解毒化瘀通腑方對乙型肝炎肝硬化肝膽濕熱證患者腸道菌群的影響

劉江凱， 牛亞蒙， 李素領， 馬慶亮， 張建文， 張雅儒， 李冰倩

1 河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院 脾胃肝膽科， 鄭州 450000； 2 河南中醫(yī)藥大學第一臨床醫(yī)學院， 鄭州 450000

肝硬化是臨床常見的慢性、進行性、彌漫性的終末期肝病。HBV感染是導致肝硬化發(fā)生發(fā)展的主要原因。隨著“腸-肝軸”理論的提出，越來越多研究[1-2]顯示腸道菌群失調在肝硬化及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中具有重要的影響。前期研究[3]表明，解毒化瘀通腑方可改善酒精性肝硬化及肝衰竭患者肝功能，降低內毒素水平，其作用機制可能與影響TLR4/NF-κB通路炎性級聯(lián)信號的傳導，抑制NF-κB的激活，減少炎性遞質及細胞因子的釋放有關。肝硬化及肝衰竭時腸道菌群紊亂和疾病的進展關系密切，解毒化瘀通腑方能否改善乙型肝炎肝硬化患者腸道微生態(tài)失衡？其對肝臟的保護作用是否與調整腸道微生態(tài)有關尚缺乏進一步研究。故本研究將通過觀察解毒化瘀通腑方對乙型肝炎肝硬化肝膽濕熱證患者腸道菌群的調節(jié)作用和對內毒素、炎性因子水平、細胞免疫功能的影響，為中醫(yī)藥防治肝硬化腸道菌群紊亂和臨床治療腸道微生態(tài)失衡提供更多依據(jù)和方法。

1 資料與方法

1.1 研究對象 納入2019年6月至2021年1月在河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院接受治療，符合納入及排除標準的門診及住院患者72例，其中觀察組2例未按療程治療剔除，2例中途退出，完成32例； 對照組2例中途退出，1例未按療程治療，完成33例；總脫落率為9.7%。所納入患者診斷符合中華醫(yī)學會《慢性乙型肝炎防治指南(2019年版)》[4]關于乙型肝炎肝硬化的診斷標準；符合中華中醫(yī)藥學會肝膽病分會制訂的《病毒性肝炎中醫(yī)辨證標準》(2017年版)[5]關于肝膽濕熱證的證候診斷標準。納入標準：(1)年齡18～70歲；(2)肝功能分級Child-Pugh A/B級。排除標準：(1)2周內服用過任何種類益生菌制劑及免疫調節(jié)劑者；(2)合并全身或局部感染、合并大量腹水、合并肝性腦病、消化道出血等嚴重并發(fā)癥者；(3)合并其他引起肝硬化的因素如HCV、飲酒或藥物等；(4)合并腫瘤，嚴重心、腦、腎、造血系統(tǒng)疾病，內分泌、風濕和精神病患者；(5)孕婦和哺乳期婦女。

1.2 治療方法 觀察組：根據(jù)病情在抗病毒、保肝降酶及對癥治療基礎上，給予解毒化瘀通腑顆粒劑口服：茵陳30 g、黃芩15 g、赤芍30 g、金錢草30 g、郁金15 g、大黃10 g。上述顆粒劑由本院藥房(四川新綠色)統(tǒng)一提供，1副/d，上午及下午分2次溫開水沖服。連續(xù)服用5 d，休息2 d。對照組：根據(jù)病情在抗病毒、保肝降酶及對癥治療基礎上，給予雙歧桿菌四聯(lián)活菌片(思連康)口服(杭州遠大生物制藥有限公司，國藥準字S20060010，規(guī)格：每片0.5 g)，3片/次，3次/d。治療時間為4周，觀察期間均規(guī)律飲食，保持相對穩(wěn)定的飲食結構。

1.3 觀察指標 治療前后，采用全自動生化檢測儀檢測肝功能(ALT、AST、TBil、Alb)；采用流式細胞儀檢測T淋巴細胞亞群(CD3+、CD4+、CD8+、CD4+/CD8+)；采集入組患者清晨空腹肘靜脈血4 mL，離心，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血清TNFα、IL-6、ET水平。

