重組真核表達載體pcDNA3.1(+)-ChIFN-α的構建及其與ND、IB二聯(lián)活疫苗聯(lián)用對雞免疫功能的影響

■陳亞偉 楊文艷 韓向新 宋艷紅 呂小虎 陳書明*

(1.山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院，山西 太谷 030801；2.山西省動物疫病預防控制中心，山西 太原 030027；3.山西省檢驗檢測中心（山西省標準計量技術研究院），山西 太原 030027)

新城疫（Newcastle disease，ND）和傳染性支氣管炎（Infectious bronchitis，IB）是最重要的禽類病毒性疾病之一，具有重大的全球經(jīng)濟影響[1-2]。盡管采用了廣泛的疫苗接種方法，由于抗原變異、母源抗體干擾、野毒株感染等往往會導致免疫失敗[3-5]，需要通過佐劑刺激免疫系統(tǒng)對疫苗產(chǎn)生更強烈的反應來增強疫苗效果，并且傳統(tǒng)疫苗佐劑往往會導致動物痛苦和不適，從而損害動物福利，故需要開發(fā)新的疫苗佐劑來解決這一問題。本研究通過構建重組真核表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α，用不同劑量pcDNA3.1（+）-ChIFN-α與雞ND、IB 二聯(lián)活疫苗（HB1 株+H120株）肌注免疫3 日齡海蘭褐雛雞（SPF），通過動物試驗，研究其與雞ND、IB二聯(lián)活疫苗聯(lián)用最佳肌肉注射劑量及其對雞免疫功能的影響，為將pcDNA3.1（+）-ChIFN-α開發(fā)為雞疫苗免疫佐劑奠定基礎。1994 年Sekellick等[6]首次克隆出雞IFN-α基因，開啟禽用干擾素研究的序幕；韓春來等[7]研究IFN-α重組蛋白中含有53.2%α螺旋、3.1%β折疊、10.6%轉(zhuǎn)角和33.1%無規(guī)則卷曲，首次證實ChIFN-α僅屬于全α型蛋白；程福亮等[8]研究結(jié)果表明重組ChIFN-α蛋白在雞胚內(nèi)能夠較好抑制或殺滅H9 亞型禽流感病毒、ND 病毒（ND virus，NDV）和IB 病毒（IB virus，IBV）；楊惠等[9]研究結(jié)果表明IFN-α-IL-18 融合蛋白能顯著抑制傳染性法氏囊病毒在雞胚中的復制；鄭華斌等[10]研究結(jié)果表明豬IFN-α作為佐劑可有效輔助口蹄疫DNA 疫苗改善動物體免疫應答；Kim 等[11]研制同時表達豬IFN-α和IFN-γ的重組腺病毒能增強豬細胞和小鼠抗病毒效果；Dai 等[12]研究表明重組ChIFN-α能夠阻斷水泡性口炎病毒在雞成纖維細胞中的感染；Zhou 等[13]用IFN-α和IFN-γ預處理鴨瘟病毒增強型綠色熒光蛋白感染鴨胚成纖維細胞后，病毒基因拷貝數(shù)和病毒效價顯著降低（P＜0.01）；Gao等[14]研究表明重組鴨IFN-α具有抗H5N1禽流感病毒的作用；Gan等[15]研究結(jié)果表明與單次注射疫苗相比，LPAIH9N2 滅活疫苗聯(lián)合注射重組雞IFN-α能顯著增強疫苗保護作用。人們對于ChIFN-α的抗病毒作用研究的比較多，對于其作為免疫佐劑與ND、IB 二聯(lián)活疫苗聯(lián)用的效果報道甚少，故本試驗旨在探討pcDNA3.1（+）-ChIFN-α是否能增強ND、IB 二聯(lián)活疫苗免疫效果，發(fā)揮免疫佐劑作用。通過本試驗，旨在解決pcDNA3.1(+)-ChIFN-α表達載體作為新型疫苗佐劑及其在生產(chǎn)中應用提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

