慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓：構(gòu)建動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

胡美曦 黃志華 柳志紅 趙智慧 羅勤 趙青

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 國家心血管病中心 阜外醫(yī)院，北京100037)

慢性血栓栓塞性肺動(dòng)脈高壓(chronic thromboembolic pulmonary hypertension，CTEPH)是一種罕見的、危及生命的肺栓塞并發(fā)癥。CTEPH定義為機(jī)化的血栓長期阻塞肺動(dòng)脈導(dǎo)致血流重新分布和肺微血管床重構(gòu)的一種疾病，屬于肺動(dòng)脈高壓的第四大類別，重癥患者可導(dǎo)致右心衰竭和死亡[1]。CTEPH的診斷標(biāo)準(zhǔn)為：經(jīng)過3個(gè)月的規(guī)范抗凝治療后，影像學(xué)證實(shí)肺動(dòng)脈存在慢性血栓，且靜息狀態(tài)下右心導(dǎo)管檢查測定的肺動(dòng)脈平均壓≥25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 3 kPa)，肺動(dòng)脈楔壓≤15 mm Hg。傳統(tǒng)觀念普遍認(rèn)為，CTEPH是急性肺血栓栓塞癥的遠(yuǎn)期并發(fā)癥，即急性肺血栓栓塞癥的血栓未能及時(shí)完全溶解，反復(fù)發(fā)生血栓栓塞，血栓機(jī)化堵塞肺血管床，從而導(dǎo)致肺動(dòng)脈壓(pulmonary arterial pressure，PAP)升高。越來越多的研究表明，即使PAP未達(dá)到25 mm Hg的臨界值，仍會出現(xiàn)與CTEPH患者相似的癥狀，此部分患者可能患有慢性血栓栓塞性疾病[2-3]。事實(shí)上，栓塞后靜息時(shí)PAP>19 mm Hg與長期的死亡率增加相關(guān)[4-5]。CTEPH的特定影像學(xué)診斷標(biāo)志包括通氣/灌注掃描上不匹配的充盈缺陷和多探頭CT血管造影、磁共振成像或常規(guī)肺神經(jīng)血管造影顯示的環(huán)樣狹窄、網(wǎng)狀征、線狀征或慢性完全閉塞等。

有3%～4%的患者在急性肺栓塞后發(fā)生CTEPH，有10%的復(fù)發(fā)性肺栓塞患者發(fā)生CTEPH[2]。在CTEPH中，肺血管阻力最初由于較大的肺動(dòng)脈阻塞而增加，但通過肺微血管重構(gòu)進(jìn)一步升高[2，6]，除壓力的增加外，血流還被重新分布到肺血管系統(tǒng)的通暢部分，導(dǎo)致剪切應(yīng)力的局部改變。剪切應(yīng)力的改變聯(lián)合全身的危險(xiǎn)因素導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、炎癥、血管收縮和血管舒張受損等病理過程[7]。此外，這些過程促進(jìn)了阻塞和通暢的肺血管的結(jié)構(gòu)重構(gòu)。這種重構(gòu)導(dǎo)致肺血管阻力增加，進(jìn)而增加右心室的后負(fù)荷，從而導(dǎo)致右心室擴(kuò)張和右心室肥大[8]。

肺動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)可在一定程度上消除肺血管的阻塞，達(dá)到短期治愈。然而，一些無法到達(dá)的遠(yuǎn)端肺阻塞和/或相關(guān)的遠(yuǎn)端肺血管病變可誘發(fā)持續(xù)性肺動(dòng)脈高壓，這也是術(shù)后的主要并發(fā)癥。與此同時(shí)，無條件進(jìn)行肺動(dòng)脈內(nèi)膜切除術(shù)的患者可在有經(jīng)驗(yàn)的肺血管中心進(jìn)行肺動(dòng)脈球囊擴(kuò)張成形術(shù)。因此，提高對CTEPH的認(rèn)識可改善未來的醫(yī)療管理策略。目前，已有部分動(dòng)物模型為CTEPH的病理生理學(xué)和發(fā)病機(jī)制提供了參考。現(xiàn)回顧目前廣泛應(yīng)用的動(dòng)物模型(見表1)，以提高對CTEPH的理解，為后續(xù)相關(guān)基礎(chǔ)和臨床研究提供理論參考依據(jù)。