1.4 菌群檢測及分析 采集受試者治療前后晨起新鮮糞便樣本，置于-80 ℃超低溫冰箱內保存待測。采集完成的標本進行16S rDNA測序分析。包括糞便DNA提取、DNA質量檢測、文庫構建與質檢，采用MiSeq平臺2×250 bp的雙端測序策略對文庫進行測序，得到最終分析所使用的有效序列，進行相似度>97%的OTU聚類分析并計算其豐度?；贠TU聚類結果，進行Alpha和Beta多樣性分析得到不同樣本和分組之間的群落結構差異。利用Metastats軟件對組間的物種豐度數(shù)據(jù)進行t檢驗，對分組樣品的物種組成進行組間顯著性分析。

1.5 療效評價標準 參考《中藥新藥臨床研究指導原則(試行)》[6]中的中醫(yī)證候分級量化標準進行評分，臨床癥狀：脅肋脹痛、身目發(fā)黃、食少納呆、口干口苦、尿黃。按無、輕度、中度、重度分別記為0、2、4、6分。顯效：癥狀、體征明顯改善，證候積分減少≥70%；有效：癥狀、體征均有好轉，證候積分減少≥30%；無效：癥狀、體征均無明顯改善，甚或加重，證候積分減少不足30%。積分變化公式(尼莫地平法)：[(治療前癥狀總積分-治療后癥狀總積分)/治療前癥狀總積分]×100%。

2 結果

2.1 兩組患者一般資料及中醫(yī)癥狀療效比較 觀察組中男21例，女11例；年齡29～67歲，平均(48.50±8.92)歲；肝功能Child-Pugh分級：A級18例、B級14例；對照組中男22例，女11例；年齡34～68歲，平均(52.24±9.20)歲；肝功能分級：A級20例、B級13例；兩組患者性別、年齡、肝功能分級比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)，具有可比性。

觀察組總有效率87.5%，對照組總有效率為60.6%，觀察組總有效率明顯高于對照組(χ2=-2.299，P=0.022)(表1)。

表1 兩組中醫(yī)癥狀療效比較Table 1 Comparison of curative effects of TCM symptoms between the two groups

2.2 兩組治療前后肝功能比較 兩組治療前ALT、AST、TBil、Alb比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)；與治療前相比，兩組治療后ALT、AST、TBil均有不同程度的降低(P值均<0.05)，Alb升高(P<0.05)；與對照組相比，觀察組治療后TBil水平下降更加顯著(P=0.030)(表2)。

2.3 兩組治療前后T淋巴細胞亞群水平比較 兩組治療前CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+/CD8+比較差異均無統(tǒng)計學意義(P值均>0.05)；與治療前相比，兩組CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+均有不同程度的升高(P值均<0.05)，觀察組CD8+T淋巴細胞顯著降低(P<0.05)；與對照組相比，觀察組治療后CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+升高更明顯(P值均<0.05)(表3)。

2.4 兩組治療前后炎癥指標比較 兩組治療前IL-6、TNFα、ET比較均無統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)；與治療前相比，兩組治療后IL-6、TNFα、ET均有不同程度的下降(P值均<0.05)；與對照組相比，觀察組IL-6、TNFα、ET下降水平更明顯(P值均<0.05)(表4)。

2.5 兩組治療前后腸道菌群分析

2.5.1 OUT結果分析 對獲得的樣本進行測序分析，共獲得6 145 843個原始數(shù)據(jù)，然后對雙端測序數(shù)據(jù)進行拼接、質控過濾及去除嵌合體后得到443 0889條有效序列,平均每個樣品73 848條，Tag平均長度為418 bp。使用usearch軟件對有效序列進行聚類(軟件默認序列相似性高于97%的劃分為一個OTU)，共有的OTU為363個。觀察組和對照組治療前OTU個數(shù)分別為372和369個，治療后分別為394和371個，兩組治療后OTU數(shù)量均較前上升(圖1)。