1.1.1 材料SPF 公雛雞購自山西省太谷種雞場；pcDNA3.1（+）由山西農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學學院發(fā)酵實驗室保存[保藏號CICC81002]，pMD19-T Vector 購自TaKaRa 公司；Trans5αChemically Competent Cell 購自北京全式金生物技術有限公司；雞新城疫、傳染性支氣管炎二聯(lián)活疫苗（HB1 株+H120 株）購自青島寶依特生物制藥有限公司；雞腎型傳染性支氣管炎病毒（gray株）由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所提供；雞新城疫抗原（4HA50）由山西隆克爾生物制藥有限公司提供。

1.1.2 試劑

TaKaRa Taq 試劑盒、RNAiso Plus 試劑盒、Prime-Script RT Master Mix Perfect Real Time試劑盒、限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ和HindⅢ、TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver 3.0 均購自TaKaRa 公司；TIANgel Midi Purification Kit 購自天根生化科技（北京）有限公司；雞腎型傳染性支氣管炎（NIBV）抗體酶聯(lián)免疫分析試劑盒購自于上海麗臣生物科技有限公司。

1.2 構建pcDNA3.1（+）-ChIFN-α重組載體

1.2.1 引物的設計與合成

根據(jù)NCBI 雞IFN-αcDNA 基因序列（序列號為EU367971），用Primer Premier 5.0 設計一對引物，用于擴增ChIFN-α基因，其中F1 為上游引物并外加EcoRⅠ酶切位點；F2為下游引物并外加HindⅢ酶切位點。引物由北京六和華大基因股份有限公司合成。

F1：5’-CTGGAATTCATGGCTGTGCCTGC-3’（EcoRⅠ）

F2：5’-GGCAAGCTTCTAAGTGCGCGTGTT-3’（HindⅢ）

1.2.2 雞脾臟組織RNA提取及反轉(zhuǎn)錄

將3 日齡SPF 雛雞致死后迅速取出脾臟，立刻用DEPC 乙醇棉消毒過的剪刀將脾臟剪成20～70 mg 小塊，按TaKaRa 的RNAiso Plus（Total RNA 提取試劑）說明書提取RNA。使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成。

1.2.3ChIFN-α基因的擴增、克隆與序列測定

以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，以F1和F2為引物。采用以下體系和程序進行ChIFN-α基因的擴增：10×TaqBuffer 2 μL，dNTP 2 μL，F(xiàn)1和F2各1 μL，模板cDNA Taq 2 μL，DNA polymeras 0.5 μL，滅菌去離子水11.5 μL，置于PCR儀中進行擴增。94 ℃預變性5 min，94 ℃30 s，58.5 ℃30 s，72 ℃45 s進行32個循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳觀察分析，按照膠回收試劑盒說明書回收582 bp 處DNA條帶，純化后連pMD19-T Vector，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，挑單菌落接種到4 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，200 r/min、37 ℃過夜培養(yǎng)。將重組質(zhì)粒進行PCR和雙酶切鑒定，陽性質(zhì)粒命名為pMD19-TChIFN-α，送北京六和華大基因股份有限公司測序。

1.2.4 真核表達質(zhì)粒pcDNA3.1（+）-ChIFN-α的構建與鑒定

pMD19-T-ChIFN-α和pcDNA3.1（+）用EcoRⅠ，HindⅢ雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠回收后連接，再將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，抗性篩選；挑取單菌落進行PCR 鑒定及EcoRI，HindⅢ雙酶切鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pcDNA3.1（+）-ChIFN-α并送北京六和華大基因股份有限公司序列測定。

