二甲雙胍對心肌梗死后心臟功能的影響及其機制研究

周慧鑫 諶虎 劉志豪 周雨揚 李澤衍 許驍 陳華強 劉承哲 劉旨浩 王宇虹 王悅怡 賴燕秋 余鋰鐳 江洪

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院心血管內(nèi)科 武漢大學(xué)心臟自主神經(jīng)研究中心 武漢大學(xué)心血管病研究所 心血管病湖北省重點實驗室，湖北 武漢 430060)

心肌梗死(myocardial infarction，MI)是中國城鄉(xiāng)居民死亡的重要原因，并且其發(fā)病率不斷升高。據(jù)統(tǒng)計，中國急性MI發(fā)病率城市為50.12/10萬，農(nóng)村為43.51/10萬，急性MI死亡率城市為58.69/10萬，農(nóng)村為74.72/10萬[1]。MI發(fā)生后心肌細胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)釋放大量去甲腎上腺素，導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)過度激活[2]。既往研究[3]表明交感神經(jīng)系統(tǒng)與心血管疾病之間存在密切聯(lián)系，交感神經(jīng)過度激活會加重MI后心肌重構(gòu)，并惡化左心室舒張和收縮功能。

二甲雙胍是目前治療2型糖尿病最常用的藥物[4]。除了治療糖尿病，二甲雙胍還可改善神經(jīng)退行性疾病[5]，并且對高血壓、肺動脈高壓和缺血性心臟病等心血管疾病有著保護作用[6-8]。研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍不僅能降低驟然升高的去甲腎上腺素水平[6]，還可改善長時間高血壓所致的自主神經(jīng)功能障礙[9]。然而，二甲雙胍是否可通過調(diào)節(jié)心臟自主神經(jīng)改善MI后心臟功能尚不明確。因此本研究旨在探索二甲雙胍對MI后心臟功能的影響及其潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物準備

武漢大學(xué)人民醫(yī)院實驗動物中心提供28只健康成年雄性Sprague Dawley大鼠(180～230 g)，在無特定病原體環(huán)境下適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，給予標準飼料和飲水。本實驗所有動物使用過程均經(jīng)武漢大學(xué)動物實驗倫理委員會審核并批準。

1.2 動物模型制備和干預(yù)流程

Sprague Dawley大鼠隨機分成3組：假手術(shù)組(n=8)、MI+生理鹽水處理組(MI組，n=10)和MI+二甲雙胍處理組(MET組，n=10)。MI組和MET組均采用冠狀動脈左前降支(left anterior descending branch，LAD)結(jié)扎法制備MI模型。大鼠術(shù)前禁食禁飲12 h，采用3%戊巴比妥鈉(50 mg/kg)腹腔注射麻醉后固定于實驗臺，氣管插管，連接小動物呼吸機給予人工通氣。左前胸剃毛備皮，消毒后開胸，打開心包，暴露心臟，于左心耳下緣2 mm處用結(jié)扎線結(jié)扎LAD，制備MI模型。清理胸腔后逐層關(guān)閉胸腔，待大鼠恢復(fù)自主呼吸后拔管撤離呼吸機，保暖直至清醒。假手術(shù)組同樣開胸，LAD處穿線而不結(jié)扎，其余操作步驟同MI造模。術(shù)后MET組給予二甲雙胍[200 mg/(kg·d)]灌胃，假手術(shù)組和MI組大鼠給予等量生理鹽水灌胃，干預(yù)4周。

1.3 超聲心動圖采集

采用多普勒超聲心動儀對大鼠進行超聲心動圖檢查，檢測指標包括左室射血分數(shù)(LVEF)、左心室短軸縮短率(LVFS)、左心室收縮末期內(nèi)徑(LVESD)和左心室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)。

1.4 心電圖測量及心率變異性分析

根據(jù)團隊前期研究方法[10]，麻醉狀態(tài)下記錄大鼠體表心電圖，并使用Lab Chart 8.1軟件進行數(shù)據(jù)分析。分析計算各組心率變異性(heart rate variability，HRV)頻域指標，低頻功率(LF)、高頻功率(HF)和低頻/高頻功率比值(LF/HF)，為消除個體差異，LF、HF均經(jīng)過標準化并采用標準化單位(nu)表示。LF反映交感神經(jīng)的活性，而HF反映副交感神經(jīng)的活性。LF/HF反映自主神經(jīng)系統(tǒng)的平衡狀況。