注：ZYQ為觀察組治療前；ZYH為觀察組治療后；XYQ為對照組 治療前；XYH為對照組治療后。圖1 組間Venn圖Figure 1 Venn diagram between groups

2.5.2 兩組腸道菌群結構豐度分析

2.5.2.1 腸道菌群在門水平上的分析 在門(Phylum)水平上相對豐度前十的菌門有厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、梭菌門(Fusobacteria)、疣微菌門(Verrucomicrobia)、軟壁菌門(Tenericutes)、?-變形菌門(Epsilonbacteraeota)、藍細菌門(Cyanobacteria)和廣古菌門(Euryarchaeota)。其中厚壁菌門、擬桿菌門和變形菌門為三個優(yōu)勢菌門。與治療前相比，觀察組治療后厚壁菌門豐度上升和擬桿菌門下降顯著(Z值分別為-3.181、-2.215，P值分別為0.001、0.027)；與對照組相比，觀察組厚壁菌門、藍細菌門豐度升高顯著，擬桿菌門、梭菌門、?-變形菌門降低更明顯(Z值分別為-2.800、-2.177、-2.077、-2.509、-2.373，P值分別為0.005、0.029、0.047、0.012、0.018)(圖2a)。

表2 兩組肝功能比較Table 2 Comparison of liver function between the two groups

表3 兩組T淋巴細胞亞群水平比較Table 3 Comparison of T lymphocyte subsets between the two groups

表4 兩組治療前后炎癥指標比較Table 4 Comparison of inflammatory indexes between the two groups

2.5.2.2 腸道菌群在屬水平上的分析 在屬(Genus)水平上，擬桿菌屬(Bacteroides)、糞桿菌屬(Faecalibacterium)、普雷沃菌屬(Prevotella_9)、埃希菌-志賀菌屬(Escherichia-Shigella)、羅氏菌屬(Roseburia)、雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)、戴阿利斯特菌屬(Dialister)、乳桿菌屬(Lactobacillus)、鏈球菌屬(Streptococcus)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)為豐度排名前十的物種，其中擬桿菌屬、糞桿菌屬、普雷沃菌屬和鏈球菌屬治療后均較治療前有下降趨勢，雙歧桿圖菌屬、戴阿利斯特菌屬和乳桿菌屬較治療前有升高趨勢，其中觀察組雙歧桿菌屬治療后較治療前升高更顯著(Z=-2.045，P=0.041)(圖2b)。

2.5.3 Alpha多樣性分析 Alpha多樣性是指一個特定區(qū)域或者系統(tǒng)內的多樣性，反映的是單個樣品物種豐度及物種多樣性。Chao1和Ace指數(shù)用來計算菌群的豐度，值越大代表物種總數(shù)越多。Shannon和Simpson指數(shù)用來計算菌群的多樣性,相同物種豐度的情況下，Shannon指數(shù)值越大，Simpson指數(shù)值越小，樣品的物種多樣性越高。本研究顯示，與治療前相比，觀察組Chao1、Ace指數(shù)均明顯升高(t值分別為-4.263、-3.328，P值分別為0.001、0.005)，Shannon、Simpson指數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)；與對照組比較，觀察組治療后Ace指數(shù)上升更明顯(t=2.292，P=0.030)，余指數(shù)無明顯統(tǒng)計學差異(P值均>0.05)，故觀察組所含物種總數(shù)更多，但對腸道菌群多樣性方面沒有明顯影響(圖3)。

注：a，門水平上的差異； b，屬水平上的差異。ZYQ為觀察組治療前， ZYH為觀察組治療后，XYQ為對照組治療前，XYH為對照組治療后。圖2 腸道菌群結構豐度柱狀圖Figure 2 Structural abundance histogram of intestinal flora