2 雞免疫指標的測定

2.1 動物分組、免疫及采樣

將1日齡SPF雛公雞240只，于實驗室飼養(yǎng)3 d后挑取180只健康雛雞隨機分為6組，每組30只。A組為生理鹽水對照組，B組為疫苗對照組，C組為疫苗+100 μg pcDNA3.1（+）對照組，D 組為疫苗+50 μg pcDNA3.1（+）-ChIFN-α試驗組，E組為疫苗+100 μg pcDNA3.1（+）-ChIFN-α試驗組，F(xiàn) 組為疫苗+200 μg pcDNA3.1（+）-ChIFN-α試驗組，試驗用雞均自由采食，自由飲水，籠養(yǎng)，雞舍通風良好，溫度、濕度等條件均按飼養(yǎng)規(guī)程控制。每天觀察記錄雞的生長發(fā)育情況及其他異常情況。4 日齡時，D、E、F 組分別注射pcDNA3.1（+）-ChIFN-α50、100、200 μg/只，C 組注射pcDNA3.1（+）100 μg/只，A、B組注射生理鹽水300 μL/只，7日齡除A組外，其他各組均滴鼻、點眼免疫雞ND、IB二聯(lián)活疫苗。

于14、21、28、35、42、49日齡時，每組隨機選取5只雞進行試驗。首先稱體重；然后進行心臟采血，一部分血液放入真空抗凝采血管中（含枸櫞酸），用于進行外周血液中活性T/B 淋巴細胞百分率測定；另一部分放入真空采血管（不含抗凝劑），取析出的血清進行血凝抑制（HI）試驗、雞NIBV抗體的檢測試驗。在雞49日齡時進行強毒NIBV攻毒試驗。

2.2 雞陽性T、B淋巴細胞百分率的測定

用酸性α-醋酸萘酯酶染色法和甲基綠-派洛寧染色法[16-17]測定雞外周血中陽性T、B淋巴細胞百分率。

2.3 雞ND抗體的測定——血凝抑制試驗

按照ND診斷技術國標進行試驗[18]。

2.4 雞NIBV抗體的檢測

按照雞NIBV抗體（K-IBV）酶聯(lián)免疫分析試劑盒的說明書進行雞NIBV抗體的測定。

2.5 IBV感染雞后病理學剖檢觀察及攻毒保護率測定

試驗用雞在49日齡時進行攻毒，半數(shù)致死量強毒株（IBV-Grag強毒株）300 μL注射到雞氣管內(nèi)，54日齡后全部剖殺。攻毒后觀察試驗用雞發(fā)病情況，統(tǒng)計死亡雞數(shù)量，計算免疫保護率并對感染IBV的雞進行剖檢。

免疫保護率（%）=試驗結(jié)束時存活雞只數(shù)/試驗雞只數(shù)×100

2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與處理

用SPSS 22.0軟件對試驗數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，Duncan’s 多重比較及獨立樣品t檢驗，GraphPad Prism 7.0作圖。P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著，P＞0.05表示差異不顯著。

3 結(jié)果與分析

3.1 ChIFN-α基因擴增及序列測定

ChIFN-α基因RT-PCR 擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳圖譜如圖1所示，由圖1可見擴增出的ChIFNα基因片段大小符合實際預期。將擴增出的ChIFN-α連接到pMD19-T 上，經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切鑒定為陽性菌落并測序，將測序結(jié)果與NCBI（登錄號EU367971）進行比對，同源性為100%。由此可見，ChIFN-α擴增成功。

圖1 ChIFN-α的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖譜

3.2 重組真核表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α的構建與鑒定

制備的pcDNA3.1（+）-ChIFN-α經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切后的電泳結(jié)果如圖2所示，表明獲得的目的片段與預期一致，證明ChIFN-α已連接到pcDNA3.1（+）上，為進一步驗證ChIFN-α已成功連接到pcDNA3.1（+），再將pcDNA3.1（+）-ChIFN-α送到測序公司進行測序。

圖2 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α經(jīng)EcoR Ⅰ和Hind Ⅲ雙酶切電泳圖譜

