等器官的纖維化過(guò)程中。研究者[4-5]通過(guò)遺傳示蹤技術(shù)發(fā)現(xiàn)部分血管內(nèi)皮細(xì)胞在纖維化中可轉(zhuǎn)分化為肌纖維母細(xì)胞并參與器官的纖維化進(jìn)展。前期研究表明，無(wú)論在體內(nèi)外，LSEC均能夠發(fā)生內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化并分泌膠原且表達(dá)間質(zhì)樣標(biāo)志物(如α-SMA等)，證實(shí)了部分LSEC在纖維化條件下能夠獲得間質(zhì)樣特征[6]。但之前的研究仍缺乏較準(zhǔn)確的遺傳學(xué)示蹤證據(jù)。

本研究建立的Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤模型小鼠，利用內(nèi)皮特異性Cre/Loxp重組酶系統(tǒng)和CRISPR-Cas9基因編輯技術(shù)，實(shí)現(xiàn)了對(duì)內(nèi)皮間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化LSEC的特異性熒光標(biāo)記。經(jīng)他莫昔芬誘導(dǎo)，Cre重組酶被激活，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與Acta2基因的Loxp-tdTomato-STOP-Loxp位點(diǎn)結(jié)合，使由LSEC轉(zhuǎn)分化而來(lái)的肌纖維母細(xì)胞表達(dá)綠色熒光蛋白(eGFP)。而其他來(lái)源的肌纖維母細(xì)胞因不能激活內(nèi)皮特異性的Cdh5-CreERT發(fā)揮“剪切效應(yīng)”，故翻譯tdTomato后在STOP終止子處停止，因此僅表達(dá)紅色熒光蛋白(tdTomato)。綜上，可達(dá)到對(duì)LSEC來(lái)源肌纖維母細(xì)胞特異性示蹤的目的。

在此基礎(chǔ)上，本研究通過(guò)原代LSEC體外培養(yǎng)誘導(dǎo)間質(zhì)樣轉(zhuǎn)分化、小鼠CCl4誘導(dǎo)肝纖維化模型驗(yàn)證了Acta2-KI所插入熒光片段的可示蹤性，證實(shí)了Cdh5-CreERT/Acta2-KI遺傳示蹤小鼠的有效性、可靠性。進(jìn)一步闡明了肝纖維化過(guò)程中肌纖維母細(xì)胞的來(lái)源多樣性，這將為慢性肝損傷的病理機(jī)制研究和抗纖維化治療提供新的理論依據(jù)。

倫理學(xué)聲明：動(dòng)物實(shí)驗(yàn)操作符合空軍軍醫(yī)大學(xué)西京醫(yī)院倫理委員會(huì)標(biāo)準(zhǔn)，倫理審批時(shí)間:2018年3月6日，批號(hào)：KY20183238-1。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：許皓、阮柏完成實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析數(shù)據(jù)，撰寫文章；歷志文、房志強(qiáng)協(xié)助實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)收集分析；王琳、竇科峰指導(dǎo)研究思路，修改文章并定稿。