miR-1915-3p和Bcl-2在結(jié)腸癌組織中的表達及其臨床意義

姚曉慧

遼寧省朝陽市第二醫(yī)院病理科，遼寧朝陽 122000

近年來學(xué)者發(fā)現(xiàn)，微小RNA（miRNA）異常表達可能和多種惡性腫瘤的發(fā)生、 發(fā)展以及預(yù)后密切相關(guān)[1-3]。其屬于一類長度為21～25 個核苷酸的單鏈非編碼RNA，對多種促癌基因和（或）抑癌基因的表達起到調(diào)控作用，繼而于細(xì)胞分化、增殖、凋亡、侵襲以及轉(zhuǎn)移等過程中起著至關(guān)重要的作用[4]。miR-1915-3p屬于miRNA 家族重要成員之一，在多種腫瘤中均存在異常低表達，但關(guān)于其和結(jié)腸癌的相關(guān)研究并不多見[5]。Bcl 是目前臨床上研究較為廣泛的一種凋亡相關(guān)性基因，可有效抑制細(xì)胞中程序性細(xì)胞凋亡，繼而誘發(fā)惡性腫瘤，可作為一種腫瘤分子標(biāo)志物[6]。鑒于此，本研究通過探討miR-1915-3p 及Bcl-2 在結(jié)腸癌組織中的表達及作用意義，旨在為結(jié)腸癌的診治以及預(yù)后評估提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2013年2月至2016年2月遼寧省朝陽市第二醫(yī)院收治的85 例結(jié)腸癌患者作為研究對象。采集所有患者癌組織及癌旁正常組織。其中男46 例，女39 例；年齡34～79 歲，平均（57.31±10.26）歲；腫瘤部位：左半結(jié)腸37 例，右半結(jié)腸48 例；腫瘤直徑2.0～7.8 cm，平均（5.32±1.26）cm；TNM 分期：Ⅰ～Ⅱ期41例，Ⅲ～Ⅳ期44 例；分化程度：低分化34 例，中高分化51例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移36 例。納入標(biāo)準(zhǔn)[7]：①所有患者均經(jīng)病理檢查確診；②入院前尚未接受相關(guān)抗腫瘤治療；③均為成年人；④臨床病歷資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①伴有其他惡性腫瘤者；②意識障礙或伴有精神疾病者；③因故無法完成相關(guān)研究/檢查者。所有患者及其家屬均知情同意；本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審核批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 RT-qPCR 儀（購自德國Roche Diagnostics GmbH 公 司），Nanodrop 2000分光光度計（購自上海土森視覺科技有限公司）。石蠟包埋組織miRNA 提取試劑盒選用上海聯(lián)邁生物工程有限公司相關(guān)產(chǎn)品；TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒以及RTqPCR 試劑盒均選用美國Thermo Fisher Scientific 公司相關(guān)產(chǎn)品；相關(guān)引物均由上海生工生物工程股份有限公司提供。

1.2.2 檢測方式 分別制備厚度為4 μm 的結(jié)腸癌以及癌旁正常組織切片，根據(jù)miRNA 提取試劑盒說明書完成總RNA 的提取。以Nanodrop 2000 分光光度計完成RNA 樣品260 nm 處吸光度值以及280 nm 處吸光度值，以兩者比值1.8～2.1 為宜。取1 μg 的總RNA記作模板，采用TaqMan MicroRNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒獲取cDNA。再取2 μl 的cNDA 作為模板實施RTqPCR 檢測，檢測miR-1915-3p 時，將U6 作為內(nèi)參；檢測Bcl-2 時，將GAPDH 作為內(nèi)參。引物序列如下：miR-1915-3p 正向引物5′-CAGACGACCATCAGCCCCAGGGCGA-3′，反向引物5′-CGCGGATCCATGTCTATTATTACAG-3′。U6 正向引物5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，反向引物5′-CGTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。Bcl 正向引物5′-AGTGGGATGCGGGAGATGT-3′，反向引物5′-CGGGCTGGGAGGAGAAGA-3′。GAPDH 正向引物5′-CATTCAAGACCGGACAGAGG-3′，反向引物5′-ACATACTCAGCACCAGCATCACC-3′。反應(yīng)條件如下：95℃預(yù)變性10 min；95℃10 s；60℃1 min；72℃30 s；共40 個循環(huán)。以2-△△Ct法計算目的基因mRNA 相對表達量。