3.3 重組真核表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞免疫指標的影響

3.3.1 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞外周血中陽性T、B淋巴細胞百分率的影響

由圖3 可見，14、21、28、35 日齡D、E、F 組外周血中陽性T 淋巴細胞百分率均顯著高于A、B、C 組（P＜0.05），E組外周血中陽性T淋巴細胞百分率均高于D、F 組，在21 日齡顯著（P＜0.05）；42 日齡E、F 組外周血中陽性T 淋巴細胞百分率均顯著高于A、C、D 組（P＜0.05），B組與其他組差異不顯著，表明pcDNA3.1（+）-ChIFN-α與雞ND、IB 二聯(lián)活疫苗聯(lián)用可顯著增加雞外周血中陽性T淋巴細胞百分率。

圖3 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞外周血中陽性T淋巴細胞百分率的影響

由圖4 可見，在14、21、28、35 日齡D、E、F 組外周血中陽性B淋巴細胞數(shù)量高于A、B、C組，E組外周血中陽性B 淋巴細胞數(shù)量高于D、F 組，但差異不顯著。表明pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞外周血中陽性B 淋巴細胞具有一定促進作用。

圖4 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞外周血液中陽性B淋巴細胞百分率的影響

上述結(jié)果表明，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α與雞ND、IB 二聯(lián)活疫苗聯(lián)用能提高雞外周血中陽性T、B 淋巴細胞百分率。

3.3.2 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對ND-HI 抗體效價的影響

由圖5可見，C、D、E組ND-HI抗體效價呈現(xiàn)先降低、再升高、再降低的趨勢，B、F 組為先升后降，其中在28日齡ND-HI抗體效價最高，28日齡后下降；A組為先升后降，但其在35日齡時ND-HI抗體效價最高；在35日齡A組的抗體顯著低于其他組（P＜0.05）；由此可見，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能增強NDV 疫苗所誘導的ND-HI 抗體效價，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對NDV疫苗具有佐劑的作用。

圖5 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對ND-HI抗體效價的影響

3.3.3 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對IBV抗體濃度的影響由圖6 可見，D、E、F 組IBV 抗體濃度顯著（P＜0.05）高于A、B、C組，其中E組IBV抗體濃度顯著高于D、F 組（P＜0.05）。上述結(jié)果表明，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能顯著提高雞體內(nèi)IBV抗體水平，且100 μg劑量組效果最佳。

圖6 pcDNA3.1(+)-ChIFN-α對雞IBV抗體濃度的影響

3.3.4 pcDNA3.1（+）-ChIFN-α對雞免疫保護率的影響攻毒后，A 組第2 d 開始發(fā)病，病雞精神狀態(tài)不佳，采食量和飲水量明顯減少，怕冷縮成一團，低頭、羽毛凌亂、排白色稀糞；第4 d 開始有雞死亡，試驗結(jié)束時各組10只雞中，A組發(fā)病數(shù)為10只，死亡數(shù)為4只，存活數(shù)為6只；B、C組發(fā)病數(shù)為1只，死亡數(shù)為1只，存活數(shù)為9 只；D 組發(fā)病數(shù)為1 只，存活數(shù)為10 只；E、F 組的10 只雞均無發(fā)病、死亡情況，B、C 組雞免疫保護率均為90%；D 組有10%雞發(fā)病，免疫保護率為100%；E 組和F 組沒有發(fā)病雞，免疫保護率為100%。由此可見，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α可以提高雞的免疫保護率10%，且100 μg劑量組的效果更佳。

4 討論

細胞因子是天然免疫反應和獲得性免疫反應的天然介質(zhì)，在控制免疫反應中起著至關重要的作用[15]。ChIFN-α可通過由干擾素-α受體和干擾素-β受體亞基組成的共享異源二聚體受體發(fā)出信號，ChIFN-α與高親和力的干擾素-β受體結(jié)合，然后招募低親和力的干擾素-α受體，形成具有信號功能的三元復合物；一旦形成三元復合物，下游信號通過JAK-STAT 通路啟動，激活由磷酸化的STAT1和STAT2以及干擾素調(diào)節(jié)因子9 組成的異源三聚體轉(zhuǎn)錄因子復合物ISGF3，激活的ISGF3移位到細胞核，并與ISGs上游啟動子區(qū)的IFN 刺激的反應元件結(jié)合，這些元件編碼通過各種機制發(fā)揮作用的蛋白質(zhì)，以限制病毒感染[19]。