表1 各類動(dòng)物模型優(yōu)劣勢對比

1 嚙齒類動(dòng)物的CTEPH模型

由于經(jīng)濟(jì)及簡便，便于進(jìn)行大規(guī)模獨(dú)立實(shí)驗(yàn)操作，嚙齒類動(dòng)物的CTEPH模型仍是多項(xiàng)研究中應(yīng)用最多的。小體型動(dòng)物中，大鼠血壓和人接近，對急性缺血和低氧的耐受性強(qiáng)，易飼養(yǎng)，經(jīng)濟(jì)適用，取材容易，無須多人合作，便于進(jìn)行病理生理學(xué)機(jī)制及藥物治療的大規(guī)模樣本研究。小鼠具有完備的基因組和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫，便于今后基因和蛋白質(zhì)方面的研究，通過基因敲除小鼠可深入探討疾病的病因。還有研究[9]顯示，兔的纖溶系統(tǒng)與人類較接近，兔的肺組織結(jié)構(gòu)以及肺段分布和血管形態(tài)也與人類相似，且兔性情溫順，體積適中，利于做肺動(dòng)脈造影等影像學(xué)檢查，也是較理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。

1.1 大鼠的CTEPH模型

建立大鼠CTEPH模型常用的方法是自體血栓注射，如Wu等[10]在探究CTEPH大鼠模型的炎癥作用中采用的方法(圖1)：麻醉前1 d，使用玻璃毛細(xì)管從眼眶靜脈采血，置于無菌培養(yǎng)皿中過夜。在實(shí)驗(yàn)的第1天，用生理鹽水將過夜的血液凝塊從玻璃毛細(xì)管中沖出，然后在栓塞當(dāng)天修剪到約1.1 mm×3.0 mm大小的凝塊。用10%水合氯醛(通常0.3 mL/100 g)麻醉大鼠，在無菌條件下暴露左頸外靜脈，繼而將已制備的血凝塊以大約0.5 mL/min的速度注射到左頸靜脈，栓塞后，如果大鼠出現(xiàn)發(fā)紺以及呼吸加速，則停止注射。第一次栓塞后第4和11天，在相同條件下重復(fù)手術(shù)，腹腔注射氨甲環(huán)酸(200 mg/kg)抑制內(nèi)源性纖溶系統(tǒng)。最后一次栓塞3周后，對大鼠進(jìn)行血流動(dòng)力學(xué)分析(通常進(jìn)行右心導(dǎo)管檢查測量肺動(dòng)脈平均壓)。隨后立即用水合氯醛麻醉對大鼠實(shí)施安樂死。根據(jù)不同的研究目的，進(jìn)行相應(yīng)的取材，然后進(jìn)行后續(xù)的組織病理或相關(guān)分子分析(圖2)。

注:圖A為經(jīng)頸靜脈注射自體血栓,圖B為每日腹腔注射氨甲環(huán)酸200 mg/(kg·d),圖C為多次肺血栓栓塞癥誘導(dǎo)形成CTEPH模型。

然而，由于血栓栓塞模型中會出現(xiàn)自發(fā)血栓溶解而導(dǎo)致PAP增高不可持續(xù)或不一致，報(bào)告的CTEPH動(dòng)物模型具有廣泛的異質(zhì)性。因此最近的研究開始對CTEPH模型中的許多變量進(jìn)行修改和調(diào)整，包括栓塞材料(如葡聚糖微球、陶瓷微球和空氣)、栓塞操作的頻率(如連續(xù)/每日、每周和每兩周)，以及實(shí)驗(yàn)條件(通氣量和氧合水平等)[11-14]。最近，Karpov等[12]通過反復(fù)靜脈注射部分生物可降解的海藻酸鈉微球建立大鼠CTEPH模型，其特征是特異性肺血管重塑，運(yùn)動(dòng)耐量降低，右心室收縮壓持續(xù)升高，此模型有望用于相關(guān)藥物的臨床前測試。

關(guān)于小鼠的CTEPH模型，目前國內(nèi)外無詳細(xì)報(bào)道，可能是小鼠對栓塞的耐受性相對較差，實(shí)驗(yàn)操作難度較高，且小鼠PAP測定的相關(guān)操作難度較大，因此有關(guān)小鼠CTEPH 模型的建立與應(yīng)用進(jìn)展相對緩慢。

