骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源外泌體通過PI3K/Akt途徑減輕過氧化氫誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷

葉莎 楊翠玲 鄭媛媛

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院老年心血管科，陜西 西安 710000)

心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷是心肌梗死以及心肌缺血再灌注等病理生理過程中心肌細(xì)胞損傷的重要機(jī)制，抗氧化也是目前受到廣泛認(rèn)可的心肌梗死防治靶點[1-2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)是來源于骨髓和脂肪等組織的多能干細(xì)胞，具有自我更新及多向分化的潛能，在組織工程技術(shù)中被用作種子細(xì)胞。在心肌梗死、腦梗死和腦外傷等疾病中，MSC能起到損傷修復(fù)作用，且這一作用與MSC來源的外泌體密切相關(guān)[3-5]。一項MSC相關(guān)的動物實驗[6]證實，MSC來源的外泌體在大鼠心肌組織缺血再灌注損傷過程中起保護(hù)作用，并且這一保護(hù)作用與激活PI3K/Akt途徑有關(guān)。但MSC來源外泌體是否直接減輕心肌細(xì)胞的損傷尚缺乏細(xì)胞水平的實驗證據(jù)。因此，本研究在過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)誘導(dǎo)心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型中分析骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cell，BMMSC)來源外泌體通過PI3K/Akt途徑的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 動物

成年雄性SD大鼠，體重180～200 g，8～10周齡，購自上海杰思捷實驗動物有限公司，許可證號：SCXK(滬)2018-0004。

1.2 細(xì)胞

心肌H9c2細(xì)胞購自ATCC公司(美國)。

1.3 試劑與儀器

外泌體快速提取試劑盒(武漢艾美捷科技公司)，H2O2和PI3K抑制劑LY294002購自Sigma公司(美國)，其中LY294002用二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解，儲存液濃度為10 mmol/L；細(xì)胞存活檢測試劑盒(MTS法)購自Promega公司(丹麥)，細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(TUNEL法)購自碧云天公司(中國)，Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-PI3K以及p-Akt的一抗購自Santa Cruz公司(美國)。細(xì)胞培養(yǎng)箱為Thermo公司(美國)，凝膠電泳及成像儀器均為天能公司(中國)。外泌體提取試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司。

1.4 BMMSC的培養(yǎng)及外泌體的提取

斷頭法處死SD大鼠，局部碘伏消毒后取出股骨和脛骨，剪斷兩端的骨骺端，顯露骨髓腔，用培養(yǎng)基反復(fù)沖洗骨髓腔，得到的沖洗液在離心機(jī)中于4 ℃、2 000 g離心5 min，保留沉淀用含10%胎牛血清的培養(yǎng)基重新懸浮，貼壁培養(yǎng)、定期換液及傳代培養(yǎng)，取第三代BMMSC，采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行干細(xì)胞特性鑒定，分別對干細(xì)胞標(biāo)志物CD29和CD105進(jìn)行檢測，陽性率均為99%以上。采用外泌體提取試劑盒提取第三代BMMSC內(nèi)的外泌體備用。

1.5 H9c2細(xì)胞培養(yǎng)及分組

H9c2細(xì)胞在含有10%胎牛血清的培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)，常規(guī)消化傳代后進(jìn)行分組。為驗證外泌體的保護(hù)作用，細(xì)胞被分為對照組、H2O2組和H2O2+外泌體組，參照陳睿等[7]的研究確定外泌體的濃度為2 μg/mL，分別用不含藥物的培養(yǎng)基、含有0.5 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基、含有0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌體的培養(yǎng)基進(jìn)行處理，作用24 h后收集細(xì)胞進(jìn)行檢測。為驗證PI3K/Akt通路在外泌體減輕心肌細(xì)胞損傷中的作用，細(xì)胞被分為溶劑對照組、溶劑對照+H2O2組、溶劑對照+H2O2+外泌體組和LY294002+H2O2+外泌體組，分別用含有0.1% DMSO的培養(yǎng)基、含有0.1% DMSO+0.5 mmol/L H2O2的培養(yǎng)基、含有0.1% DMSO+0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌體的培養(yǎng)基以及含有10 μmol/L LY294002+0.5 mmol/L H2O2+2 μg/mL外泌體的培養(yǎng)基進(jìn)行處理。