14、21、28、35日齡D、E、F組外周血中陽性T淋巴細胞百分率均顯著高于A、B、C組，E組外周血中陽性T淋巴細胞百分率均高于D、F組，在21日齡顯著；42日齡E、F組外周血中陽性T淋巴細胞百分率均顯著高于A、C、D組，B組與其他組差異不顯著。在14、21、28、35日齡，D、E、F組外周血中陽性B淋巴細胞數(shù)量高于A、B、C組，E組外周血中陽性B淋巴細胞數(shù)量高于D、F組，但差異不顯著。研究表明外源性ChIFN-α可誘導內(nèi)源性ChIFN-α和ChIFN-βmRNA表達顯著上調(diào)[20]，且體內(nèi)注射IFN-α可增強抗體和T 細胞對可溶性蛋白的反應[21]；I型IFN可促進樹突狀細胞（Dendritic cell，DC）上調(diào)MHC和共刺激分子表達，并獲得增強T細胞刺激能力[22]；并誘導DC產(chǎn)生B細胞刺激因子，包括TNF家族的B細胞激活因子和增殖誘導配體，相關研究表明IFN-α還可通過激活STAT3直接刺激B細胞分化和活化[23]，這與本試驗中重組表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能提高雞外周血中陽性T、B淋巴細胞百分率一致。

本試驗采用肌注pcDNA3.1（+）-ChIFN-α免疫雛雞，試驗結(jié)果表明肌注pcDNA3.1（+）-ChIFN-α雛雞組NDV 和IBV 疫苗所誘導的抗體水平均有明顯增高趨勢，表明pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能夠提高NDV 和IBV疫苗所誘導抗體水平，對雞特異性體液免疫功能有促進作用；驗證pcDNA3.1（+）-ChIFN-α具有免疫佐劑的功能，與現(xiàn)有佐劑相比，在接種疫苗時使用重組雞細胞因子作為佐劑既能促進更好地保護又不會引起雞任何不良反應或痛苦[24]。

Jang等[25]研究表明Ⅰ型和Ⅲ型IFN可以促進小鼠的獲得性免疫反應，提高疫苗誘導的對病毒感染的抵抗力，但是相關研究表明與疫苗抗原同時注射的ChIFN-γ并不能增強NDV 疫苗的免疫原性[26]。攻毒試驗結(jié)果表明，與生理鹽水對照組相比較，免疫組和佐劑組個別雞出現(xiàn)輕微臨床癥狀，表明pcDNA3.1（+）-ChIFN-α聯(lián)合雞ND、IB二聯(lián)活疫苗接種雞可提高疫苗免疫保護率，綜上所述，肌注重組真核表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能顯著提高雞的免疫力，發(fā)揮免疫佐劑作用，最佳注射劑量為100 μg/只，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α與ND、IB二聯(lián)活疫苗聯(lián)合使用能增強疫苗免疫效果，通過聯(lián)合接種rChIFN-α來增強商業(yè)上可獲得的ND、IB二聯(lián)活疫苗誘導的免疫應答的調(diào)節(jié)，可以保護免疫雞免受高劑量同源病毒的攻擊。這些結(jié)果表明，自然產(chǎn)生的免疫調(diào)節(jié)細胞因子可以與商業(yè)上可獲得的滅活疫苗相結(jié)合，在雞身上產(chǎn)生有效的免疫策略。在未來的研究中，評估這種免疫策略對目前流行的異源病毒株的攻擊的保護效果具有深遠意義。

5 結(jié)論

本試驗成功構建重組真核表達載體pcDNA3.1（+）-ChIFN-α。動物試驗結(jié)果表明，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α能發(fā)揮免疫佐劑作用，增強雞疫苗的免疫效果，提高雞的免疫保護率，pcDNA3.1（+）-ChIFN-α最佳劑量為100 μg /只雞。