2.5.4 Beta多樣性分析 使用Qiime軟件進行Beta多樣性分析，比較不同樣品在物種多樣性方面存在的相似程度。本研究中，基于Weighted Unifrac算法繪制PCoA和NMDS分析結果圖，坐標圖上樣品距離越近，則表示相似性越大。由圖可見，兩組治療后與治療前出現(xiàn)輕度分類聚集現(xiàn)象，但未達到顯著水平。Anosim分析結果表明，組間菌群差異無明顯統(tǒng)計學意義(P=0.743)，各組樣品物種構成相似(圖4)。

注：ZYQ為觀察組治療前；ZYH為觀察組治療后；XYQ為對照組治療前； XYH為對照組治療后。

3 討論

肝硬化是以肝組織纖維化和正常肝結構轉化為肝硬化結節(jié)為特征的慢性、進行性的終末期肝病。腸道菌群與肝臟主要通過腸-肝軸在解剖學和功能上密切聯(lián)系。肝硬化患者小腸細菌的過度生長和腸道通透性的增加，導致肝性腦病、自發(fā)性細菌性腹膜炎、門靜脈高壓癥、肝腎綜合征和多臟器衰竭等與細菌或內毒素移位相關的肝硬化腸源性并發(fā)癥的發(fā)生在臨床已有廣泛的報道[7]。肝硬化與腸道菌群失調相互影響，互為因果，往往形成惡性循環(huán)。故調節(jié)腸道菌群，維持腸道微生態(tài)平衡對防治肝硬化有重要的意義。目前常見的治療方法主要有微生態(tài)制劑的應用，如益生菌、益生元、合生元等,以及抗生素、糞菌移植等方法[8]。但均存在一定的局限性，臨床應用效果不甚滿意。

中醫(yī)學將乙型肝炎肝硬化歸為“脅痛”“積聚”“臌脹”等范疇，HBV屬濕熱疫毒之邪，作為肝硬化的重要病理因素，貫穿疾病發(fā)生發(fā)展的始終。本病病機變化往往沿著濕、熱、毒、瘀、虛的動態(tài)變化而不斷發(fā)展，病位多涉及肝膽、脾胃，機體因情志不遂或感受濕熱、疫毒之邪等導致肝臟失于疏泄、調達，脾胃運化功能失司，水濕停聚中焦而不得化，加之疫毒之邪助濕生熱，日久形成瘀滯之勢，臨床則表現(xiàn)出脅肋脹痛、口干口苦、腹脹、脘悶、納呆、困重等癥狀。濕熱之邪蘊于中焦，而“六腑以通為用”，需得“中結者使之旁達”，給濕熱瘀濁之邪以去路。故肝膽濕熱證作為該病發(fā)展的早期階段，治療上需“清熱解毒、化瘀通腑”。解毒化瘀通腑方由茵陳、黃芩、赤芍、金錢草、郁金、大黃組成，方中茵陳為苦寒下降，清利濕熱毒邪之君藥；黃芩清熱燥濕，助茵陳解毒退黃，金錢草清熱利膽，除濕退黃，與黃芩共為臣藥；郁金行氣活血、涼血逐瘀；赤芍清熱涼血祛瘀，助郁金祛濕退黃，郁金功專肝膽二經，能引諸藥直達病所，兼起使藥之功；佐以大黃泄熱除瘀，通利大便?？v觀全方，諸藥合用，共奏解毒化瘀通腑之功效。

注：a, PCoA分析圖; b, NMDS分析圖。ZYQ為觀察組治療前，ZYH為 觀察組治療后，XYQ為對照組治療前，XYH為對照組治療后。圖4 腸道菌群結構PCoA、NMDS分析圖Figure 4 Analysis of intestinal flora structure PCoA and NMDS