圖2 自體血栓經(jīng)頸靜脈注射法建立大鼠CTEPH動(dòng)物模型流程圖

1.2 兔的CTEPH模型

與兔CTEPH模型相關(guān)的國內(nèi)外研究較少，通常也是采用經(jīng)頸靜脈反復(fù)多次自體血栓栓塞的方法：對于麻醉后的家兔，常規(guī)頸部備皮和消毒，切開皮膚，暴露頸外靜脈，經(jīng)頸外靜脈插入中心靜脈導(dǎo)管，插入深度約3 cm，經(jīng)導(dǎo)管緩慢注射制備好的血栓3～5條后，經(jīng)導(dǎo)管推注生理鹽水10 mL，再進(jìn)行縫合。第一次注入血栓后2、4、8周，重復(fù)上述麻醉和實(shí)驗(yàn)步驟[15-16]。

2 大動(dòng)物的CTEPH模型

目前，已在大型動(dòng)物模型中進(jìn)行了多項(xiàng)CTEPH的病理生理學(xué)研究。對于豬、羊和犬使用了不同的栓塞方案和材料，包括空氣、自體血凝塊和葡聚糖凝膠珠等。這些模型中使用到的測量方法包括使用留置導(dǎo)管或Swan-Ganz導(dǎo)管測量PAP，以及使用Swan-Ganz導(dǎo)管、長期植入的流量探頭或通過超聲、心臟磁共振掃描或壓力-容積環(huán)路導(dǎo)管測量心輸出量和每搏量。壓力-容積環(huán)路導(dǎo)管還可測量右心室-肺動(dòng)脈耦合，測量右心室如何應(yīng)對增加的后負(fù)荷[17]。盡管栓塞后PAP急劇增加，很少有研究者在長期隨訪期間成功建立CTEPH模型[17]。理想情況下，自體血栓能誘導(dǎo)CTEPH，并模擬血栓釋放的潛在因子以及與血栓相互作用的細(xì)胞對這一過程的影響。然而，用自體血栓誘導(dǎo)CTEPH的研究很大一部分失敗了，這最初被歸因于動(dòng)物體內(nèi)存在比人類更活躍的纖溶系統(tǒng)[2，18]。因此應(yīng)用氨甲環(huán)酸抑制動(dòng)物體內(nèi)的纖溶系統(tǒng)就顯得尤為重要。研究發(fā)現(xiàn)，用氨甲環(huán)酸抑制纖溶系統(tǒng)并在犬體內(nèi)成功建立CTEPH模型[19]。描述CTEPH動(dòng)物模型的建成通常包括三個(gè)主要終點(diǎn)：(1)肺血流動(dòng)力學(xué)的功能評估；(2)右心室的功能評估；(3)肺血管疾病和右心室重塑的組織學(xué)和分子特征。在這方面，對于大動(dòng)物模型可使用臨床相關(guān)診斷工具進(jìn)行全面的評估，如右心導(dǎo)管插入術(shù)和先進(jìn)的成像技術(shù)，以及組織學(xué)和分子水平的表征，且便于對新的診斷工具以及新的治療策略進(jìn)行最佳評估。

2.1 豬的CTEPH模型

在目前的大量研究中，一種方法是通過對豬進(jìn)行左肺動(dòng)脈結(jié)扎和右下肺節(jié)段動(dòng)脈的進(jìn)行性栓塞，以模擬血栓栓塞引起的近端阻塞[20-23]。另一種方法是使用較小的微球來阻塞肺血管系統(tǒng)，通過比較注入微球的數(shù)量與肺血管床中存在的相同大小的血管分支的數(shù)量，可估計(jì)肺血管系統(tǒng)阻塞的相對數(shù)量。在這些研究中，PAP和肺動(dòng)脈阻力在栓塞過程中下降，但隨著時(shí)間的推移而緩慢但漸進(jìn)地增加，并在停止栓塞后仍然升高。有研究[24-26]表明，由于肺循環(huán)儲備較大，成功誘導(dǎo)CTEPH的先決條件包括重復(fù)栓塞操作要達(dá)到40%～60%的肺血管系統(tǒng)阻塞。在豬的體內(nèi)，盡管有大量的栓塞，但只有當(dāng)栓塞聯(lián)合慢性抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶時(shí)才會發(fā)生持續(xù)的CTEPH[22]，這也表明，CTEPH的發(fā)展有賴于內(nèi)皮功能障礙。這些發(fā)現(xiàn)與Rothman等[22]的一項(xiàng)研究一致，后者使用了大小類似的陶瓷珠，但未能在豬身上成功誘導(dǎo)持續(xù)的CTEPH。相反，當(dāng)在犬中使用類似的方案時(shí)，在未抑制內(nèi)皮型一氧化氮合酶的情況下成功誘導(dǎo)了CTEPH[13]。