1.5 血清和心肌標本檢測

實驗結(jié)束前，從大鼠腹主動脈收集動脈血，使用惰性分離膠促凝管促凝，血液離心(3 000 r/min，10 min)后取上清液于-80 ℃冷凍保存。根據(jù)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)的酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒說明書，檢測血清iNOS水平。實驗結(jié)束后，迅速取左心室心肌組織，使用磷酸鹽緩沖溶液反復(fù)沖洗，液氮速凍，于-80 ℃冷凍保存。根據(jù)丙二醛(malondialdehyde，MDA)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)的生化試劑盒說明書，檢測心肌MDA和SOD水平。

1.6 免疫組織化學(xué)染色

實驗結(jié)束后，從左心室梗死交界區(qū)收集心肌組織，于4%多聚甲醛固定液固定24 h以上，乙醇脫水和石蠟包埋后制作切片。行酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)免疫組織化學(xué)染色并拍取照片，使用Image Pro Plus 6.0軟件測量分析，測量并計算TH陽性區(qū)域的分布密度。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

造模過程中，假手術(shù)組、MI組、MET組分別死亡1、1、2只大鼠。造模1周內(nèi)，假手術(shù)組、MI組、MET組分別死亡1、3、2只大鼠。

2.1 二甲雙胍顯著改善MI大鼠的心功能

見表1可知，與假手術(shù)組相比，MI組大鼠LVEF[(43.19±3.59)% vs (84.65±3.12)%，P<0.05]和LVFS[(18.70±2.02)% vs (48.32±3.64)%，P<0.05]顯著降低，LVEDD[(0.83±0.09)cm vs (0.56±0.08)cm，P<0.05]和LVESD[(0.67±0.08)cm vs(0.29±0.04)cm，P<0.05]顯著增加。而與MI組相比，MET組大鼠LVEF[(59.22±6.50)% vs (43.19±3.59)%，P<0.05]和LVFS[(27.48±3.95)% vs (18.70±2.02)%，P<0.05]顯著升高，LVEDD[(0.65±0.08)cm vs (0.83±0.09)cm，P<0.05]和LVESD[(0.48±0.08)cm vs (0.67±0.08)cm，P<0.05]顯著減少。

表1 二甲雙胍對MI大鼠心臟超聲心動圖參數(shù)的影響

2.2 二甲雙胍對MI大鼠HRV的影響

見表2可知，與假手術(shù)組比較，MI組的LF/HF(0.33±0.02 vs 0.02±0.01，P<0.05)和LF[(20.35±0.68)nu vs (1.65±1.35)nu，P<0.05]均顯著升高，HF[(62.72±1.83)nu vs (93.73±2.96)nu，P<0.05]顯著降低；與MI組相比，MET組LF/HF(0.28±0.01 vs 0.33±0.02，P<0.05)和LF[(17.24±1.98)nu vs (20.35±0.68)nu，P=0.05] 均降低，HF可見回升趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 二甲雙胍對MI大鼠HRV的影響

2.3 二甲雙胍對MI大鼠心臟交感神經(jīng)重構(gòu)的影響

見圖1可知，與假手術(shù)組相比，MI組左心室梗死交界區(qū)心肌TH密度[(11 244±2 239)μm2/mm2vs (537.7±360.5)μm2/mm2，P<0.05]顯著增加，與MI組相比，MET組TH密度[(5 461±2 166)μm2/mm2vs (11 244±2 239)μm2/mm2，P<0.05]降低。

2.4 二甲雙胍對MI大鼠心臟氧化應(yīng)激的影響

見表3可知，與假手術(shù)組相比，MI組血清iNOS水平[(14.59±2.56)U/mL vs (7.15±0.82)U/mL，P<0.05]和心肌MDA水平[(16.87±1.43)nmol/mgprot vs (12.43±1.83)nmol/mgprot，P<0.05]明顯升高，心肌SOD水平[(262.30±7.39)U/mgprot vs (294.10±15.47) U/mgprot，P<0.05]明顯降低；與MI組相比，MET組血清iNOS水平[(9.26±1.14)U/mL vs (14.59±2.56) U/mL，P<0.05]和心肌MDA水平[(14.52±1.13) nmol/mgprot vs (16.87±1.43) nmol/mgprot，P<0.05]明顯降低，心肌SOD水平[(283.60±13.65) U/mgprot vs (262.30±7.39)U/mgprot，P<0.05]明顯升高。