1.6 細(xì)胞存活率的檢測

采用MTS法檢測各組細(xì)胞的存活率，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作后在酶標(biāo)儀上設(shè)置波長為490 nm以及檢測吸光值A(chǔ)490，按照公式[(實驗孔A490-空白孔A490)/(對照孔A490-空白孔A490)×100%]計算細(xì)胞的存活率。

1.7 細(xì)胞凋亡率的檢測

采用TUNEL法檢測各組細(xì)胞的凋亡率，按照試劑盒說明書進(jìn)行操作后在顯微鏡下隨機(jī)觀察3個視野，對TUNEL陽性的細(xì)胞以及DAPI陽性的細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，按照(TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)/DAPI陽性細(xì)胞數(shù))×100%計算細(xì)胞凋亡率。

1.8 蛋白表達(dá)的檢測

采用蛋白裂解液提取各組細(xì)胞中的蛋白，采用免疫印跡檢測蛋白表達(dá)水平。首先在SDS-聚丙烯酰胺凝膠內(nèi)進(jìn)行電泳，分離不同分子量的蛋白后電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，而后孵育Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3、p-PI3K、p-Akt以及β-actin的一抗過夜(24 h)，次日孵育二抗1 h。最后在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)對蛋白表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

1.9 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)均為計量資料，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較采用單因素方差分析，有統(tǒng)計學(xué)差異的資料進(jìn)一步進(jìn)行LSD-t檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMMSC來源外泌體對H2O2刺激H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的影響

與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞的存活率明顯降低，凋亡率明顯增加(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞的存活率明顯增加，凋亡率明顯降低(P<0.05)(表1)。

表1 三組H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的比較

2.2 BMMSC來源外泌體對H2O2刺激H9c2細(xì)胞中凋亡基因表達(dá)的影響

與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯增加，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)(圖1)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；與H2O2組比較，#表示P<0.05。

2.3 BMMSC來源外泌體對H2O2刺激H9c2細(xì)胞中PI3K/Akt通路的影響

與對照組比較，H2O2組H9c2細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與H2O2組比較，H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)(圖2)。

注：與對照組比較，*表示P<0.05；與H2O2組比較，#表示P<0.05。

2.4 PI3K抑制劑對BMMSC來源外泌體調(diào)節(jié)H2O2刺激H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的影響

與溶劑對照組比較，溶劑對照+H2O2組H9c2細(xì)胞的存活率明顯降低，凋亡率明顯增加(P<0.05)；與溶劑對照+H2O2組比較，溶劑對照+H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞的存活率明顯增加，凋亡率明顯降低(P<0.05)；與溶劑對照+H2O2+外泌體組比較，LY294002+H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞的存活率明顯降低，凋亡率明顯增加(P<0.05)(見表2)。

表2 四組H9c2細(xì)胞存活率及凋亡率的比較

2.5 PI3K抑制劑對BMMSC來源外泌體調(diào)節(jié)H2O2刺激H9c2細(xì)胞凋亡基因表達(dá)水平的影響

與溶劑對照組比較，溶劑對照+H2O2組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；與溶劑對照+H2O2組比較，溶劑對照+H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯增加，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯降低(P<0.05)；與溶劑對照+H2O2+外泌體組比較，LY294002+H2O2+外泌體組H9c2細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)水平明顯降低，Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)(圖3)。建議增加檢測總Akt、PI3K及p-Akt和p-PI3K水平。

注：與溶劑對照組比較，*表示P<0.05；與溶劑對照+H2O2組比較，#表示P<0.05；與溶劑對照+H2O2+外泌體組比較，&表示P<0.05。

3 討論

近年，隨著組織工程技術(shù)的不斷發(fā)展，MSC在組織及細(xì)胞損傷中的修復(fù)及保護(hù)作用受到越來越多的關(guān)注。在心肌梗死的發(fā)病和治療過程中，雖然介入治療能使心肌獲得血流再灌注，但在獲得再灌注前部分心肌細(xì)胞已發(fā)生了不可逆損傷，另有部分心肌細(xì)胞在經(jīng)歷缺血再灌注后會出現(xiàn)損傷加重。氧化應(yīng)激是與心肌細(xì)胞缺血缺氧損傷和缺血再灌注損傷均密切相關(guān)的生物學(xué)環(huán)節(jié)，減輕心肌細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷成為了備受關(guān)注的心肌梗死治療靶點[8]。