豬體積大，且實(shí)驗(yàn)操作相對方便，對有創(chuàng)操作耐受性較好，其肺葉、肺小葉的分界以及肺動(dòng)脈的解剖與生理都與人類相似，因此為較理想和常用的大動(dòng)物模型。

2.2 犬的CTEPH模型

通常，會應(yīng)用自體血栓注射，聯(lián)合氨甲環(huán)酸抗纖溶系統(tǒng)建立犬的CTEPH模型，如唐春香等[27]在一項(xiàng)犬CTEPH模型及雙能計(jì)算機(jī)斷層掃描和單光子發(fā)射計(jì)算機(jī)斷層掃描的比較性研究中，采集犬15 mL新鮮血液制成的自體血栓經(jīng)右側(cè)股靜脈導(dǎo)管注入股靜脈，并于栓塞前及栓塞后l h分別行相應(yīng)的影像學(xué)檢查。術(shù)后連續(xù)3 d每餐喂食氨甲環(huán)酸(110 mg/kg)，抑制其自身纖溶系統(tǒng)。每隔2周重復(fù)穿刺、測量、栓塞、掃描、測壓及喂藥過程，直到PAP達(dá)到犬的肺動(dòng)脈高壓標(biāo)準(zhǔn)值(收縮壓>30 mm Hg，舒張壓>15 mm Hg，或肺動(dòng)脈平均壓>20 mm Hg)，然后處死動(dòng)物[27]。另一種常用方法是向犬的右頸靜脈注入陶瓷微珠，建立犬的CTEPH模型。通常使用的陶瓷微珠直徑為3 mm，而PAP和肺動(dòng)脈阻力在每次注射后1周內(nèi)?；謴?fù)正常，因此需在第一次栓塞后的第2、4、8周分別重復(fù)進(jìn)行栓塞，以維持PAP的穩(wěn)定上升[28]。而當(dāng)使用0.1～0.3 mm的微球時(shí)，需60 d的重復(fù)栓塞以增加PAP。60 d后，PAP出現(xiàn)穩(wěn)定升高，但無支氣管動(dòng)脈肥大、高流量血管病變或近端血管阻塞[29]。然而隨著疾病的進(jìn)展，當(dāng)肺毛細(xì)血管床損傷>50%時(shí)，靜息狀態(tài)下肺動(dòng)脈平均壓會>25 mm Hg。雖然犬性情兇猛，且實(shí)驗(yàn)成本較高，但犬的血管明顯易找，具有獨(dú)立的肺循環(huán)和體循環(huán)系統(tǒng)，能模擬研究機(jī)體對血栓的反應(yīng)，血流動(dòng)力學(xué)、凝血和纖溶系統(tǒng)的變化情況以及機(jī)體神經(jīng)體液及炎癥因子的變化等，同時(shí)也可用于評估常用的臨床影像學(xué)診斷方法[14，27]。

3 展望

雖然目前已進(jìn)行了多項(xiàng)CTEPH動(dòng)物模型相關(guān)的研究，但要建立完全模擬人類CTEPH的動(dòng)物模型仍較為困難，理想的CTEPH動(dòng)物模型需包括：血栓持續(xù)存在并伴肌化、肺動(dòng)脈高壓的持續(xù)存在、因血管內(nèi)血栓未溶解產(chǎn)生的慢性肺動(dòng)脈阻塞、非阻塞部位肺微小血管病變以及右心室結(jié)構(gòu)重建。在具體的實(shí)驗(yàn)研究中需根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康倪x擇適當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)動(dòng)物及相應(yīng)的建模方法，以便取得最佳的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。CTEPH動(dòng)物模型可廣泛用于描述CTEPH的發(fā)生和發(fā)展以及干預(yù)過程中可能存在的性別差異[30]，以及進(jìn)一步闡明心肺運(yùn)動(dòng)試驗(yàn)在慢性血栓栓塞性疾病和CTEPH患者中的重要性。未來，CTEPH動(dòng)物模型的應(yīng)用將更加廣泛，可在嚙齒類動(dòng)物或小動(dòng)物中進(jìn)行電生理學(xué)機(jī)制的研究，同時(shí)可在大動(dòng)物模型中進(jìn)行新型抗心律失常藥的研究[31](表2)。

表2 CTEPH相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)