1.3 觀察指標(biāo)

比較不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA表達，分析結(jié)腸癌患者臨床病理特征（包括年齡、性別、腫瘤部位、腫瘤直徑、TNM 分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）和miR-1915-3p mRNA 表達水平的關(guān)系。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 22.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t 檢驗；計數(shù)資料用率表示，組間比較采用χ2檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

結(jié)腸癌組織中miR-1915-3p mRNA 表達水平低于癌旁正常組織，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

表1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

表1 不同組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

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2.2 不同病理特征結(jié)腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

TNM 分期Ⅲ～Ⅳ期、低分化程度及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于Ⅰ～Ⅱ期、 中高分化程度及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，而Bcl-2mRNA 表達水平高于Ⅰ～Ⅱ期、中高分化程度及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表2）。

表2 不同病理特征結(jié)腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

表2 不同病理特征結(jié)腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較（±s）

項目 例數(shù) miR-1915-3p t 值 P 值 Bcl-2 t 值 P 值年齡（歲）＜60≥60性別0.480 0.632 0.113 0.910 45 40 0.861±0.219 0.840±0.213 7.233±1.585 7.194±1.592 0.709 0.480 0.288 0.774男女46 39 0.867±0.220 0.834±0.206 7.241±1.590 7.143±1.526腫瘤部位左半結(jié)腸右半結(jié)腸腫瘤直徑（cm）＜5≥5 TNM 分期Ⅰ～Ⅱ期Ⅲ～Ⅳ期分化程度低分化中高分化淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移0.848 0.399 0.253 0.801 37 48 0.877±0.224 0.837±0.209 7.254±1.603 7.166±1.578 0.991 0.324 1.135 0.260 32 53 0.883±0.228 0.835±0.209 7.141±1.501 7.543±1.629 3.735＜0.001 6.096＜0.001 41 44 0.938±0.279 0.751±0.174 6.120±1.456 8.245±1.734 4.264＜0.001 5.722＜0.001 34 51 0.723±0.166 0.935±0.256 8.348±1.759 6.367±1.422 5.041＜0.001 6.390＜0.001是否36 49 0.709±0.147 0.955±0.264 8.513±1.785 6.234±1.497

2.3 不同預(yù)后結(jié)腸癌患者的miR-1915-3p、Bcl-2 mRNA 表達水平的比較

對所有患者進行為期5年的隨訪，其中死亡42例，存活43 例，死亡患者的miR-1915-3p mRNA 表達水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于存活患者，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（表3）。

表3 結(jié)腸癌患者不同預(yù)后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平比較（±s）

表3 結(jié)腸癌患者不同預(yù)后的miR-1915-3p 及Bcl-2 mRNA 表達水平比較（±s）

預(yù)后 例數(shù) miR-1915-3p Bcl-2死亡存活t 值P 值42 43 0.741±0.202 0.954±0.236 4.466＜0.001 8.145±1.626 6.378±1.421 5.338＜0.001

3 討論

由于結(jié)腸癌往往發(fā)病具有極強的隱匿性，早期診斷率不高，絕大部分患者一經(jīng)確診便已處于進展期，甚至已發(fā)生淋巴結(jié)以及遠(yuǎn)處器官轉(zhuǎn)移，預(yù)后不良。因此，如何有效早期診斷結(jié)腸癌顯得尤為重要，亦是臨床關(guān)注的熱點。腸鏡檢查是國內(nèi)外公認(rèn)的診斷結(jié)腸癌金標(biāo)準(zhǔn)，但該檢查方式會對患者造成一定的創(chuàng)傷，臨床推廣普及存在局限性。隨著近年來相關(guān)研究的日益深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展可能涉及多基因的多階段、多步驟的復(fù)雜過程[8]。