在肝硬化中，腸道微生物群的改變可能是誘導和維持腸道炎癥、腸屏障破壞和微生物物質向肝板層和鄰近器官移位的關鍵因素，從而加劇了肝硬化存在的肝臟和全身炎癥，這可能是疾病進展的一個關鍵因素[9]。IL-6、IL-8、TNFα等作為T淋巴細胞介導分泌的炎癥因子，能夠反映機體的免疫狀態(tài)，加重炎癥反應進程，損害肝細胞功能[10]。研究[11]發(fā)現(xiàn)，乙型肝炎肝硬化患者ALT、AST、ALP、TNFα、IL-6及IL-8水平與雙歧桿菌、乳酸菌等有益菌水平呈負相關，與腸桿菌科、腸球菌等條件致病菌水平呈正相關。本研究中，治療后兩組TBil、IL-6、TNFα、ET水平均較治療前改善，且觀察組優(yōu)于對照組。肝硬化相關的免疫功能障礙與細菌易位密切聯(lián)系。肝硬化時，與細菌易位相關的脾淋巴組織擴張、炎癥和脾臟隔離會導致T淋巴細胞數(shù)量減少[12]。此外，過度活化的T淋巴細胞和腸系膜淋巴結的炎癥又會促進細菌移位，最終發(fā)展為全身性炎癥綜合征[13]。McGovern等[14]研究發(fā)現(xiàn)，大多數(shù)肝硬化患者往往出現(xiàn)T淋巴細胞計數(shù)的下降，主要表現(xiàn)為CD4+T淋巴細胞缺乏癥。在本研究中，治療后兩組患者CD3+T、CD4+T、CD4+/CD8+淋巴細胞百分比均較治療前上升，且觀察組較對照組改善更顯著，表明解毒化瘀通腑方能改善肝硬化患者細胞免疫功能。

與健康人相比，肝硬化患者存在腸道菌群失調，表現(xiàn)為部分潛在致病菌的過度生長和有益菌的減少，增加感染風險[15]。肝硬化患者的OTU數(shù)量較健康人群顯著下降，腸道菌群豐度及多樣性隨肝硬化程度的加重而降低[16]。腸道菌群失調與肝硬化患者病死率的增加密切相關。Zeng等[17]研究發(fā)現(xiàn)，慢性乙型肝炎患者的厚壁菌門豐度低于健康組，擬桿菌門豐度高于健康組，且在肝硬化與肝癌組中亦有類似發(fā)現(xiàn)。研究表明[18-19]，厚壁菌門/擬桿菌門的比值被廣泛認為對維持正常的腸道內環(huán)境穩(wěn)定有重要影響，其比值的降低往往表現(xiàn)為炎癥性疾病。本研究中，觀察組治療后出現(xiàn)更顯著的厚壁菌門、藍細菌門比例的升高和擬桿菌門、梭菌門、ε-變形菌門比例的降低。IL-6、TNFα等促炎因子的含量與變形菌門的豐度呈正相關，與厚壁菌門等保護性細菌呈負相關[20]。同時經Alpha和Beta多樣性分析發(fā)現(xiàn)兩組治療后菌群豐度及多樣性有所改善，但兩組差異不明顯。有證據(jù)表明藍細菌與非酒精性肝病的死亡風險呈顯著正相關，但藍細菌門在肝硬化中研究較少，尚不明確其作用機制[21]。

綜上，在病因及基礎治療的基礎上聯(lián)合解毒化瘀通腑方治療能夠緩解乙型肝炎肝硬化肝膽濕熱證患者臨床癥狀，減輕肝損傷，改善細胞免疫功能。解毒化瘀通腑方可能通過增加厚壁菌門、乳桿菌屬、雙歧桿菌屬等有益菌的豐度和減少擬桿菌門、梭菌門等致病菌的豐度來改善患者腸道菌群失調，其對肝臟和免疫功能的進一步改善作用可能與調整腸道微生態(tài)有關。

倫理學聲明：本研究方案于2019年12月9日經河南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批號：2019HL-171，所有納入患者均簽署知情同意書。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護人以及與公開研究成果有關的利益沖突。

作者貢獻聲明：劉江凱對研究的思路或設計有關鍵貢獻；李素領、牛亞蒙參與病例資料收集；劉江凱、牛亞蒙、馬慶亮參與研究數(shù)據(jù)的獲取分析及解釋；張建文、張雅儒、李冰倩參與數(shù)據(jù)匯總及指標檢測。