MSC的組織及細(xì)胞保護(hù)作用與其釋放的外泌體密切相關(guān)[9]，心肌損傷相關(guān)的細(xì)胞實驗證實，MSC來源的外泌體對阿霉素誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[7]。肺上皮細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷相關(guān)的實驗證實，MSC來源的外泌體能減輕H2O2誘導(dǎo)的肺上皮細(xì)胞損傷[10]。在心肌細(xì)胞損傷和肺上皮細(xì)胞損傷中，MSC來源的外泌體均可促進(jìn)細(xì)胞存活，抑制細(xì)胞凋亡[9-10]。本研究將BMMSC來源的外泌體用于H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的干預(yù)。在H2O2誘導(dǎo)下，心肌H9c2細(xì)胞的存活率降低，凋亡率增加；BMMSC來源的外泌體干預(yù)后，細(xì)胞的存活率增加，凋亡率降低，表明BMMSC來源的外泌體在H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的過程中起保護(hù)作用，且這一保護(hù)作用與其抗凋亡效應(yīng)有關(guān)。

在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞損傷及凋亡的過程中，線粒體凋亡途徑的過度激活起關(guān)鍵作用。Bcl-2和Bax是一對調(diào)控線粒體途徑凋亡的分子，前者抑制線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放，后者促進(jìn)線粒體內(nèi)細(xì)胞色素C的釋放；從線粒體內(nèi)釋放進(jìn)入細(xì)胞漿的細(xì)胞色素C能啟動級聯(lián)放大反應(yīng)，最終通過增加cleaved caspase-3的表達(dá)引起細(xì)胞凋亡[11-12]。多項研究[13-14]已證實在梗死的心肌組織及缺血缺氧的心肌細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)降低，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)增加，本研究也證實H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷過程中上述凋亡分子的表達(dá)也發(fā)生了相同的變化。BMMSC來源的外泌體干預(yù)后，細(xì)胞中Bcl-2的表達(dá)增加，Bax和cleaved caspase-3的表達(dá)降低，表明BMMSC來源的外泌體在H2O2誘導(dǎo)心肌細(xì)胞損傷的過程中可發(fā)揮抑制線粒體途徑凋亡的功能，與其降低細(xì)胞凋亡率的結(jié)果吻合。

PI3K/Akt途徑是調(diào)控線粒體途徑凋亡的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑之一，該途徑的激活顯著抑制細(xì)胞凋亡[15-16]。在MSC來源的外泌體減輕心肌缺血再灌注損傷的過程中，其心肌組織的保護(hù)作用與激活PI3K/Akt通路有關(guān)[6，17]。本研究證實，在H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷過程中，PI3K/Akt途徑受到抑制，BMMSC來源的外泌體干預(yù)后細(xì)胞中p-PI3K和p-Akt的表達(dá)增加，PI3K/Akt途徑顯著激活，表明BMMSC來源的外泌體減輕H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的作用可能與激活PI3K/Akt途徑有關(guān)。為了進(jìn)一步闡明這一機(jī)制，本研究在外泌體干預(yù)的同時加用PI3K抑制劑LY294002，結(jié)果顯示該抑制劑可逆轉(zhuǎn)外泌體增加引起的一系列變化，導(dǎo)致細(xì)胞存活率及Bcl-2表達(dá)降低，細(xì)胞凋亡率以及Bax和cleaved caspase-3表達(dá)增加，表明BMMSC來源外泌體減輕H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷的作用部分與激活PI3K/Akt途徑有關(guān)。

綜上所述，BMMSC來源的外泌體能減輕H2O2誘導(dǎo)H9c2細(xì)胞損傷，外泌體的這一保護(hù)作用與激活PI3K/Akt途徑以及抑制線粒體途徑細(xì)胞凋亡有關(guān)。