注：**表示與假手術(shù)組相比，P<0.05；▲▲表示與MI組相比，P<0.05。

表3 二甲雙胍對MI大鼠心臟氧化應(yīng)激的影響

3 討論

二甲雙胍是治療2型糖尿病的經(jīng)典藥物，對心血管具有保護作用，可降低糖尿病和非糖尿病患者的心血管風(fēng)險[11]。隊列研究[12]顯示，急性MI后服用二甲雙胍不僅減少主要心血管不良事件的發(fā)生，還降低心血管疾病的死亡率和心力衰竭患者的再入院率。此外，二甲雙胍通過促進一磷酸腺苷活化蛋白激酶的磷酸化，改善缺血心肌的能量交換，抑制鉀通道的開放，提高心室電生理穩(wěn)定性，起到預(yù)防心室顫動的作用[8]。Li等[13]研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍通過改善心臟脂肪酸氧化，減少氧化應(yīng)激，從而改善慢性高血壓所致的左心室肥大和心功能障礙。二甲雙胍與自主神經(jīng)相關(guān)，不僅降低驟然升高的去甲腎上腺素水平[6]，還能改善高血壓相關(guān)的心臟自主神經(jīng)功能障礙[9]。本研究通過LAD結(jié)扎建立MI模型，給予二甲雙胍慢性干預(yù)，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可改善MI后的心臟功能。

自主神經(jīng)系統(tǒng)在心臟的生理和病理過程中起著至關(guān)重要的作用。目前研究[14-15]認為，交感神經(jīng)的過度激活是誘發(fā)并惡化MI后心力衰竭和惡性心律失常的重要機制。筆者團隊[10，16]前期研究發(fā)現(xiàn)，抑制心臟交感神經(jīng)節(jié)可有效抑制MI后惡性室性心律失常的發(fā)生和心肌重構(gòu)。HRV和兒茶酚胺的定量檢測等是判斷自主神經(jīng)活動的重要指標[17]。TH是腎上腺素合成過程的關(guān)鍵酶，分布在腎上腺素能神經(jīng)的胞質(zhì)中，其陽性水平可反映交感神經(jīng)的重構(gòu)程度[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍不僅能降低MI大鼠HRV中反映交感神經(jīng)系統(tǒng)激活的LF/HF，還減少了MI導(dǎo)致的TH密度增加，提示一定程度的交感神經(jīng)抑制作用。若實驗條件允許，進行24小時心電圖記錄并分析HRV，將得到更詳細和精確的結(jié)果。

氧化應(yīng)激是導(dǎo)致心肌缺血后心臟功能進一步惡化的重要原因，活性氧被認為是誘發(fā)氧化應(yīng)激的關(guān)鍵物質(zhì)。臨床和動物研究[19]表明，減少活性氧的產(chǎn)生可減少缺血所致心肌損傷。iNOS與氧化應(yīng)激水平密切相關(guān)，iNOS表達增加導(dǎo)致一氧化氮過量產(chǎn)生，一氧化氮迅速與超氧陰離子反應(yīng)生成過氧亞硝酸鹽，其可引起大分子廣泛氧化，導(dǎo)致大鼠心功能不全[20]。血清iNOS釋放增加常伴隨著MDA水平升高和SOD水平降低，提示抗氧化應(yīng)激物質(zhì)的耗竭[21]。并且在中樞交感神經(jīng)核團內(nèi)過表達iNOS后，可通過升高氧化應(yīng)激水平激活交感神經(jīng)[22]。同時，交感神經(jīng)激活引起的心肌收縮力增強和心率升高，會增加心肌耗氧和抗氧化物質(zhì)的耗竭，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激水平顯著升高，形成交感神經(jīng)激活和氧化應(yīng)激之間的惡性正反饋，加重心肌損傷。

本研究顯示，二甲雙胍的全身干預(yù)可能通過抑制交感神經(jīng)活性和降低iNOS表達水平而發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，從而改善MI后心臟功能。因此，補充二甲雙胍有望為MI患者的心肌保護治療提供新的思路。