本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織中miR-1915-3p mRNA 表達水平低于癌旁正常組織，而Bcl-2 mRNA表達水平高于癌旁正常組織（P＜0.05）。提示miR-1915-3p 在結(jié)腸癌組織中低表達，而Bcl-2 在結(jié)腸癌組織中高表達。考慮原因，miRNA 異常表達于結(jié)腸細(xì)胞分化、 增殖以及凋亡過程中起著至關(guān)重要的作用，而miR-1915-3p 是miRNA 家族重要成員之一，介導(dǎo)了生物體的氧化應(yīng)激、免疫細(xì)胞增殖及衰老以及干細(xì)胞自我更新等過程中，并通過對多種癌基因的表達進行調(diào)控，繼而促進了結(jié)腸癌的發(fā)生、發(fā)展[9-10]。Bcl-2 屬于癌基因家族成員之一，亦是一種凋亡基因，其表達的異常升高會導(dǎo)致機體內(nèi)抗凋亡因子以及促凋亡因子之間的平衡被打破，繼而引發(fā)結(jié)腸癌[11-12]。此外，TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期、 分化程度為低分化以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度為中高分化以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者；而Bcl-2 mRNA 表達水平高于TNM分期為Ⅰ～Ⅱ期、 分化程度為中高分化以及無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移結(jié)腸癌患者（P＜0.05）。有研究報道得以佐證[13]：結(jié)腸癌組織中miR-1915-3p 及Bcl-2 的表達和患者臨床分期、分化程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。究其原因，miR-1915-3p 可結(jié)合至Bcl-2 中3，-UTR 上 的1249～1255 位點，進一步對Bcl-2 的表達產(chǎn)生抑制，從而發(fā)揮抑癌作用。而當(dāng)miR-1915-3p 表達下降時，其對Bcl-2 表達的抑制作用隨之減弱，繼而促進了結(jié)腸癌患者病情的進展以及腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移。任宇鵬等人的研究報道表明[14]，Bcl-2 表達和結(jié)腸癌患者腫瘤大小有關(guān)，即腫瘤直徑＞5 cm 患者的Bcl-2 表達高于腫瘤直徑≤5 cm 患者。這和本研究結(jié)果存在一定的差異，導(dǎo)致上述差異的原因可能和檢測Bcl-2表達的方式不同有關(guān)。另外，對所有受試者均進行為期5年的隨訪，死亡患者42 例，存活患者43 例，其中結(jié)腸癌死亡患者miR-1915-3p mRNA 表達水平低于存活患者，而Bcl-2 mRNA 表達水平高于存活患者（P＜0.05）。這反映了隨著miR-1915-3p 表達水平的下降以及Bcl-2 表達水平的升高，結(jié)腸癌患者預(yù)后較差。分析原因，miR-1915-3p 的降低促使其抑制Bcl-2表達的作用下降，進一步導(dǎo)致抗凋亡以及抑制凋亡平衡被打破，最終抑制了結(jié)腸癌的凋亡，促進病情的進展，增加臨床治療難度，對預(yù)后產(chǎn)生不良影響[15]。然而，本研究亦存在一定的不足之處，如本研究在對結(jié)腸癌和miR-1915-3p 及Bcl-2 關(guān)系分析過程中僅比較了表達水平，未深入開展其他方面的研究，此舉可能導(dǎo)致研究結(jié)果發(fā)生輕微偏倚。因此，在今后的研究中可考慮進行影響因素或相關(guān)性等方面的分析，以獲取更為準(zhǔn)確、可靠的數(shù)據(jù)。

綜上所述，臨床實際工作中可能通過檢測miR-1915-3p 及Bcl-2 的表達水平，繼而輔助臨床診斷結(jié)腸癌，并對患者病情以及預(yù)后進行評估。